肠道病毒71型疫苗的研发现状及进展

肠道病毒71型疫苗的研发现状及进展（2012年12月20日）肠道病毒71 型（Enterovirus 71，EV71）是手足口病（Hand foot mouth disease，HFMD）的主要病原体。

近年来，HFMD 在中国已有多次暴发流行，主要感染人群为5 岁以下的婴幼儿，给公众健康带来了严重威胁。

目前尚无有效的防控手段，研制疫苗成为控制HFMD 流行的唯一有效措施。

本文就EV71 疫苗研发的必要性、可行性、研发的难点及研发进展作一综述。

1. EV71 疫苗研发的必要性1. 1 EV71 感染引起HFMD 流行的严重性：自1969年最早在美国分离出EV71 以来，相继在澳大利亚、日本、巴西、荷兰、马来西亚、中国台湾［1-8］等国家或地区报道了EV71 感染引起的HFMD 流行。

大量研究均表明，EV71 感染为导致严重及死亡HFMD 病例的主要病原体，而其他常见的肠病毒血清型如CA16、CA4、CA10、CB3 和CA6 等引起的HFMD床症状较轻。

1998 年，中国台湾共发生129 106 例HFMD，其中严重病例405 例，死亡78 例；其后在2000 年发生严重病例291 例，死亡41 例；2002 年发生严重病例389 例，死亡55 例［9］。

我国大陆地区近几年HFMD 呈持续流行态势：2008 年，安徽、山东等地区共报告病例数489 073 例，其中重症1 165 例，占报告病例总数的0. 24％，病死126 例，病死率为0. 03％；2009 年，河南、安徽、山东等地HFMD 仍呈高流行态势，全年大陆地区共报告病例数1 155 603 例，重症病例14 214 例，占1. 23％，病死354 例，病死率为0. 03％，其中5 岁以下儿童占死亡病例的93. 09％。

2010 年1 ～4 月间，已报告HFMD 发病数427 278例，其中死亡260 例，均呈明显升高趋势。

根据中国疾病预防控制中心的研究，HFMD 重症病例中81. 59％、死亡病例中96. 43％是由EV71 引起的。

目前，在我国发生的HFMD 中，EV71 与CA16 感染呈交替或共同流行趋势。

2007 北京市报告的8 起HFMD 疫情中，6 起由CA16 引起，2 起为EV71 感染［10］。

目前，HFMD 的流行已成为我国大陆、台湾地区以及东南亚国家的重大公共卫生问题之一，造成了巨大的社会负担。

1. 2 疫苗接种是控制HFMD 流行特别是严重和死亡病例发生率的唯一有效手段：HFMD 的传播途径除主要的粪-口传播外，可能还存在呼吸道飞沫传播等其他途径。

中国台湾的研究认为，低龄、2 个以上儿童家庭、居住在农村等为HFMD 的主要危险因素［11］。

目前，针对HFMD 疫情常采取常规的隔离传染源、切断传播途径的预防措施，但往往难以控制该病的流行。

由于感染人群主要为儿童，特别是危重病例起病急、病程进展迅速、病死率高及预后可能产生神经系统发育迟缓以及认知功能减退等后遗症等，危害十分严重，易引起社会的恐慌。

在临床上由于对HFMD 的发病机制尚无明确认识，目前尚无有效的治疗药物和手段，因此，研制安全、有效的HFMD 疫苗（EV71 疫苗和／或CA16 疫苗）已成为防控HFMD、降低严重病例和死亡病例发生率的关键。

2. EV71 疫苗研发的可行性2. 1 人群感染后产生的EV71 中和抗体可有效预防EV71 的再次感染：对HFMD 发病人群的血清流行病学调查资料显示，人群感染后产生的EV71 中和抗体可有效预防EV71 的再次感染。

EV71 中和抗体水平与发病率特别是严重病例和死亡病例发生率成反比，即抗体水平低的人群（3 岁以下）发病率和死亡率均较高。

人群中EV71 中和抗体阳性率在1 岁前水平低（＜20％），2 ～3 岁时迅速升高（60％～80％），并维持至15 岁左右，其后阳性率和抗体滴度下降，成人的抗体阳性率约为50％［12-13］。

