实验方法---单抗制备
单抗制备的原理及过程
单抗制备的原理及过程嘿，咱今儿就来讲讲单抗制备的那些事儿！你知道吗，单抗就像是我们身体里的小战士，专门去对付那些坏家伙。
单抗制备啊，就好比是一场奇妙的旅程。
首先呢，得有个好的起点，那就是选择合适的抗原。
这抗原就像是小战士要攻击的目标，得找得准准的。
然后呢，把这个抗原送进动物体内，比如小白鼠啦。
这小白鼠就像是一个训练基地，让免疫系统在里面好好练兵。
经过一段时间，免疫系统就会产生针对这个抗原的抗体啦。
这时候，就像在茫茫人海中找到了那个特别的战士。
可是呢，这里面的抗体可不都是我们想要的单抗哦，这就需要我们去筛选啦。
筛选的过程就好像是沙里淘金，得仔细又耐心。
把那些不是单抗的抗体都去掉，只留下我们的宝贝单抗。
这可不容易呢，就像在一堆石头里找出那颗最闪亮的宝石。
接下来，就是要让单抗不断繁殖啦。
这就像是让小战士不断成长壮大，组成一支强大的军队。
通过细胞培养等技术，让单抗越来越多。
然后呢，还得对这些单抗进行各种检测和优化，确保它们个个都是精兵强将。
这就像是给战士们配备最好的武器和装备，让他们在战场上能发挥最大的作用。
你说这单抗制备是不是很神奇？就像变魔术一样，从一个小小的抗原，最后变成了能治病救人的神奇单抗。
单抗在医学上的作用可大了去啦！可以帮助诊断疾病，就像一个敏锐的侦探，能快速找出疾病的线索。
还可以治疗疾病呢，就像一个勇敢的战士，直接冲向病魔，把它们打得落花流水。
想想看，如果没有单抗，那得有多少病人得不到有效的治疗呀！所以说，单抗制备真的是太重要啦！这就像是为人类的健康筑起了一道坚固的防线。
咱们的科学家们可真是厉害呀，他们不断探索，不断创新，让单抗制备技术越来越先进。
他们就像是一群勇敢的开拓者，在未知的领域里披荆斩棘，为我们带来希望和健康。
所以啊，大家可别小看了这单抗制备，它背后蕴含着无数人的努力和智慧呢！让我们一起为单抗制备点赞，为科学家们加油吧！。
单抗制备的详细步骤
免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞 融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第 4 天和第 22 天，在初次免疫应答时获得的 杂交瘤主要分泌 IgM 抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌 IgG 抗体。笔者 体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清 抗体高峰之前。因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，这在 最后一次加强免疫后第 3 天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫，可提高 小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫 3 天后即可融合。
(1) 抗原制备 制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的 抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越 纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限， 或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分 的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特 别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是 与免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特 异性和敏感性。 (2) 免疫动物的选择 根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为， 所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于 BALB/c 小鼠，所有的大鼠骨髓 瘤细胞都来源于 LOU/c 大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免 疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交 瘤一般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。就小鼠而言，初次免疫时以 8-12 周龄为宜，雌性鼠较便于操作。 (3) 免疫程序的确定 免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使 B 淋巴 细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌 特异性抗体的杂交瘤的机会。因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、 抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。 没有一个免疫程序能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆 抗体的方法。表 6-1 列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下 注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用 腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在 最后一次加强免疫后第 3 天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次
