taqman探针原理
taqman荧光探针的原理
taqman荧光探针的原理TaqMan荧光探针是一种常用于实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）的探针。
其原理基于PCR扩增过程中的特定核酸序列的扩增和荧光信号的检测。
TaqMan荧光探针由三个部分组成：1. 引物（primers）：引物是设计用于扩增待测核酸序列的短小DNA 片段，通常有两个引物，一个用于扩增待测序列的起始位点，另一个用于扩增终止位点。
2. 探针（probe）：探针是一个含有荧光染料和一个对荧光染料发出信号具有抑制作用的化学修饰的短小DNA片段。
探针的序列与待测核酸序列的中间部分完全匹配。
3. Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）：Taq DNA聚合酶是一种热稳定的DNA聚合酶，能够在PCR反应中扩增DNA序列。
TaqMan荧光探针的工作原理如下：1. 引物与Taq DNA聚合酶一起作用，将待测核酸序列进行扩增。
引物会识别并结合到待测序列的起始位点和终止位点，Taq DNA聚合酶会沿着待测序列进行DNA合成，生成大量的扩增产物。
2. 在PCR反应中，TaqMan探针与待测序列中间部分的完全匹配，探针的5'端和3'端分别连接着两种不同的荧光染料（通常是荧光发射染料和荧光供体染料）。
3. 在PCR反应过程中，当Taq DNA聚合酶在扩增过程中到达探针的位置时，它会剪切探针，将发射染料和供体染料分离，导致荧光信号的释放。
4. 荧光信号可以通过实时荧光PCR仪器进行实时检测和记录。
荧光信号的强度与PCR反应中扩增产物的数量成正比，从而可以定量测量待测核酸的起始量。
TaqMan荧光探针的原理可实现高度特异性和灵敏度的实时定量PCR 分析，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因突变分析等领域。
希望以上解释对您有所帮助。
如有任何进一步的问题，请随时提问。
taqman-arms方法原理
taqman-arms方法原理
TaqMan-ARMS（Amplification Refractory Mutation System）方法是一种用于检测单核苷酸多态性（SNP）的分子生物学技术。
该方法利用引物的特异性来鉴定DNA中的特定碱基。
下面我将从多个角度来解释TaqMan-ARMS方法的原理。
首先，TaqMan-ARMS方法的原理基于引物的特异性。
在该方法中，设计两个引物，一个是特异性引物，用于识别目标SNP的突变位点，另一个是通用引物，用于扩增DNA片段。
这两个引物的设计使得只有在目标SNP的特定碱基与引物配对时，才能进行扩增。
其次，TaqMan-ARMS方法利用引物的特异性来进行扩增。
在PCR 反应中，如果样品中存在与特异性引物配对的目标SNP，那么特异性引物将与目标DNA结合，并促使DNA的扩增。
而如果样品中不存在目标SNP，特异性引物将无法结合，因此不会发生扩增。
此外，TaqMan-ARMS方法还利用荧光探针来检测扩增产物。
在PCR反应中，引物的扩增会产生荧光信号，该信号可以通过荧光探针检测系统来实时监测。
通过监测荧光信号的强度，可以确定样品中是否存在目标SNP。
总的来说，TaqMan-ARMS方法的原理基于引物的特异性识别和
扩增，以及荧光探针的实时监测。
通过这种方法，可以高效、准确
地检测样品中的SNP，具有广泛的应用前景，特别适用于基因分型、疾病相关基因的研究和临床诊断等领域。
希望这些信息能够帮助你
更全面地理解TaqMan-ARMS方法的原理。
taqman探针工作原理
taqman探针工作原理
TaqMan探针是一种常用于实时荧光定量PCR的探针。
它的工作原理基于PCR过程中的DNA合成和降解。
TaqMan探针由两个部分组成：一个荧光染料（通常是荧光标记的探针）和一个质子酶（也称为引物）。
这两个部分之间有一个特殊设计的序列，被称为探针的引物序列。
在PCR反应中，当温度升高到合适的退火温度时，Taq DNA 聚合酶会开始合成新的DNA链。
同时，TaqMan探针的引物会与待测DNA序列上的目标区域特异性结合，并被Taq DNA 聚合酶所识别。
在DNA合成过程中，Taq DNA聚合酶会解读引物的序列，并在其5'端的3'端延伸时释放出荧光染料。
当荧光染料释放后，它的荧光信号将被检测仪器记录下来。
此时，PCR反应会不断进行，荧光信号会随着PCR循环的增加而累积。
通过监测荧光信号的强度和周期数，我们可以确定样品中待测DNA的起始量。
由于TaqMan探针的设计是特异性的，只有当引物与目标DNA序列完全匹配时，才会发生荧光信号的释放。
这使得TaqMan探针在实时PCR中具有高度的特异性和准确性。
总之，TaqMan探针通过监测PCR反应中荧光信号的释放来实现DNA定量，是一种可靠、灵敏且广泛应用于分子生物学研究的技术。
taqman探针原理
taqman探针原理TaqMan探针原理。
TaqMan探针是一种用于实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）的探针，它以其高度特异性和灵敏度而闻名。