中国台湾对HFMD 流行前后人群抗体水平的检测结果表明，婴幼儿严重病例和死亡病例数与流行前EV71 中和抗体阳性率成反比。

流行后发病最多的年龄组（3 岁以下）保护性抗体阳性率明显升高［14］。

母传抗体可保护婴儿免受EV71 感染，但研究表明，EV71 母传抗体下降迅速，2 月龄时抗体阳性率约为50％；6 ～7 月龄时传抗体基本消失，与临床上3 月龄后即有HFMD 发生的报道基本一致［15］。

2. 2 EV71 疫苗免疫动物诱导的EV71 中和抗体的动物实验保护效果：大量研究表明，EV71 感染或疫苗免疫动物后产生的抗体具有病毒中和活性［16-19］；中和抗体在体外与EV71 中和后，可减少或消除毒株攻击乳鼠后的致病性；在应用致死剂量毒株攻击乳鼠后的不同时间内被动免疫EV71 中和抗体，免疫剂量不同，可使乳鼠获得不同的保护效果［19-20］；EV71 疫苗免疫母鼠后，母传抗体可对经毒株攻击的乳鼠具有一定的保护作用［16，19］；EV71 疫苗免疫动物后产生的抗体水平可达到甚至超过恢复期患者的抗体水平。

上述研究提供了EV71 候选疫苗免疫原性和免疫效果的依据，为EV71 疫苗的研发成功奠定了一定的基础。

2. 3 人血浆中EV71 中和抗体的动物实验保护效果：研究表明，人血浆中含有的中和抗体可在细胞基质上中和不同的EV71。

人血浆中一定效价的EV71中和抗体在动物体外与毒株中和后，可减少或消除毒株攻击乳鼠后的致病及死亡现象，而在毒株攻击乳鼠的同时或其后限定的时间内注射含EV71 中和抗体的人血浆，可起到保护乳鼠的作用［20］；有文献报道，静脉注射含有一定EV71 中和抗体的免疫球蛋白用于治疗EV71 感染引起的神经系统症状和肺水肿，结果EV71 感染的肺水肿患者血浆中细胞因子IFN γ、IL-6、IL-8、IL-10 和IL-13 水平显著下降，而自主神经系统（Autonomic nervous system，ANS）功能失调的患者血浆中细胞因子IL-6 和IL-8 水平显著下降，表明其具有一定的临床治疗意义［21］。

2. 4 细胞免疫的保护作用：EV71 疫苗除能诱导中和抗体外，还能诱导细胞免疫应答，其也具有免疫保护作用，VLP 疫苗免疫小鼠的脾细胞体外刺激可产生高水平的IFNγ、IL-2 和IL-4［16］。

在VP1 区域发现了细胞免疫表位位点，在VP2、VP3 区域也存在数个细胞免疫表位，望通过免疫记忆发挥抗病毒再次感染的作用。

在疫苗的研发中，疫苗诱导细胞免疫应答的保护作用和免疫毒性的影响越来越受到人们的重视，但目前EV71 疫苗诱导细胞免疫的机制和作用均有待进一步研究。

2. 5 其他肠道病毒疫苗的研发经验：在制备EV71疫苗所采用的细胞基质、疫苗质量控制以及疫苗配伍等方面均有可借鉴的其他成熟肠道病毒疫苗的经验，为我国EV71 疫苗的研发以及工业化生产奠定了坚实的基础。

2. 6 政府的支持和协调作用：我国政府高度重视HFMD 的防控工作，为加快EV71 疫苗的研制，在国家科技支撑项目中，设立了“EV71 疫苗研制”专项予以资助，组织相关单位进行研究，并形成了疫苗研发、质量管理和质量控制、应用单位密切协作的机制，解决在疫苗研发过程中出现的技术问题，为EV71疫苗的研制提供了保障。