(仅供参考)单抗的制备方法(实验室Protocol)
单抗的制备方法1，免疫BALB/c 小鼠的免疫 BALB/c 小鼠的免疫按常规方法进行，二免后一个星期分别用断尾抽真空法采血200μL 进行抗体检测，二免采血后让小鼠休息两周进行加强免疫，三天后融合。
表1 BALB/c 小鼠的免疫方案（供参考）免疫次数 时间免疫剂量（μg/ mL ） 免疫方法 佐 剂 首免 二免 加强0d21d42d (融合前三天) 100 100 200 颈背部皮下 腹腔注射 腹腔注射 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 不加佐剂2，BALB/c 小鼠的抗体检测2.1 BALB/c 小鼠血清的制备将采集的全血样品于37℃温箱放置30min 后，4℃放置半天，待血清析出后， 4 500r/min ，离心10min ，用移液器吸出血清，4℃放置待检。
2.2 间接ELISA 法的建立BALB/c 小鼠免疫后，用间接ELISA 法对其血清抗体水平进行检测，间接ELISA 法步骤如下：包被： 4℃包被过夜。
洗板：弃去包被液，拍干，向酶标板内加入洗涤液，每孔200μL ，3～5min 后倒掉洗涤液，再拍干。
如此重复三次。
加待检血清：将血清用ELISA 洗涤液从1：10 000开始进行倍比稀释(即 1：10 000、20 000、40 000、80 000、160 000、320 000、640 000、1 280 000)，共8个浓度。
将稀释好的血清按浓度由低至高的顺序加入酶标板内，每孔100μL ，每只小鼠的血清做两列，在37℃温箱内孵育30min 。
同时设阴性血清对照。
洗板：同上。
加HRP 标二抗：工作浓度1：10 000，每孔100μL ，在37 ℃温箱内孵育30min 后，洗板三次。
显色：加底物(TMB-过氧化氢脲)，每孔100μL ，37℃温箱放置10min ，加2mol/L H 2SO 4终止显色反应，每孔50μL ，用酶标仪测定OD 450值。
结果判定：P/N ≥2，判为阳性(P 、N 分别为待检和阴性血清的OD450值)。
实验方法---单抗制备
抗D-二聚体单克隆抗体的制备和鉴定1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 动物和细胞6周龄BALB/c雌鼠，体重18～22g，购于武汉大学实验动物中心；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞。
1.1.2 试剂小牛血清（NCS）——56℃灭活30分钟过滤除菌、HT及HAT选择培养液（筛选杂交瘤细胞，Sigma 公司）、8-氮杂鸟嘌呤（8-azaguanine）、RPMI 1640、Hank's液、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG （HRP-GAM-IgG）及鼠源McAb亚类检测试剂盒（Sigma公司/ Roche公司）、Western blot 试剂盒（Roche 公司）、96孔和24孔细胞培养板、5%脱脂奶粉、ELISA板、FPLC（快速蛋白液相层析）、弗氏完全和不完全佐剂（Sigma公司）、D-二聚体标准品、台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒（Sigma公司）、二甲基亚砜（DMSO，分析纯）、75%酒精。
1.1.3 主要仪器设备CO2培养箱、液氮、细胞计数板、酒精灯、玻璃平皿、平底烧瓶、200目不锈钢网筛、细胞培养板、培养瓶、解剖器械（剪刀和镊子）、加样枪及枪头（黄，蓝，白）、一次性无菌塑料离心管（15ml）、滤菌器、PH试纸、酶标仪、蛋白检测仪、蛋白纯化系统、高速冷冻离心机、低速大容量多管离心机、层析柱、倒置显微镜、电热干燥箱。
1.2 方法1.2.1 动物免疫首次免疫以100ug D-二聚体+完全佐剂按1：1乳化，于小鼠颈背部皮下多点注射；第二次和第三次改为不完全佐剂，其他免疫指标不变，于小鼠颈背部皮下多点注射。
注射量均为0.3ml/只。
1.2.2 ELISA法测定小鼠血清效价小鼠血清抗体效价应>1:10 000，融合前3天加强免疫一次。
1.2.3细胞融合前的准备1.2.3.1 骨髓瘤（浆细胞瘤）细胞的选择和培养：骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
单抗制备步骤及注意事项
单抗制备步骤及注意事项脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：•免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B 淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：•常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
•骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
•骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
•一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
•一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
•保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
单抗制备的详细步骤
单抗制备的详细步骤单抗（monoclonal antibody）是由单一细胞母克隆细胞系产生的抗体，具有高度特异性和一致性。
单抗制备的过程通常包括免疫原的选择、动物免疫、细胞融合、克隆筛选和克隆扩增等步骤。
下面将详细介绍这些步骤。
第一步，免疫原的选择。
免疫原是制备单抗必不可少的关键组成部分。
免疫原的选择应基于目标抗体的特异性和重要性。