在实时PCR中，TaqMan探针可以用来检测和定量特定DNA序列的存在，因此在分子生物学和遗传学研究中得到了广泛的应用。
TaqMan探针的原理基于PCR技术，PCR是一种能够扩增特定DNA片段的方法。
在PCR过程中，DNA片段会被不断复制，从而使得起始数量极少的DNA片段得以扩增至足够数量，以便进行后续的分析。
而TaqMan探针则在PCR的基础上，增加了一种荧光信号检测的方法，使得扩增过程可以实时监测和定量。
TaqMan探针由三部分组成，引物（primers）、探针（probe）和荧光染料。
引物是用于引导PCR反应的两个短的DNA片段，它们会结合到目标DNA序列的两端，并作为PCR反应的起始点。
探针是一段含有荧光标记和荧光信号猝灭子（quencher）的DNA片段，它设计为与目标DNA序列的中间部分互补。
在探针未被降解之前，荧光信号被猝灭子吸收，因此不会被探测到。
当PCR反应进行到一定程度时，引物会引导DNA聚合酶复制探针所在的DNA序列，当DNA聚合酶到达探针时，会降解探针，使得荧光信号被释放出来。
荧光信号的强度与PCR反应中目标DNA的数量成正比，因此可以用来实时监测PCR反应的进程。
TaqMan探针的设计需要考虑到多个因素，包括探针的长度、引物和探针的互补性、探针的荧光标记和猝灭子的选择等。
合理的探针设计可以提高PCR反应的特异性和灵敏度，因此在实际应用中需要进行严格的设计和验证。
总的来说，TaqMan探针原理是基于PCR技术的实时荧光定量PCR方法。
通过引物和探针的设计，以及荧光信号的监测，TaqMan探针可以实现对特定DNA序列的快速、特异性和定量检测。
在分子生物学研究、临床诊断和药物研发等领域，TaqMan探针都发挥着重要的作用，为科学研究和医学应用提供了强大的工具。
taqman探针原理
taqman探针原理
Taqman探针是一种基于荧光的实时聚合酶链反应（real-time PCR）技术中常用的探针。
它通过结合于扩增DNA序列的内部区域并在聚合酶链反应过程中进行降解来测量DNA扩增的数量。
Taqman探针主要由一个与目标DNA序列互补的引物和一个含有荧光染料和淬灭染料的荧光探针构成。
在PCR反应开始时，聚合酶链反应体系中存在的引物和Taq DNA聚合酶开始扩增DNA的目标序列。
同时，Taqman探针也与目标序列的内部互补区域结合。
这个内部区域一般位于引物之间，并且特异性地结合于目标序列上。
在DNA扩增的过程中，Taq DNA聚合酶逐渐移动，并且在目标序列的内部区域进行脱氧核苷酸的合成。
这导致Taqman探针在聚合酶链反应的过程中被切割，并将荧光染料和淬灭染料分离开来。
在扩增过程中，荧光染料被释放出来，并且可以被特定荧光探针识别和检测。
一旦有荧光信号的释放，荧光探针就会与其结合，产生荧光信号的峰值。
这使得实时PCR仪器可以测量DNA扩增的数量，从而确定初始样本中目标DNA的量。
Taqman探针的优势在于其高特异性和灵敏度。
由于荧光探针是特异性地与目标序列结合，可以避免假阳性信号的产生。
此外，实时PCR技术可以在PCR反应过程中进行数据收集，使得结果可以实时监测和分析。
总而言之，Taqman探针是一种基于荧光的实时PCR技术中常
用的探针，通过结合于目标序列的内部区域并在PCR反应过
程中降解来测量DNA扩增的数量。
它具有高特异性和灵敏度，并且可以实时监测和分析扩增过程。
taqman荧光定量pcr基本原理
taqman荧光定量pcr基本原理
TaqMan荧光定量PCR是指采用荧光标记的PCR技术，它可以实现对特定序列DNA的定量分析，即可以直接测量所检测序列在模板文库中的相对浓度。
TaqMan荧光定量PCR可以说是一种双通道的实时PCR技术，最初由PE Applied Biosystems（PE）推出。
它是通过特定的标记技术，开发了FRET和TaqMan技术，结合PCR技术，以达到定量分析和监测某一特定序列DNA的目的，这种技术比以往的技术有很大的优势，更易于完成。
TaqMan荧光定量PCR的基本原理比较简单，大致可以分为以下四步：
（1）样本处理：检测序列DNA及其作为模板的原始样品将在定量PCR试剂盒中经过一系列处理，得到模板文库。
（2）探针标记：样品处理完成后，将开发出一对对应该特殊序列的5'荧光探针—特殊碱基对相对应的序列和3'分子耦合（MolecularBeacon）。
探针内部具有双螺旋结构，当处于开放状态时，荧光物质才能折射发射自己特有的颜色荧光。
（3）反应物添加：在模板文库中添加进Taq DNA 聚合酶、核酸类型的合成引物，以及缓冲液，用水调节总体浓度。
（4）加热-冷却：完成上述步骤，将反应液放入定量PCR仪，按照一定的条件，经由一系列的加热、冷却过程，Taq DNA聚合酶将碱基对引物合成，产生复制模板文库。
同时在复制过程中，反应液中复制数量也不断增加，一旦达到一定温度，则表明文库复制到足够多，荧光探针能够在反应液中爆炸，产生光谱，得以直接测定检测序列DNA的定量。