3. EV71 疫苗研发的难点3. 1 相关基础和临床研究不足：目前对EV71 病原学、病毒的感染及致病机制等均缺乏了解。

不同基因型、不同亚型、同一亚型不同来源病毒株的抗原性和免疫原性可能存在差异，需对不同毒株的交叉保护水平进行系统的比对研究；在致病机制方面，EV71感染引起的HFMD 已流行多年，而近年来出现了暴发的态势和众多的严重病例及高病死率，其原因尚不明确。

目前尚未发现近年流行的毒株基因序列上疑似毒力位点与往年流行毒株存在差别，尚不明确毒株是否出现了毒力增强的趋势。

也不了解隐性感染者的传染性如何以及EV71 无症状感染者是否可排毒引起接触者感染，同时，临床患者开始排毒的时间以及排毒持续的时间均有待研究。

3. 2 缺乏系统分子和血清流行病学资料：目前认为EV71 仅有1 个血清型，有11 个基因型或亚型（A、B1 ～B5、C1 ～C5）。

EV71 在流行过程中易发生变异，除中国大陆地区外，中国台湾地区以及其他国家或地区近年流行的EV71 基因型和亚型均发生了改变，对疫苗的研发及应用提出了挑战。

目前，需结合疾病监测体系，阐明我国EV71 基因型的流行和转归趋势，获得不同年龄人群血清中和抗体分布的规律以及发病前后抗体的转归状况，为疫苗毒株的选择、疫苗免疫目标人群和免疫程序的确定提供依据。

3. 3 缺乏成熟的疫苗抗原和抗体诊断试剂：EV71疫苗的质量控制中，需定量测定抗原活性和抗体效价，由于目前国内尚无批准上市的抗原、抗体（酶标或化学发光）试剂，研发单位多自行开发抗原、抗体诊断试剂［22-24］。

由于疫苗研发单位对所制备试剂的验证水平参差不齐，组成试剂的主要原材料如单克隆抗体等各不相同，不清楚其与不同毒株制备的抗原的反应性，各种试剂间的特异性和灵敏度等指标缺乏可比性等原因，影响了对疫苗活性的评价。

另外，需对传统中和抗体检测方法进行规范，建立国家标准品，保证中和抗体效价测定的准确性和可比性。

3. 4 缺少适宜的动物模型：EV71 疫苗研制的障碍之一是缺少适宜的动物模型，如无研究EV71 和CA16导致HFMD 的可靠的动物模型，缺少研究EV71 神经毒力的动物模型。

EV71 仅能感染出生1 ～7 d 内的乳鼠，且需要具有乳鼠适应性突变［25-26］，并可能与临床研究不相关。

猕猴虽然对EV71 易感，可通过皮下或脊髓接种等方式感染，但因发病不典型以及成本较高而受到限制。

可喜的是，近期EV71 的受体研究取得了突破［27］，为构建受体转基因动物模型奠定了基础。

3. 5 疫苗的创新性：目前，EV71 疫苗的研究在世界范围内尚未取得突破。

作为我国自主研发的一类新药，在疫苗的安全性和有效性方面需进行深入、系统的研究，提供科学、充分的有效性、安全性和质量可控的材料。

该疫苗的研发除应按照我国《疫苗临床前研究指导原则》、《中国药典》、GLP 等法规文件的要求执行外，还应考虑参考WHO、美国FDA、欧盟等对疫苗临床前研究的相关要求。

目前，由于我国疫苗企业与欧美疫苗企业在创新能力、研发投入力度以及企业规模等方面均存在差距，难以完全具备解决EV71 疫苗研发中所涉及的相关基础、临床、流行病学、动物模型及保护机制等方面技术难点的能力，需在国家有关部门的积极扶持、指导和帮助下，开展跨学科协作、联合攻关，解决疫苗研发中的关键问题。

4. HFMD 疫苗的研发进展自我国台湾地区1998 年HFMD 大流行后，该地区以及新加坡等国家或地区先后开始进行相关疫苗的研究。