HER2的标准化检测

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ST. GALLEN 2007
HER2：乳腺癌危险因素的新定义
低
G1 T≤2 ER/PR +
淋巴结HER2 LVI无
淋巴结-, HER2 +, ER/PR 或 LVI 侵润 淋巴结1-3且 HER2 -, ER/PR +
中
年龄<35岁 G2-3 T>2
R I S K
高
淋巴结 1-3 和 HER2 +, ER/PR 或 淋巴结 ≥4
• 乳腺癌初诊时需明确HER2 • HER2阳性即做为高风险因子加以考虑
预后评估
– 预后差
疗效预测
– 从赫赛汀®的治疗中最大获益
– 芳香化酶抑制剂的疗效优于三苯氧胺
– 蒽环类和Fra Baidu bibliotek杉类的疗效优于CMF
CMF, cyclophosphamide, methotrexate, 5-fluorouracil Goldhirsch et al 2005
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意义
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HER-2扩增的乳腺癌对蒽环类药物和紫杉醇类药物化 疗敏感性高 → HER2和拓扑异构酶II-a基因同时扩 增的乳腺癌患者，可以从蒽环类药物为基础的方案 中受益，故同时检测HER2和拓扑异构酶II-a可以筛 选出以蒽环类化疗药为基础的化疗方案候选患者
HER-2扩增的乳腺癌对三苯氧胺易产生耐药性 → 制 定内分泌治疗方案的有力依据 HER-2扩增的乳腺癌无病生存率和总生存率低，并且 与淋巴结阳性、癌的高级别、阴性受体状态及高增 殖活性有关 → 预后判断的参考指标
Gene amplification due to multiple copies of chr. 17 (Aneuploidy)
True Gene amplification
评价17号染色体数目和意义
• HER2基因位于17号染色体上，大约有47%的乳腺癌存在 17号染色体非整体性，即17号染色体不是正常的二体， 而是单体或多体。 • 绿色探针可以将17号染色体的非整体性和单纯的HER2 基因扩增，尤其是低水平的扩增区分开。 • 当HER2基因与17号染色体数目比值大于2时，即为HER2 基因扩增。 • 加入了这个内对照，就排除了单色探针(探针中仅有 HER2基因)可能造成的假阴性(17号染色体单体)或假阳 性(17号染色体多体)。 • 临床研究显示，具有这类遗传学特征的患者对治疗的 反应和预后与单纯的基因扩增明显不同。
HER2 受体跨膜二聚体的信号传导途径
生长因子（配体）
接合部 细胞膜 信号传导 至细胞核 酪氨酸激酶 活性部分
细胞浆
细胞核
癌基因活化
细胞分裂
HER2过度表达：正常状态的10-100倍
正常
细胞质
扩增/过度表达
3
C
B A
细胞核
2 1 4
细胞膜 1 = 基因拷贝数 2 = mRNA 转录 3 = 细胞表面受体蛋白表达 4 = 细胞外受体功能域释放
● 癌细胞表面存在着CerbB-2蛋白， 受刺激后促进癌细胞的增殖
刺激
増殖
がん細胞
● 20～30％的癌细胞
Heceptin：一种针对Her-2/neu
受体的高纯度重组DNA衍生物的人源化 单克隆抗体，是乳腺癌治疗领域的第一 个分子靶向性药物，具有高效、低毒、 选择性强的特点
● 与CerbB-2结合阻断和抑制细胞的增殖 ● 转移性乳腺癌病人的治疗效果 ● 检测癌细胞表面cerbB-2存在程度决定使用
HER2 gene
HER2 gene
HER2 gene
双链靶基因
变性的单链DNA
与荧光标记探针复 性\产生荧光信号
HER2探针
• 绝大部分是同时含有HER2基因(标记为橘红 色荧光)和该基因所在的17号染色体着丝粒 (标记为绿色荧光)序列的混合探针 • 经美国FDA批准的进口探针 VS 国产探针
Probe for cent. 17 Probe for Her-2/neu
抗原修复 有/无
组织固定 方法
变异性
抗体选择
评分标准
福尔马林固定/石蜡包埋组织
HER 基因扩增2－5倍 （Southern Hybridization）