常用的免疫原包括蛋白质、多肽、多糖、细胞表面分子等。
为了提高免疫原的免疫原性，可以将免疫原与佐剂混合，以增强其免疫原性。
第二步，动物免疫。
将选择的免疫原注射到合适的动物体内。
常用的免疫动物包括小鼠、大鼠、兔子等。
在免疫过程中，通常需要多次免疫，在每次免疫之间有一定的间隔时间，以增强免疫效果。
在免疫的过程中，可以通过采血检测免疫反应的进展，并决定最佳的免疫时间点。
第三步，细胞融合。
在免疫过程中，免疫细胞会产生针对免疫原的抗体。
为了制备单抗，需要将这些抗体产生的免疫细胞与癌细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
常用的癌细胞包括骨髓瘤细胞、葡萄膜炎细胞等。
第四步，克隆筛选。
将细胞融合密度适宜的细胞悬浮液均匀分配到培养皿中，使单个杂交瘤细胞分布在不同的培养皿中。
培养皿中含有特定选择性培养基，使只有杂交瘤细胞能够存活和生长。
在适当的条件下，杂交瘤细胞会形成一个细胞克隆。
然后，可以通过ELISA、细胞培养和动物注射等方法对克隆的细胞上清液进行筛选，以检测是否含有特定的抗体。
第五步，克隆扩增。
通过继续培养和传代，可以扩增含有特定抗体的细胞克隆。
克隆扩增的时间可能需要数周或数月，具体取决于细胞系的生长速度和特性。
最后，可以将克隆扩增的细胞培养液进行纯化和浓缩，以获得高纯度的单抗。
通常使用亲和层析、离心、电泳等技术进行单抗的纯化。
单抗制备的最终产品可以用于医学研究、诊断和治疗等领域。
尽管以上步骤可以概括标准的单抗制备过程，但实际制备中可能因为不同的实验目的和具体需求而存在一些变化。
制备单抗是一个复杂而耗时的过程，需要专业的实验技术和丰富的经验。
单抗体制备
单抗体制备引言单抗（monoclonal antibody）是指来源于单一克隆细胞的抗体，具有高度特异性和高亲和力。
单抗在医学、生物工程和疾病治疗等领域具有广泛应用前景。
本文将介绍单抗的制备方法，包括杂交瘤细胞制备、单克隆细胞培养和纯化等步骤。
一、杂交瘤细胞制备杂交瘤细胞是由B淋巴细胞（B lymphocyte）和骨髓瘤细胞（myeloma cell）融合而成的细胞系，具有无限增殖能力和产生单克隆抗体的能力。
制备杂交瘤细胞的步骤如下：1.1.采集B淋巴细胞从免疫动物（如小鼠）的脾脏或淋巴结中采集B淋巴细胞。
这些细胞是免疫系统中产生抗体的关键细胞。
1.2.准备骨髓瘤细胞选择一种骨髓瘤细胞系，如NS-1细胞或SP2/0细胞，作为杂交瘤的母细胞。
这些细胞具有无限增殖能力，适合用于制备杂交瘤细胞。
1.3.融合细胞将采集到的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞按照一定比例混合，加入聚乙二醇等融合剂，使细胞融合为杂交瘤细胞。
融合后的细胞称为杂交瘤。
二、单克隆细胞培养杂交瘤细胞具有无限增殖能力，但并不能产生单一的抗体。
为了获得单克隆抗体，需要对杂交瘤细胞进行单克隆化培养。
2.1.稀释培养将融合后的杂交瘤细胞进行稀释培养，使细胞以单个细胞的形式分散在培养基中。
这样可以使每个细胞形成一个单克隆。
2.2.筛选单克隆细胞将稀释后的杂交瘤细胞进行筛选，通常采用限稀稀释法或HTP法。
限稀稀释法是在培养基中加入一定浓度的杂交瘤细胞，使每个细胞在培养皿上形成单个克隆。
HTP法则是将杂交瘤细胞分装到96孔板中，每个孔中只有一个细胞，便于单克隆的筛选。
2.3.培养和扩增单克隆细胞将筛选出的单克隆细胞进行培养和扩增，可以使用无血清培养基，添加合适的生长因子和抗生素，促使细胞的生长和分裂。
三、单抗纯化经过单克隆细胞培养，可以得到大量的单克隆抗体，但其中还含有其他蛋白质和杂质。
为了获得纯净的单抗，需要进行纯化步骤。
3.1.采集培养上清将培养单克隆细胞的上清液收集起来，其中含有分泌的单克隆抗体。
单抗制备实验报告
一、实验背景单克隆抗体（Monoclonal Antibody，简称mAb）是一种具有高度特异性和亲和力的抗体，由单个B细胞克隆产生。
单抗在生物医学研究、疾病诊断、治疗药物研发等领域具有广泛的应用。
本实验旨在通过细胞融合技术制备小鼠单克隆抗体，并对其特异性、亲和力和效价进行鉴定。
二、实验材料1. 实验动物：雌性小鼠，体重18-22g。
2. 试剂与耗材：淋巴细胞分离液、Ficoll、RPMI-1640培养基、胎牛血清、链霉素、青霉素、聚乙二醇（PEG）、小鼠抗小鼠IgG-FITC、兔抗小鼠IgG-HRP、ELISA 试剂盒、抗体稀释液、抗体亲和层析柱等。
3. 仪器：超净工作台、显微镜、酶标仪、离心机、冰箱、培养箱等。
三、实验方法1. 动物免疫（1）选择雌性小鼠，将其随机分为两组，每组10只。
（2）对实验组小鼠进行免疫，每次免疫剂量为1mg抗原，间隔2周进行第2次免疫。
（3）对照组小鼠仅给予生理盐水注射。
2. 细胞分离与培养（1）免疫后第3周，处死实验组小鼠，无菌操作取出脾脏。
（2）将脾脏剪碎，加入Ficoll分层液，进行细胞分离。
（3）收集单个核细胞，用RPMI-1640培养基洗涤2次，计数。
（4）将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行混合，加入PEG进行细胞融合。
（5）将融合后的细胞进行培养，选择杂交瘤细胞。
3. 单抗制备（1）将杂交瘤细胞进行扩大培养，收集培养上清。
（2）用ELISA试剂盒检测培养上清中的抗体效价，筛选出高亲和力抗体。
（3）将高亲和力抗体进行亲和层析纯化。
4. 单抗鉴定（1）用小鼠抗小鼠IgG-FITC和兔抗小鼠IgG-HRP进行Western blot检测，鉴定单抗的特异性。
（2）用ELISA试剂盒检测单抗的效价。
（3）用抗体亲和层析柱对单抗进行亲和力测定。
四、实验结果1. 动物免疫实验组小鼠在免疫过程中未出现明显异常，免疫成功。
2. 细胞分离与培养成功分离出脾细胞和骨髓瘤细胞，细胞融合率为90%。
单抗的制备方法
Game Plan for Ab00001cn -protein目标：利用重组蛋白作为免疫原，制备针对XXX蛋白的小鼠单克隆抗体，承诺WB/ELISA。