此外，TaqMan荧光定量PCR技术能够检测DNA的扩增曲线，并由此提供准确的定量结果，同时也不受PCR技术的一些影响，更易于操作。
taqman探针原理
taqman探针原理
Taqman探针是一种用于实时聚合酶链反应（real-time PCR）
的荧光标记探针。
它利用荧光共振能量转移（FRET）原理，
对靶标DNA进行定量分析。
Taqman探针包括一个发光染料（如荧光素）连在5'端，一个
荧光抑制剂（如四乙酰基二甲基氧基哌啶，BHQ1）连在3'端。
在无靶标DNA时，发光染料和荧光抑制剂保持在近距离，从
而导致荧光信号被抑制。
当探针与靶标DNA结合时，PCR扩
增过程中，3'至5'外切的Taq聚合酶会识别并切割探针。
此时，荧光染料和抑制剂分离，荧光信号显现出来。
通过实时PCR仪器的荧光探测系统，可以监测到Taqman探
针的荧光信号的增加，以推断靶标DNA的浓度。
通过测量PCR循环数与荧光信号的关系，可以获得准确的定量PCR结果。
Taqman探针的这种特点使得其在基因表达分析、突变检测、
病原体检测等领域具有广泛的应用价值。
它准确、灵敏、特异性高，成为实时PCR中最常用的探针之一。
实时荧光定量 原理 taqman 探针简介
实时荧光定量 PCR技术原理与应用聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。
在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。
无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。
但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。
例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。
在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。
所谓的实时荧光定量 PCR 就是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 ( 如图 1) 。
图 1 实时荧光扩增曲线图一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。
在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。
PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。
为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。
Taqman探针
自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。
第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。
第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则* 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
* 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。
建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
* 扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。
较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
* 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
TaqMan探针合成
TaqMan探针合成
Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号可被淬灭基团吸收，荧光监测系统检测不到荧光信号；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光监测系统通过实时检测系统中荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步产物的完全同步，从而实现定量。
TaqMan探针工作原理
随机形态-不发荧光阴性杂交形态-不发荧光阳性杂交形态-发发光
标记TaqMan探针的常见荧光基团
报告基团英文名称中文名称Em max Abs max M.W 颜色。
烟曲霉探针法荧光定量PCR试剂盒实验原理
烟曲霉探针法荧光定量PCR试剂盒试验原理烟曲霉探针法荧光定量PCR试剂盒说明书产品特点1. 使用化学修饰的热启动聚合酶，反应特异性高，*程度地避开了非特异扩增；2. 反应缓冲液经充分优化，反应灵敏快速，40个循环只需20多分钟；3. 抗干扰本领强，反应重复性高，适合对土壤、粪便、肿瘤和血液来源的多而杂样本中的靶基因进行检测分析。
