实验方法---单抗制备

抗D-二聚体单克隆抗体的制备和鉴定

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物和细胞

6周龄BALB/c雌鼠，体重18～22g，购于武汉大学实验动物中心；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞。

1.1.2 试剂

小牛血清（NCS）——56℃灭活30分钟过滤除菌、HT及HAT选择培养液（筛选杂交瘤细胞，Sigma 公司）、8-氮杂鸟嘌呤（8-azaguanine）、RPMI 1640、Hank's液、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG （HRP-GAM-IgG）及鼠源McAb亚类检测试剂盒（Sigma公司/ Roche公司）、Western blot 试剂盒（Roche 公司）、96孔和24孔细胞培养板、5%脱脂奶粉、ELISA板、FPLC（快速蛋白液相层析）、弗氏完全和不完全佐剂（Sigma公司）、D-二聚体标准品、台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒（Sigma公司）、二甲基亚砜（DMSO，分析纯）、75%酒精。

1.1.3 主要仪器设备

CO2培养箱、液氮、细胞计数板、酒精灯、玻璃平皿、平底烧瓶、200目不锈钢网筛、细胞培养板、培养瓶、解剖器械（剪刀和镊子）、加样枪及枪头（黄，蓝，白）、一次性无菌塑料离心管（15ml）、滤菌器、PH试纸、酶标仪、蛋白检测仪、蛋白纯化系统、高速冷冻离心机、低速大容量多管离心机、层析柱、倒置显微镜、电热干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 动物免疫

首次免疫以100ug D-二聚体+完全佐剂按1：1乳化，于小鼠颈背部皮下多点注射；第二次和第三次改为不完全佐剂，其他免疫指标不变，于小鼠颈背部皮下多点注射。注射量均为0.3ml/只。

1.2.2 ELISA法测定小鼠血清效价

小鼠血清抗体效价应>1:10 000，融合前3天加强免疫一次。

1.2.3细胞融合前的准备

1.2.3.1 骨髓瘤（浆细胞瘤）细胞的选择和培养：

骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小

鼠腹腔内产生大量McAb。常用骨髓瘤细胞系有：SP2／0、NS1、P3/X63-Ag8.653等。

骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞浓度以104～105/ml为宜，最大密度不得超106／ml，一般扩大培养以1：3～1∶10稀释传代，传代培养要保持细胞的对数生长期（约105细胞/毫升，细胞形态规则要一致，圆而亮，有一定的立体感，机能要活跃，活细胞数在90—95%以上。要得到这种细胞，其培养技巧在于，在融合前24小时，将生长良好的细胞全部自瓶壁冲下来，并除去1/2或更多的细胞，加入新鲜培养液令细胞重新贴壁分裂增繁），每3～5天传代一次，细胞的倍增时间为16～20小时，一般可间隔3天更换一次培养液（一般一传三或把一瓶细胞弃去一半后再一传二，这样24小时后又全部长满。）。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮杂鸟嘌呤进行处理（15～20ug／ml），HGPRT阳性细胞利用8-AG后，合成毒性核苷酸而死亡，只有HGPRT阴性细胞能持续生长，从而避免细胞的返祖现象，使生存的细胞对HA T呈均一的敏感性。上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁（半贴壁）生长，无须用姨蛋白酶消化，直接用吸管轻轻吹打即可使细胞分散。骨髓瘤细胞的最高生长浓度为9X105／ml，倍增时间通常为10～15h。

一般在准备融合前两周就应开始复苏骨髓瘤细胞（融合前经8-氮杂鸟嘌呤筛选2周）。用于融合试验前必须做对HAT选择培养基敏感性试验。由于HGPRT酶缺损，DNA合成障碍细胞应发生死亡，否则有变异，不能用于试验。为阻止出现返祖现象，确保该细胞对HAT的敏感性，在筛选建株时应在含8-氮杂鸟嘌呤致死剂的培养液中（20～30mg/L）培养一代后（条件摸索：两代），换成常规培养基培养。融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于95％），在细胞融合前1天用新鲜培养基调细胞浓度为2×105／ml，一般次日即为对数生长期细胞。每3～6月应用8-AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。复苏的主要步骤及注意事项见《医用细胞工程》第111页。

1.2.3.2 免疫脾细胞的制备：

免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞一般取最后一次加强免疫3天以后（第4天，融合当天）的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

脾细胞悬液的制备：

a 摘除小鼠眼球放血，留作阳性对照。

b 拉颈处死小鼠，用75%的酒精浸泡消毒小鼠皮毛3～5分钟。

c 无菌条件下打开腹腔取出脾脏，去除脂肪和结缔组织，用无血清的培养液（1640）或Hank's液洗

去红细胞。

d 置不锈钢筛网上用注射器内芯研磨成细胞悬液后吸入小试管中，直立小试管3 min使大块的结缔组

织下沉，把脾细胞悬液吸入离心管中（不锈钢筛网置于玻璃平皿中，加入洗液，用注射器内芯研磨好后，再用适量洗液将不锈钢筛网上的脾细胞冲入平皿）。

e 用洗液洗2次，再用无血清1640洗一次。洗液充满离心管，经1000 r / min离心5 min（与此同时

开始制备骨骼瘤细胞）。

f 弃上清加入完全培养基（10%FCS的RPMI 1640），用吸管吹打分散，收集上层悬液，除去沉下的

大块。

g 用计数板进行细胞计数（第125页），细胞计数，并用培养基调整适当的细胞浓度（1～２×10８/L

左右）置室温待融合用；以台盼兰染色用显微镜检查，活细胞数应高于80%为合格。

一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为1～２.5×10８/L左右。

1.2.3.3 饲养细胞的制备：

为防止细胞融合时因损伤而难以生长、促进杂交瘤细胞生长、增加克隆数，常需制备饲养层细胞。可用肉汤刺激小鼠腹腔并收获腹腔中的巨噬细胞，该细胞有助于清洁培养表面和吞噬死亡细胞。

小鼠腹腔巨噬细胞的制备：

小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄

↓

拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