要求: 至少1株，WB能够检测到20ng/lane的重组蛋白和细胞裂解液中过表达蛋白，ELISA 可以识别天然蛋白，是否能够检测到内源蛋白得根据其丰度另议。
背景：xxx蛋白隶属于xxx家族，有XXX结构域，分子量大小XXX KD，有XXX翻译后修饰。
客户提供XXX蛋白，为天然/商品化/原核/真核重组蛋白，XXX体系表达，XXX纯化方式获得，有XX/无标签，浓度为XXX mg/ml，纯度>75%以上，缓冲液为XXX buffer保存，保存条件为-20℃，避免反复冻融，请分装冻存。
必需材料：客户提供XXX蛋白，浓度 XXX mg/ml，共xxx ml，纯度>75%，蛋白总量不低于1mg，免疫与检测用；客户提供转有含XXX蛋白的细胞裂解液WB膜（膜蛋白提供膜组分，核蛋白提供核组分，每孔30ug总蛋白）；客户提供0.1mg商品化抗xxx蛋白的抗体（可选）；客户提供阴性对照YYY蛋白/空白细胞培养液等应用于特异性筛选（可选）。
实验计划：第一部分：免疫原制备:根据样品信息单对客户提供的XXX蛋白进行BCA定量以及SDS-page电泳检测目的蛋白浓度及纯度，制备免疫原，备用。
请质检同时制备至少两张XXX蛋白的WB膜，1ug/张。
请销售提醒客户必须在10天内提供WB膜。
第二部分：制备分泌识别XXX的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1.实验动物免疫使用第一部分制备的免疫原免疫小鼠，共3只。
Email通知客户项目启动，并通知客户支付启动费；2.实验动物免疫反应监测监测小鼠针对免疫原的免疫反应（ELISA法，xxx蛋白包板检测，100ng/well；WB，重组蛋白20ng/lane，阳性对照抗体为标签单抗），并尽快寄少量尾血给客户验证。
Email通报项目进展；请质检部门先完成ELISA，然后再决定何时进行重组蛋白WB，但是必须在进行融合前完成。
单抗制备工艺
单克隆抗体制备主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、单抗的鉴定及制备等。
1 动物免疫根据抗原的特性选择合适的免疫方案，对于可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂。
常用佐剂为福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。
要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状。
（1）初次免疫，Ag50ug/只，加福氏完全佐剂皮下多点注射，一般1.5ml,间隔3周。
（2）第二次免疫，剂量途径同上，加福氏不完全佐剂，间隔3周。
（3）第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射，7天后采血测其效价，检测免疫效果，间隔3周。
（4）加强免疫，剂量50ug，腹腔注射。
（5）3天后，取脾融合。
2细胞融合（1）饲养细胞的制备在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞小鼠腹腔巨噬细胞的准备：①用6-10 周龄的BALB/c小鼠。
②拉颈处死，浸泡于75%的酒精，消毒3min,用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜。
用吸管注入6ml培养液，反复冲洗，吸出冲洗液。
③放入10ml离心管，1200rpm离心5min.④用20%小牛血清的培养液混悬，调整细胞数为1*105/ml.加入96孔板，100ul/孔。
放入37度孵箱培养。
（2）骨髓瘤细胞的准备①于融合前48-36小时，将骨髓瘤细胞扩大培养②融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内。
③1000r/min离心5-10分钟，弃去上清。
④加入30ml不完全培养基，离心洗涤一次。
然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基，混匀。
⑤取骨髓瘤细胞悬液，加0.4%台酚蓝染液作活细胞计数后备用。
（3）脾细胞的准备取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。
同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分钟，于培养皿上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml 不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。
单抗制备操作规程
单抗制备操作规程单抗（monoclonal antibody）是指一种单一免疫球蛋白，它可以特异性地和抗原结合，用于诊断、治疗和研究不同疾病。
单抗制备是一项复杂的工作，需要准确控制多个关键步骤，下面是一个简化版本的单抗制备操作规程。
请注意，由于操作的精细性和复杂性，操作规程的详细程度可能因实验具体情况而有所不同。
1. 免疫原制备a. 根据实验需要，选择合适的抗原。
抗原可以是蛋白质、多肽、糖蛋白等。
b. 准备抗原的纯度要求高，可以通过自制或购买商业纯化抗原。
c. 对纯化后的抗原进行质量检测，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、SDS-PAGE等。
2. 动物免疫a. 选择合适的实验动物，常见的包括小鼠、大鼠、兔子等。
b. 注射一定剂量的抗原到动物体内，通常是通过多次免疫来诱导免疫反应。
c. 免疫前，检查动物的健康状况并确保其免疫力兴盛。
d. 在免疫周期中，对动物进行定期血样采集，检测免疫反应的效果。
3. 单克隆细胞的制备a. 免疫反应结束后，从动物身上采集免疫细胞（如脾脏、淋巴结等）。
b. 对细胞进行分离和稀释，以保证单个细胞的生长。
c. 制备培养基和培养条件，确保细胞的正常生长和营养供应。
d. 进行单克隆分离，筛选出特异性抗体的单克隆细胞。