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，zui后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
特异性荧光标记：TaqMan法TaqMan探针的特性：（1）5′端标记有报告基团（Reporter, R），如FAM、VIC等（2）3′端标记有荧光淬灭基团（Quencher, Q）（3）探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团汲取，无荧光， R 与Q分开，发荧光（4）Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针烟曲霉探针法荧光定量PCR试剂盒相对定量通过内标定量：内标（Endogenous Control）通常是βactin、GAPDH基因等看家基因，在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小，内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量。
相对定量分析方法：2ΔΔCt前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在5％以内1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：ΔCT（test）= CT（target,test）CT（ref,test）ΔCT（calibrator）= CT（target,calibrator）CT（ref, calibrator）2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：ΔΔCT= ΔCT（test）ΔCT（calibrator）3、计算表达水平比率：2 –ΔΔCT=表达量的比值荧光定量PCR检测方法包含以下步骤：（1）将参照基因与待测目的基因片段等比例连接，克隆到同一个质粒载体上，构建一种可同时用于参照基因以及待测目的基因扩增检测的标准品，并将所得标准品依照浓度梯度稀释后同时用于绘制参照基因以及待测目的基因的标准曲线；（2）待测样本与步骤（1）所述标准品经同步进行实时荧光定量PCR扩增后，目的基因与参照基因依照各自的标准曲线计算各自的拷贝数，计算待测样本的目的基因与参照基因拷贝数比值，即得目的基因的拷贝数相对定量检测结果。
qRT-PCR原理与应用
引物质量评价：评价“高效+特异”
软件打分
PCR验证
qPCR扩增曲线+融解曲线
定量检测
程序设置与普通PCR无异，但产物长度较小，可使用两步法（退火延伸 qPCR程序 同时完成）替代三步法，同时需要增加荧光采样点。
也可以使用一步法qRT-PCR：使用目标序列特异性引物，同时完成逆 转录与定量。
荧光值到模板量
结果与图片
数据分析
绝对定量-标准曲线
标准品 梯度稀释
PCR-Ct扩增曲线
模板浓度 C0-Ct标曲
结果图片展示
扩增与融解曲线
相对定量-ΔΔCt法 内参基因 扩增曲线 Δ数学关系
表达量柱状图
mRNA/Lnc
miR特异性序列+茎环结构，每 个目标序列需要逆转录一次
利用ploy A
随机引物
添加ploy A
一步到位，无特异性逆转录全部RNA为cDNA
miR
茎环法
5’-端引物在逆转 录与qPCR间通用， 3’-端随机
模板质量评价
电泳
光度
梯度模板下qPCR扩增曲线
引物设计与检验
qPCR引物设计原则
原理 qRT-PCR
从PCR到qPCR
qPCR原理
荧光标记 Ct值
Taqman探针：探针两端分别接荧光基团 与荧光淬灭基团,PCR中Taq酶切开探针，
分离荧光基团，使之荧光不被淬灭
染料荧光：SYBR染料，结合DNA双螺旋大 沟发荧光，与单链不结合
扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数 （Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。简单讲，Ct值
TaqMan探针，我凭啥发光？
TaqMan探针，我凭啥发光？ 有很多小伙伴每天照着标准化的流程，按部就班地做着实验，流程很熟，但是问其实验原理，那是一问三不知。
就好比知道肝硬化患者会出现腹水，却不知道腹水产生的机制，你的上级医生估计要敲你的头了。
今天我们来讲讲TaqMan探针的原理，因为了解他们会让实验在遇到问题时，你能更好地找到问题的症结所在。
有的小伙伴问：TaqMan探针是什么，我们平时做实验要用么？你的导师不会敲你的头，因为他也不知道那是个什么东西。
定量PCR会敲破你的脑袋（很多小伙伴每天都做的实验）。
我们知道定量PCR会产生荧光信号，信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
科研很神奇，一丁点儿的白开水，加上往里面倒点白开水，煮一煮会发光，至于为什么会有产生荧光，小伙伴说不能知道得太多，不然整个人就会不好的。
我偏要讲，因为原理真的很简单。