HER2 “阴性” 是由于组织固定后抗原被遮蔽 需要行抗原修复来纠正
Courtesy Michael Press
Slamon et al, Science 244:712, 1989
• 随着肿瘤的靶向性治疗的发展，以单抗 为主的分子靶点药物的不断研制应用， 已成为肿瘤靶向治疗的新武器 • Herceptin即为一种针对HER2受体的高纯 度重组DNA衍生物的人源化单克隆抗体， 是乳腺癌治疗领域的第一个分子靶向性 药物
刺激
HER2
タンパク
Her-2/neu基因的蛋白 CerbB-2
HER2 阴性患者平均风险曲线 0.1 基础风险曲线 0 0 20 40 月 60 80 100
p=0.0001 Cumulative disease recurrence curves
Sun JM. Cancer 2004;101:2516–22
HER2 表达在原发肿瘤和转移灶呈高度一致
Study Percentage IHC overexpression Primary tumours Masood & Bui (2000) Shimizu et al (2000) Simon et al (2001) Tanner et al (2001) Gancberg et al (2002) Vincent-Salomon et al (2002) Tsutsui et al (2002) Carlsson et al (2004) 32% Metastases 32%
HER2测定流程图
HER2的检测方法
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HER2阳性定义
=
=
质量控制
• 内对照：杂交的组织、细胞中有75%的细胞 核显示出双色信号时，视为实验成功，并 且红、绿信号互为对照，癌与非癌细胞互 为对照。 • 外对照：应选择FISH阳性和阴性的标本片。
结果判读
杂交信号计数 • 应选择细胞核大小一致、核的边界完整、二脒基苯基吲哚(DAPI) 染色均一、细胞核孤立无重叠、绿色着丝粒信号清晰的细胞。 • 随机计数20～30个癌细胞核中的双色信号。 判读标准 • 红色信号的总数与绿色信号的总数比值>2.2时，即为HER2基因扩 增 • 若红、绿两信号的比值>20或众多信号连接成簇时可不计算，即 视为基因扩增； • 若比值介于1.8～2.2之间，则需要再计数20个细胞核中的信号或 由另外一个分析者重新计数。如仍为临界值，则应在FISH检测报 告中注明。 • 若HER2基因扩增在不同癌细胞中存在异质性时，应在另一癌区域 再计算20～30个癌细胞核中的红、绿信号值，报告其最大值，并 加以注释。 • 注意避免G2期细胞内的基因拷贝数目特征(4个拷贝)可能导致的 计数误差。
Heceptin的作用
刺激
Heceptin
刺激 HER2
タンパク
増殖抑制
癌细胞
意义
• 靶向药物Heceptin仅对HER2扩增的乳腺癌有效 →准确的检测HER2有无扩增是临床应用Heceptin的绝 对必要条件，也是成功进行靶向治疗的前题和关键 HER-2扩增的乳腺癌往往提示其恶性程度高，进展迅 速，化疗缓解期短，对CMF方案化疗反应降低 → 乳 腺癌化疗药物环磷酰胺、阿酶素、5－氟尿嘧啶等 的主要参考指标
FISH
• 是一种分子细胞遗传学技术，通过荧光标 记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交。 在荧光显微镜下，于细胞和(或)组织原位 观察并分析细胞核内杂交于DNA靶序列的多 种彩色探针信号，以获得细胞内多条染色 体(或染色体片段)或多种基因状态的信息。 • “金标准”
荧光原位杂交法原理 Fluorescence in situ Hybridisation (FISH)
• 0 (阴性): 无染色, 或 <10% 的膜染色 • 1+ (阴性): >10%的细胞膜微弱的 或不完 整的膜染色 • 2+ (弱阳性): >10% 细胞弱到中等膜染色 • 3+ (强阳性): >10%中等到强的完整的膜 > 30% 染色
0
1+
2+
3+
C-erbB2
2008/12/12
HER-2 检测: IHC
HER2阳性患者的生存期比阴性者缩短一半以上
