单细胞这么火，还不快来分一杯羹！11+肿瘤单细胞测序的生信思路帮你解决发文难题！

单细胞这么火，还不快来分一杯羹！11+肿瘤单细胞测序的生

信思路帮你解决发文难题！

导语

今天给同学们分享一篇关于单细胞景观揭示胃癌肿瘤微环境中的活性细胞亚型及其相互作用的生信文章“ Single-cell landscape reveals active cell subtypes and their interaction in the tumor microenvironment of gastric cancer ”，这篇文章于2022年5月发表在 Theranostics 杂志上，影响因子=11.556。在这项研究中，该单细胞图谱提供了从分子水平了解胃癌细胞异质性的信息，并将成为开发创新的早期和伴随诊断以及发现胃癌新靶向治疗的宝贵资源。

1. 单细胞RNA-seq确定胃癌的七种主要细胞类型

作者收集了9例未经治疗的非转移性胃癌患者的新鲜肿瘤样本和邻近非肿瘤样本，其中6名患者患有近端胃癌（标记为P01-P06），3名患者患有远端胃癌（标记为D01-D03）。进行生信分析后共获得47304个细胞，可检测到200多个基因的表达，可以使用基于图的聚类获得17个细胞簇（图1B）。基于典型标记基因的表达和这些簇顶部不同表达的基因，研究将这些簇分为七种主要细胞类型，包括T细胞和NK细胞（6簇）、B细胞（2簇）、髓样细胞（2簇）、肥大细胞（1簇）、成纤维细胞（3簇）、内皮细胞（1簇）、上皮细胞和恶性细胞（3簇）。

图1 胃癌及邻近非恶性标本的单细胞RNA-seq

2. 胃癌中调节性T细胞的显著扩增

接下来，作者对T细胞和NK细胞进行重新分类，确定了14个不同的簇（图2A）。基于典型标记基因的表达和每个簇的差异表达基因（图2B），研究将这些簇注释为调节性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤细胞和固有淋巴细胞（ILC）。对于CD4+细胞簇，T01被表征为具有CCR7特异性表达的天然CD4+T细胞。根据特异性表达的CXCL13，T04被归类为滤泡帮助T细胞，并且该簇增加了PDCD1和TIGIT的表达，表明处于耗尽状态。事实上，Treg信号基因在肿瘤样本中表现出一致的高表达（图2D）。与正常Treg相比，肿瘤Treg增加了与免疫抑制相关的多个基因的表达，包括DUSP4、IL2RA、TNFRSF4、LAYN和LGALS1（图2E）。肿瘤中Treg含量的增加，以及这些基因和通路的表达上调（图2F），这表明胃癌微环境的免疫抑制性质。

图2 胃癌中T细胞和NK细胞的分布

3. 在胃癌中未发现典型的耗尽性CD8+T细胞簇

作者分析了CD8+T细胞的两个主要簇（T05和T06）（图2A）。T05被鉴定为具有GZMK高表达和一组细胞毒性基因的效应记忆CD8+T细胞（TEM）。根据KLRC1和ITGA1/CD103的表达增加，

T06被归类为组织驻留记忆T细胞（TRM）。有趣的是，在数据集中没有发现典型的耗尽型CD8+T细胞簇，这种细胞簇在各种肿瘤类型中经常被检测到（图2B）。

4.在胃癌中鉴定肿瘤特异性LAMP3+DC细胞

作者重新构建骨髓细胞簇并确定了15个簇（图3A），之后作者基于S100A8、S100A9和FCN1在这些簇中的高表达，M01-M03被鉴定为单核细胞（图3B-C）。M04-M07是基于低表达CD14和高表达HLA-DR基因的树突状细胞（图3B-C）。由于这些簇中CD68、CD163和MRC1的高表达，M08-M11因此被鉴定为巨噬细胞（图3B-C），其余三个未分类簇（M12、M13和M15）可能来自低质量细胞或双细胞。

另外，M04高表达CD1C、FCER1A和CLEC10A对应cDC2（图3C），M05高表达CLEC9A代表cDC1(图3C)，M07通过LILRA4的特异表达被鉴定为浆细胞样DC（pDC），但是作者注意到高表达LAMP3、CCL22和CCL19的M06与任何经典DC亚型均无联系（图3C）。与肿瘤和正常样本共享的前三种经典DC亚型不同，M06中几乎所有细胞都来自肿瘤样本，这表明了LAMP3+DC亚群在肿瘤样本中高度富集（图3D）。在TCGA数据集中的胃癌样本中，LAMP3+DC的特征基因的平均表达也高得多（图3E）。最后，为了探索胃癌中LAMP3+DC的起源，首先构建了髓系簇的树状图，发现LAMP3+DC与cDC1和cDC2聚集在一起（图3F），其次，对这三个亚群的轨迹生信分析表明，LAMP3+DC可能是由胃癌中的cDC2和cDC1发展而来的（图3G），单细胞调节网络推断和聚类生信分析表明，IRF1、IRF2、NFKB1和NFKB2的活性在LMAP3+DC中上调，这表明IRF家族和NF-kB是DC分化和成熟的关键调节因子。

图3 胃癌骨髓细胞的异质性

5. 胃癌中巨噬细胞的异质性

M09和M10是两簇C1QC+巨噬细胞，其特征是多个C1Q基因和抗原呈递基因的高表达（图3B）。M11具有多种干扰素诱导基因的高表达，例如ISG15、IFIT2和IFIT3（图3C）。在这四个巨噬细胞簇

中，M08在肿瘤样本中显著富集（图3D），因此被指定为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）。巨噬细胞通常分为促炎M1类和抗炎M2类，作者为了测试此处确定的巨噬细胞亚群是否符合经典M1/M2模型，评估了这些巨噬细胞亚型的M1和M2特征的表达，生信分析结果显示，INHBA+簇（M08）和ISG15+簇（M11）表现出更高的M1特征，而C1QC+簇（M9和M10）表现出更高的M2特征（图4A），这表明胃癌中巨噬细胞的体内极化不能用M1/M2模型来解释。在比较TAMs和C1QC+巨噬细胞的基因表达水平时，在INHBA+巨噬细胞中识别出49个上调基因，包括多种趋化因子，IL6，PTGS2，IL1RN和TIMP1（图4B）。在树状图中，INHBA+TAM和单核细胞位于单个分支中，这意味着该簇可能起源于肿瘤区域的浸润单核细胞（图4D），并且免疫浸润生信分析表明，在INHBA+TAM中，多种转录因子的活性特异性上调，包括RELB、NFKB1、NFKB2等。