TaqMan酶由三部分组成：一边一个叫6-Fam的贼（偷盗界璀璨的一颗新星），另一边是一个叫DABCYL的警察（有他在，任何荧光都会为之暗淡），Fam贼和DABCYL警察之间连着一根磁铁制的手铐，因为有DABCYL警察的存在，Fam贼就没有办法展现自己才能。
于是Fam做了个艰难的决定，把手铐贴到铁轨上，让Taq酶号列车斩断这根手铐链子（Taq酶号列车以1kb/min 的速度从5’端呼啸而来，用坚不可摧的5’-3’外切酶活性切断所有阻碍）。
哈哈，Fam贼又自由了，又能发挥他偷鸡摸狗的璀璨光芒了。
有小伙伴问：Taq酶是什么？经常做的PCR要敲你的脑袋了，Taq酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus （Taq）中分离出的具有热稳定性的DNA 聚合酶。
听完了，整个人还没有死掉吧？回复“Taqman”可获得《Taqman探针设计总结》的下载链接哦……。
TaqMan探针技术原理
TaqMan探针技术原理TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。
由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。
在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。
探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。
探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。
当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。
随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号（图4）。
所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。
信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
图4 TaqMan探针的荧光信号产生机制TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan 探针和TaqMan MGB探针。
MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。
同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团（图5），可以将探针的Tm值提高10°C左右。
因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。
因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。
实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。
图5 TaqMan MGB探针。
实时荧光定量PCR-TaqMan探针法及设计原则
03
Taqman探针的合成与制备
探针的合成方法
化学合成法
通过化学反应将荧光基团和淬灭基团分别连接到DNA或RNA的5'和3'末端，形成 Taqman探针。
酶促合成法
利用DNA聚合酶将荧光基团和淬灭基团分别添加到DNA或RNA的特定位置，形成 Taqman探针。
探针的质量检测与纯化
质量检测
通过电泳、质谱和光谱分析等方法检测探针 的长度、荧光基团和淬灭基团的数量和位置 ，以及探针的纯度。
定义与原理
定义
实时荧光定量PCR-Taqman探针法是 一种基于荧光信号的实时监测技术， 用于定量分析DNA或RNA的拷贝数。
原理
通过在Taq酶催化下，利用荧光染料 标记的特异性探针与待测核酸进行特 异性结合，在PCR循环过程中实时监 测荧光信号的增强，从而实现对核酸 的定量分析。
发展历程与现状
02
Taqman探针的设计原则
探针的长度与结构
长度
通常为20-30bp，确保特异性并减少非特异性扩增。
结构
由报告基团、淬灭基团和连接臂组成，连接臂长度一般为5-6个脱氧核糖核苷酸。
探针的特异性
针对目标序列
确保探针与目标序列完全匹配，避免 交叉反应。
序列选择
选择基因特异性区域，避免基因组中 的高变区。
04
Taqman探针在实时荧光定量 PCR中的应用
样本处理与PCR反应体系建立
样本处理
确保样本质量，去除杂质和抑制剂，提 取高质量的DNA或RNA。
Taqman探针设计
根据目标基因序列设计Taqman探针， 确保探针的特异性和荧光信号的稳定
性。
引物设计
根据目标基因序列设计特异性引物， 确保引物与模板的结合效率和特异性。
taqman探针法的基本原理
taqman探针法的基本原理在生物分子检测的神奇世界里，有个超厉害的小家伙叫 Taqman 探针法。
这可是个能帮我们窥探生命奥秘的好帮手呢！想象一下，我们的细胞里有好多好多的基因和分子，就像一个超级大的秘密花园，充满了各种神秘的信息。