4. 单抗的筛选和鉴定a. 将单克隆细胞进行扩增培养，并进行抗体的检测。
可以使用ELISA、免疫组织化学等方法。
b. 对候选单抗进行亲和力和特异性的检测，如亲和力柱层析、酵素标记的免疫组织化学等。
c. 从候选单抗中选择出高亲和力和特异性的抗体，作为最终的单抗。
5. 单抗的纯化和制备a. 选择合适的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析等，对单抗进行纯化。
b. 进一步对纯化的单抗进行浓缩和储存，以便后续的实验和应用。
6. 单抗的应用a. 单抗可以用于多种实验和应用，包括免疫组织化学、流式细胞术、蛋白质检测等。
b. 进行实验前，根据实验目的和要求，对单抗进行稀释和优化。
在整个单抗制备的过程中，实验者需要严格控制各个步骤的条件和细节，以确保单抗的质量和特异性。
单抗制备流程
单抗制备流程引言：单抗（monoclonal antibody）是一种由单一克隆的B细胞分泌的抗体，具有高度特异性和亲和力。
单抗制备是一项重要的生物制药技术，广泛应用于疾病的诊断、治疗和科研领域。
本文将介绍单抗制备的基本流程。
一、免疫原的选择与免疫动物的筛选在单抗制备的第一步，需要选择合适的免疫原。
免疫原可以是一种蛋白质、多肽或糖类分子，其选择应基于所需单抗的特异性和目标。
然后，在免疫动物的筛选过程中，需要选择适合的物种和品系，常用的免疫动物包括小鼠、大鼠和兔子等。
二、免疫原的免疫和混合细胞制备免疫原的免疫是单抗制备的核心步骤之一。
将免疫原与适当的佐剂混合，通过注射到免疫动物体内，诱导其产生特异性抗体。
为了提高抗原的免疫原性，可以采用多次免疫的方法。
在免疫期间，可以定期采集血液样本，检测抗体的产生情况。
三、细胞融合和杂交瘤的筛选细胞融合是单抗制备的关键步骤之一。
将免疫动物的脾细胞与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
融合细胞的筛选是为了选择产生特异性单抗的杂交瘤细胞。
常用的筛选方法包括HAT培养基筛选和ELISA检测。
四、单克隆细胞的培养与扩增经过筛选的杂交瘤细胞需要进行单克隆细胞的培养与扩增。
将杂交瘤细胞进行有限稀释，使其单个细胞分布在培养皿中。
通过培养和观察细胞的生长情况，筛选出单个克隆细胞。
五、单抗的纯化与鉴定单克隆细胞培养后，需要对其产生的单抗进行纯化和鉴定。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤等。
通过这些方法，可以将单抗从其他蛋白质和杂质中分离出来。
鉴定单抗的方法包括SDS-PAGE、Western blot和ELISA等。
六、单抗的应用和开发获得纯化的单抗后，可以进行进一步的应用和开发。
单抗可以用于疾病的诊断、治疗和预防。
在药物开发领域，单抗也被广泛应用于新药研发和临床试验。
结论：单抗制备流程是一个复杂而精细的过程，需要经过免疫原的选择与免疫动物的筛选、免疫原的免疫和混合细胞制备、细胞融合和杂交瘤的筛选、单克隆细胞的培养与扩增、单抗的纯化与鉴定等多个步骤。
单抗制备原理
单抗制备原理
单抗制备原理是指通过免疫细胞融合技术，将特定的抗原与特异性抗体结合，最终合成出具备相应特异性的单克隆抗体。
单克隆抗体是一种具有高特异性和高亲和力的抗体，可用于诊断、治疗和研究等领域。
单克隆抗体的制备主要包括以下步骤：
1. 免疫原制备：提取目标抗原并纯化，使其成为单克隆抗体的免疫原。
2. 免疫兔子或小鼠：将免疫原注射到兔子或小鼠体内，激发其免疫系统产生特异性抗体。
3. 细胞融合：从兔子或小鼠体内提取骨髓细胞，与无限增殖潜能的骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤筛选：通过限制性稀释法或酶免疫吸附筛选法，筛选出产生特异性抗体的杂交瘤细胞。
5. 单克隆抗体培养：将筛选出的杂交瘤细胞进行单克隆化，分离成单个克隆株，每个克隆株都产生特异性的单克隆抗体。
6. 单克隆抗体纯化：通过层析、电泳等技术对单克隆抗体进行纯化，去除杂质。
7. 鉴定和鉴定：利用免疫学技术对单克隆抗体进行鉴定，确定其特异性和亲和力。
8. 大规模制备：将特异性的单克隆抗体进行扩增和大规模制备，以满足实际需求。
通过以上步骤，可以制备出具有高特异性和高亲和力的单克隆抗体。
这些单克隆抗体可以应用于疾病的诊断、治疗和研究中，为医学和生物科学领域提供重要的工具和技术支持。
单抗的制备、纯化和鉴定
单抗的制备、纯化和鉴定一、实验目的：单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。
了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。
二、实验原理：骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。
将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。
经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。
只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。
三、试剂与器材：细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。
四、操作方法：1、抗原制备；一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。
A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。
一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。
B. 颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。
例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。