转移性乳腺癌患者的中位生存期
HER2 阳性
8-10个月
HER2 阴性
17-22个月
Slamon DJ et al. Science 1987;235:177–82
2004年发现淋巴结阴性患者预后与HER2状态密切相关
0.3
HER2阳性患者平均风险曲线
0.2
乳腺癌HER2的标准化检测
HER2基因
HER2，又名HER2/neu，c-erbB-2，表皮生长 因子受体（EGFR）家族成员； 原癌基因，位于17q21，编码相对分子量 185KD的跨膜糖蛋白（跨膜酪氨酸激酶受体， 表皮生长因子样分子），在细胞表面表达； 通过参与信号传道通路的一系列活动影响细 胞的增殖与分化。
IHC结果判断
• 先在10×物镜下进行判读 • 注意细胞膜完全着色的癌细胞比例及着色 强度 • 胞质着色应忽略不计 • 导管内癌(DCIS)的着色应忽略不计，只评 定浸润癌的着色情况 • 正常乳腺上皮不应着色 • 应使用美国FDA批准的HercepTest评分系统
ASCO/CAP ：C-erbB2 IHC的评分
R I S K
2007 NCCN 治疗指南 －HER2检测的原则
ASCO/CAP: HER2检测指南
• HER2阳性： IHC HER2 3+ (完整的，强的膜阳 性> 30%) 或 FISH HER2 基因扩增 (HER2/ CEP17 > 2.2 或 HER2 基因拷贝数 > 6 信号/核， 无内对照的探针) • HER2阴性： IHC HER2 0-1+ 或 FISH HER2 基 因扩增 (HER2/ CEP17 < 1.8 或 HER2基因拷贝 数 < 4 信号/核，无内对照的探针) • 不能确定：IHC HER2 2+ 或 FISH HER2 基因扩 增 (HER2/ CEP17 1.8-2.2 或 HER2基因拷贝数 4-6 信号/核，无内对照的探针)
A = HER2 DNA B = HER2 mRNA C = HER2 receptor protein
HER2癌基因的致瘤机制：
• 抑制凋亡，促进增殖；增加肿瘤细胞的侵袭 力；促进肿瘤血管新生和淋巴管新生。 研究表明： • 30％以上的人类肿瘤中存在HER2基因的扩增/ 过度表达（如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜 癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌等; • 20％－30％的原发性浸润性乳腺癌有HER2基 因的扩增/过度表达。
38%
25% 28%
38%
22% 28%
29%
25% 25% 55%
27%*
20%** 25% 55%
*Mainly distant metastases. **Liver and lung metastases. Lymph node metastases were analysed in all cases, except in the studies by Vincent-Salomon et al (2002) and Gancberg et al (2002), where distant metastases were analysed.
2005年St. Gallen国际治疗指南 乳腺癌危险度分级
低度 中度 高度 +(1～3)1 +(﹥ 3)2
－1
淋巴结
pT（cm） 病理分级 瘤周脉管 HER2 年龄
－
≤2 1
+(1～3)2 伴 ﹥ 21
或 2 ～ 31 或 +1 或 +1
－
－
≥35
－
2
+1
或＜351
2005 St Gallen 指南
IHC 3+ 蛋白过度表达
或
CISH +
或
FISH +
基因扩增
免疫组织化学法原理 Immunohistochemistry (IHC)
一抗结合于Her-2受体
二抗结合并激活底物反应显色
IHC
• 检测HER2表达初筛最常使用的方法。 • 判断HER2蛋白过表达最重要的是染色方法 的标准化和结果的判断。 • 建议使用美国食品和药品管理局(FDA)批准 的试剂盒。 • 应使用EnVision法和高质量的DAB显色液以 避免内源性生物素的影响。 • 应有严格的、包括内部和外部的质量控制， 须设阳性对照、阴性对照和空白对照。