而 Taqman 探针法就像是一把神奇的钥匙，能帮我们打开这个花园的大门，去发现里面的宝贝。
那这把神奇的钥匙到底是怎么工作的呢？其实啊，它的原理就像是一场精心策划的“捉迷藏”游戏。
咱们先来说说 Taqman 探针是啥。
它就像是一个带着特殊标记的小侦探。
这个小侦探长得有点特别，一头连着能发出荧光的东西，另一头呢，有一段和我们要找的目标分子（比如某个特定的基因片段）能配对结合的序列。
当我们开始检测的时候，就把这个小侦探和其他的小伙伴们一起放进一个反应体系里。
这里面还有我们要检测的那些分子，还有能让反应发生的各种东西。
然后，反应就开始啦！这个时候，有一种叫 Taq 酶的小伙伴登场了。
它就像是个勤劳的小工人，不停地干活。
在反应过程中，如果没有找到要检测的目标分子，那这个小侦探探针就好好的待着，它身上的荧光也被藏得严严实实的，咱们啥也看不到。
但是，一旦找到了目标分子，那就精彩啦！Taq 酶这个小工人就会发挥作用，它会一边往前走，一边把和目标分子结合在一起的探针给切断。
这一切断可不得了，原本被藏着的荧光就一下子跑出来啦！你看，这是不是很神奇？就好像是小侦探找到了目标，然后发出了信号告诉我们：“我找到啦！”而且哦，荧光的强度和我们要检测的目标分子的数量是有关系的。
目标分子越多，被切断的探针就越多，跑出来的荧光也就越强。
这样，我们通过检测荧光的强度，就能知道目标分子到底有多少啦！比如说，如果我们想知道一个人身体里是不是有某种病毒，就可以用 Taqman 探针法来检测。
看看病毒的基因在不在，有多少，就能知道这个人是不是生病了，病得重不重。
总之啊，Taqman 探针法就像是一个超级厉害的魔法，能让那些看不见摸不着的分子变得能被我们发现和了解。
taqman探针原理
3min，但为了结 95℃ 5 min；（可以 果稳定性，最好5min。）
95℃ 5 s ， 58℃ 10 s ， 72℃ 10s ； 72℃ 25s ； 25℃ 1s 。
32个循环
纳米taq配制的mix， 扩PPARa定量
是RNA探针。TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探 针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在 3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一 个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射 的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶 的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光 基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接 收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧 光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形 成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC， HEX。 而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进 行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有 望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
Taqman探针
自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。
第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。
第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则* 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
* 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。
建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
* 扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。
较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
* 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
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