免疫学技术(单抗的制备)
单抗特点
一是特异性，针对特定的单一抗原表位，它具 有高度的特异性，抗肿瘤抗体药物的研究表明，其特 异性主要表现为特异性结合、选择性杀伤靶细胞、体 内靶向性分布以及具有更强的疗效。
二是多样性，主要表现在靶抗原的多样性、抗体 结构的多样性、作用机制的多样性等方面。
三是定向性，抗体药物可以定向制造，就是根据 需要制备具有不同治疗作用的抗体药物。基于这些特 点，我们可以用来制成“生物导弹”运送药物至病害 部位，主要是癌细胞，从而达到治疗效果。
淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA 合成的主要途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡； HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻
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步骤六 特异性抗体的检测
对检测方法的要求：灵敏度高 特异性强 简便快速
常用检测方法：ELISA、免疫荧光法
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ELISA
ELISA原理：
将抗原包被于酶标板，与待检杂交瘤细胞上清液反应， 如该上清液中含有特异性的抗体（一抗Ab），即可与 酶标二抗作用，加底物经酶催化呈现颜色反应，通过 检测OD值判定结果。
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创立者：
1975年 Kohler
&
Milstein
创立单克隆抗体技术，获得1984年诺贝尔医学和生理 学奖
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单抗概况
1975年分子生物学家G.J.F. Kohler和C. Milstein在 细胞杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，使经绵 羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠的脾细胞，与小鼠的骨髓 瘤细胞融合，并由此创建了第一个B细胞杂交瘤细胞 株，获得了抗SRBC的单克隆抗体。这是免疫学乃至医 学史上的一个里程碑。
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步骤三 饲养层细胞的准备
常用饲养细胞：小鼠腹腔巨噬细胞， 小鼠脾细胞，小鼠或大鼠胸腺细胞等。
单抗制备的详细步骤
单抗制备的详细步骤单抗，也被称为抗体药物，是一种能够识别和结合特定分子的抗体衍生物。
制备单抗的过程通常涉及从动物源中获得特异性抗体、制备抗原以及进行抗体组装和纯化等步骤。
下面是单抗制备的详细步骤：第一步：抗原选择与制备抗原是单抗开发的基础，因此抗原选择至关重要。
一般来说，抗原可以是多肽、蛋白质、细胞表面蛋白或其他重要的识别物质。
抗原的制备可以通过合成化学方法或从相关生物样本中提取制备。
第二步：免疫化学动物一旦获得了抗原，下一步是选择合适的实验动物，并进行免疫化学动物。
常见的实验动物包括小鼠、兔子、狗、大猩猩等。
免疫化学动物的目的是刺激动物的免疫系统产生特异性抗体。
第三步：抗体筛选与克隆在动物体内完成免疫程序后，需要收集动物的血浆或脾细胞等样本，进行抗体的筛选和克隆。
常用的抗体筛选方法包括ELISA、免疫磁球分离等。
选出具有高效结合抗原且具有特异性的单克隆抗体细胞，并将其单克隆化。
第四步：抗体生产与纯化一旦获得了单克隆抗体细胞，接下来就需要进行大规模的抗体生产。
最常用的方法是将单克隆抗体细胞悬浮于培养基中，并使用细胞培养技术进行大规模培养。
培养时间可以根据需要进行调整，通常需要数天至数周。
之后，可以通过离心、滤过等方法收集抗体，然后进行纯化。
第五步：抗体表征为了确保获得的单克隆抗体质量良好，需要进行抗体的表征。
常用的表征方法包括西方印迹分析、免疫组化等。
这些方法可以检验抗体在特定条件下的表达水平、特异性和亲和力等相关特性。
第六步：药物开发与临床研究一旦获得了具有良好特性的单克隆抗体，接下来就可以进行药物开发和临床研究。
在这个阶段，需要进行药物的安全性和疗效评估，以及大规模生产和制药工艺的优化。
单抗制备是一个复杂而严谨的过程，涉及到多个步骤和技术。
制备出高质量的单抗药物对于疾病治疗和生物医学研究具有重要意义。
随着技术的不断进步，单抗制备的效率和质量将不断提高，为医药领域带来更多机会和挑战。
mrna 单抗制备
mRNA单抗制备主要包括以下步骤：1. 从冷库中提取DNA：从主细胞库中提取新冠病毒的DNA，这里所说的DNA中会涵盖名为质粒的DNA小环，也是疫苗的原料，会被技术员提取后保存在-150摄氏度的小实验瓶中。
2. 促使细胞成长繁殖：把解冻了的质粒注入进一批已经做了人工调整了的大肠杆菌里，从而使大肠杆菌把质粒带入自己细胞里。
涵盖了大肠杆菌以及质粒的细胞将会被装在实验瓶中，并且在一种温暖无菌的琥珀色生长培养基中生长与繁殖。
3. 发酵混合物（细菌）：以上提到的细菌会被给予一晚的时间进行生长繁殖，然后会被转移至一个拥有营养液的容器中，并且存放数天。
在此期间，细菌会繁殖并复制大量的DNA质粒。
4. 采集并净化DNA：发酵过程结束后，研究员会往里注入一种化学物质来分解细菌的细胞墙，随后会净化混合物，并且最终提取到仅留的质粒。
5. 质量检测：被提取出来的质粒将会被技术员通过和之前的样品进行对比，以确认刚刚生产的质粒的病毒基因序列并未出现变异，并且能够被用于生产疫苗。
6. 切割质粒：如果质粒顺利通过了质量检测，技术员将会再往混合物里面加入一种酵素。
加入这种酵素的主要目的是把环状质粒切割开来，把病毒基因从环状状态切割成直线段。
以上过程又被成为线性化。
7. 净化DNA：技术员将会再一次给已经很纯了的混合物进行净化，用于滤出任何残留的细菌或质粒片段。
最终生产结果为纯净的DNA。
8. 制备mRNA：以线性化质粒为模板，体外转录生成编码抗体重链和轻链的mRNA。
转录体系中可加入修饰成分获得核苷酸修饰的mRNA。
9. 体外表达：将mRNA转染至多种细胞系，一定时间后可检测到抗体的表达。
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抗D-二聚体单克隆抗体的制备和鉴定1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 动物和细胞6周龄BALB/c雌鼠，体重18～22g，购于武汉大学实验动物中心；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞。
1.1.2 试剂小牛血清（NCS）——56℃灭活30分钟过滤除菌、HT及HAT选择培养液（筛选杂交瘤细胞，Sigma 公司）、8-氮杂鸟嘌呤（8-azaguanine）、RPMI 1640、Hank's液、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG （HRP-GAM-IgG）及鼠源McAb亚类检测试剂盒（Sigma公司/ Roche公司）、Western blot 试剂盒（Roche 公司）、96孔和24孔细胞培养板、5%脱脂奶粉、ELISA板、FPLC（快速蛋白液相层析）、弗氏完全和不完全佐剂（Sigma公司）、D-二聚体标准品、台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒（Sigma公司）、二甲基亚砜（DMSO，分析纯）、75%酒精。
1.1.3 主要仪器设备CO2培养箱、液氮、细胞计数板、酒精灯、玻璃平皿、平底烧瓶、200目不锈钢网筛、细胞培养板、培养瓶、解剖器械（剪刀和镊子）、加样枪及枪头（黄，蓝，白）、一次性无菌塑料离心管（15ml）、滤菌器、PH试纸、酶标仪、蛋白检测仪、蛋白纯化系统、高速冷冻离心机、低速大容量多管离心机、层析柱、倒置显微镜、电热干燥箱。
1.2 方法1.2.1 动物免疫首次免疫以100ug D-二聚体+完全佐剂按1：1乳化，于小鼠颈背部皮下多点注射；第二次和第三次改为不完全佐剂，其他免疫指标不变，于小鼠颈背部皮下多点注射。
注射量均为0.3ml/只。
1.2.2 ELISA法测定小鼠血清效价小鼠血清抗体效价应>1:10 000，融合前3天加强免疫一次。
1.2.3细胞融合前的准备1.2.3.1 骨髓瘤（浆细胞瘤）细胞的选择和培养：骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
常用骨髓瘤细胞系有：SP2／0、NS1、P3/X63-Ag8.653等。
骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞浓度以104～105/ml为宜，最大密度不得超106／ml，一般扩大培养以1：3～1∶10稀释传代，传代培养要保持细胞的对数生长期（约105细胞/毫升，细胞形态规则要一致，圆而亮，有一定的立体感，机能要活跃，活细胞数在90—95%以上。
要得到这种细胞，其培养技巧在于，在融合前24小时，将生长良好的细胞全部自瓶壁冲下来，并除去1/2或更多的细胞，加入新鲜培养液令细胞重新贴壁分裂增繁），每3～5天传代一次，细胞的倍增时间为16～20小时，一般可间隔3天更换一次培养液（一般一传三或把一瓶细胞弃去一半后再一传二，这样24小时后又全部长满。
）。
细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮杂鸟嘌呤进行处理（15～20ug／ml），HGPRT阳性细胞利用8-AG后，合成毒性核苷酸而死亡，只有HGPRT阴性细胞能持续生长，从而避免细胞的返祖现象，使生存的细胞对HA T呈均一的敏感性。
上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁（半贴壁）生长，无须用姨蛋白酶消化，直接用吸管轻轻吹打即可使细胞分散。
骨髓瘤细胞的最高生长浓度为9X105／ml，倍增时间通常为10～15h。
一般在准备融合前两周就应开始复苏骨髓瘤细胞（融合前经8-氮杂鸟嘌呤筛选2周）。
用于融合试验前必须做对HAT选择培养基敏感性试验。
由于HGPRT酶缺损，DNA合成障碍细胞应发生死亡，否则有变异，不能用于试验。
为阻止出现返祖现象，确保该细胞对HAT的敏感性，在筛选建株时应在含8-氮杂鸟嘌呤致死剂的培养液中（20～30mg/L）培养一代后（条件摸索：两代），换成常规培养基培养。
融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于95％），在细胞融合前1天用新鲜培养基调细胞浓度为2×105／ml，一般次日即为对数生长期细胞。
每3～6月应用8-AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
复苏的主要步骤及注意事项见《医用细胞工程》第111页。
1.2.3.2 免疫脾细胞的制备：免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞一般取最后一次加强免疫3天以后（第4天，融合当天）的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
脾细胞悬液的制备：a 摘除小鼠眼球放血，留作阳性对照。
b 拉颈处死小鼠，用75%的酒精浸泡消毒小鼠皮毛3～5分钟。
c 无菌条件下打开腹腔取出脾脏，去除脂肪和结缔组织，用无血清的培养液（1640）或Hank's液洗去红细胞。
d 置不锈钢筛网上用注射器内芯研磨成细胞悬液后吸入小试管中，直立小试管3 min使大块的结缔组织下沉，把脾细胞悬液吸入离心管中（不锈钢筛网置于玻璃平皿中，加入洗液，用注射器内芯研磨好后，再用适量洗液将不锈钢筛网上的脾细胞冲入平皿）。
e 用洗液洗2次，再用无血清1640洗一次。
洗液充满离心管，经1000 r / min离心5 min（与此同时开始制备骨骼瘤细胞）。
f 弃上清加入完全培养基（10%FCS的RPMI 1640），用吸管吹打分散，收集上层悬液，除去沉下的大块。
g 用计数板进行细胞计数（第125页），细胞计数，并用培养基调整适当的细胞浓度（1～２×10８/L左右）置室温待融合用；以台盼兰染色用显微镜检查，活细胞数应高于80%为合格。
一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为1～２.5×10８/L左右。
1.2.3.3 饲养细胞的制备：为防止细胞融合时因损伤而难以生长、促进杂交瘤细胞生长、增加克隆数，常需制备饲养层细胞。
可用肉汤刺激小鼠腹腔并收获腹腔中的巨噬细胞，该细胞有助于清洁培养表面和吞噬死亡细胞。
小鼠腹腔巨噬细胞的制备：小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄↓拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟↓用无菌剪刀剪开腹部一小口，剥开皮肤，露出腹腔↓用无菌注射器注入5ml培养液↓反复冲洗，吸出液体/ 右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹1min，抽回腹腔内液体↓放入10ml离心管，1000转／分离心10min洗一次↓用10％小牛血清（NCS）选择培养液（HAT）混悬10～15ml；台盼兰染色计数活细胞，并调整细胞数至1～2×10５／ml。
（如果融合后发现培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再入一些。
）↓加入96孔？板包板培养，100μl／孔↓放入37℃CO2孵箱培养一般在融合前一天制备饲养细胞，一只小鼠可获得3～5×106个腹腔巨噬细胞，可供一次融合用，亦可取两只小鼠腹腔巨噬细胞混合使用。
此外，同系小鼠胸腺细胞和脾细胞等亦可作为饲养细胞。
若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml，小鼠的成纤维细胞（3T3）1×105／ml，均为100μl／孔。
在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染。
1.2.4细胞电融合用电融合仪进行细胞融合，骨髓瘤细胞与脾细胞的比值1：1（也可进行条件摸索，1：2、1：3等）。
融合后沉淀细胞悬浮于24 ml （不够可以少加一些）HA T培养基中，将细胞分种于含饲养细胞的24孔板中，0.5 ml /孔，置37℃、5%CO2培养箱中培养，每3～5天半量换HAT培养（吸出1/2旧液），15天后改用HT培养基，3周后改用普通完全培养液（完全RPMI 1640培养基）。
1.2.5HAT选择杂交瘤细胞及Ab检测筛选阳性细胞克隆融合后，大多数实验室在融合当天就加入HAT培养液，也可次日加入。
一般在融合后7～14天内使用HA T培养液，然后改用HT培养液（15天后）。
3～5天后未融合及自身融合的细胞逐渐死亡，1周左右可出现克隆，并不断增殖，一般在杂交瘤细胞布满孔底1/3～1/2面积时（约培养8～12天），即可取培养上清液进行特异性抗体检测，筛选出所需要的杂交瘤细胞系，同时补加新鲜培养液。
一旦检测到分泌预定抗体的克隆，应及时将阳性克隆转入培养瓶扩大培养，冻存部分克隆细胞，并尽快进行克隆化培养。
可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。
在一次较好的融合试验中，约70～80％孔有克隆生长。
所有生长克隆的孔都需要取培养上清液进行抗体活性检测。
检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。
本试验选用ELISA法，可用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测。
1.2.6杂交瘤阳性克隆化并扩大培养和细胞冻存克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。
经过HA T筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。
在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。
要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。
克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。
即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。
1.2.6.1 有限稀释法的程序①阳性克隆化前一天制备饲养细胞悬液（同融合前准备）。
②取对数生长期的阳性孔细胞制成悬液，经台盼蓝染色计数，测定活细胞数及浓度（细胞存活率及单个细胞百分率应高于90%以上），用培养基在试管中稀释调整细胞数至1～5×10３／ml。
③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液（HT-1640，10%NCS），即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排（96孔板，每排12孔）为每孔2个细胞。
余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。
余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。
④次日在倒置显微镜下观察培养板各孔中的细胞数，挑选只含一个细胞的孔，做好标记并补加100ul 培养液继续培养。
⑤培养期间，视PH值的变化决定是否换液或补加培养液，1周左右，孔中有明显克隆出现（肉眼可见细胞克隆），及时进行抗体检测，扩大培养（待长至孔底面的1/3～1/2时，可将96孔中的单一克隆的细胞分别移至24孔板中进行扩大培养）并冻存细胞。