流式细胞仪现状与临床应用进展

流式细胞仪现状与临床应用进展

北京大学第一医院检验科

吴煦，王建中

作者吴煦，毕业于北京医科大学医学检验专业，在美国BD公司生命科学部从事流式细胞仪及其相关产品的技术应用支持工作，现在北京大学第一附属医院检验科攻读硕士学位，师从王建中教授。

摘要：本文主要介绍了流式细胞仪以及新发展的仪器检测技术和目前主要的临床应用，包括细胞免疫表型分析，红细胞和血小板分析，细胞功能分析，以及细胞DNA分析等；最后介绍了临床流式细胞分析应用的新进展和新的应用领域，以及流式细胞术应用于细胞组学提供预测医学信息的概况。

关键词：流式细胞术，流式荧光定量分析，流式微球技术，流式细胞原位杂交分析，细胞组学

Status Quo and Clinical Application Development of Flow Cytometry Clinical Laboratory, Peking University First Hospital

Xu Wu, Jianzhong Wang

ABSTRACT: This article introduced flow cytometry techniques, and presently major clinical applications, such as immunophenotyping, red blood cell and platelet analysis, cell function analysis, and DNA analysis. Finally, it introduced newly exploited clinical applications and new diagnostic fields of flow cytometry, and cytomics by flow cytometry to provide diagnostics information as predictive medicine.

KEY WORDS: Flow cytometry, Quantitative flow cytometry, Cytometric bead array, Flow-FISH, Cytomics

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对处在液流中的细胞或其他生物微粒，以及人工合成微球逐个进行多种物理或生物学特征快速定量分析和分选的技术[1]。流式细胞仪是测量细胞的散射光和标记荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量，并分类收集的高精密仪器。流式细胞仪可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个细胞特征参数，进行定性或定量分析，具有速度快、精度高、准确性好等特点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。如今，流式细胞仪（图1，最常用的流式细胞仪，配备双色激光器）以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特点，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，如细胞生物学、细胞遗传学、生物化学、免疫学、肿瘤学、血液学等。

图1：BD公司临床型流式细胞仪FACSCalibur

一、流式细胞仪工作原理

将待测细胞制成经荧光染色的单细胞悬液，在一定压力驱动和鞘液包绕作用下，细胞排成单列高速通过流动室，形成细胞液柱。当液柱中的细胞通过检测区时，在激光光源照射下，产生散射光和荧光信号。光散射信号分为前向角散射光（FSC）和侧向角散射光（SSC），它们分别反映细胞的大小和颗粒度，根据这些特性可以初步将细胞分类。经过一种或几种荧光标记的样本，在激光束的激发下，可以产生特定波段的荧光，荧光信号的接收方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片，几种不同波长的荧光信号被分离开来，由相应荧光检测器接收，这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或细胞内物质的浓度。接收的光信号最终转换为可被计算机识别的数字信号，输送到计算机中进行分析，进而得到相应细胞的各种特性分布和计数结果（图2）。

FL2

SSC

FL1

FSC Time

FL3

FL4

Time

图2：流式细胞仪的工作原理

一些流式细胞仪还可以通过物理加电或机械的方法将感兴趣的细胞分选出来。分选标准由细胞分析参数而定，还可以根据特定参数的强度来定。通常，流式细胞仪分选细胞是通过分离收集含有目的细胞的液滴来实现的。流动室的喷嘴在超高频的压电晶体作用下产生高频振动，使喷出的液流断裂为均匀液滴，含有待分选细胞的液滴将被充以正负不同的电荷，经过带电偏转板时，在高压电场的作用下，带电液滴偏转，落入相应的细胞收集管中，不予充电的液滴则落入中间的废液吸引器，这样就可以得到所需要的分离纯化的细胞了。

二、临床流式细胞仪的技术进展

近年来，流式细胞仪技术迅速发展，应用日趋广泛，其主要技术趋势有：

1．多激光，多色分析：在临床上，流式细胞仪的发展经由了最早的双色荧光分析，到三色荧光分析，到现在的四色荧光分析流式细胞仪。目前临床上广泛使

用的是单激光三色或双激光四色分析流式细胞仪。近年，为了使样本一次检测更多结果，满足临床多色分析诊断的需要，一些厂家为临床应用专门设计了六色分析流式细胞仪，如BD公司的FACSCanto（图3），这一新型流式细胞仪安装固定校准的双激光，可同时作六荧光分析。为了增加检测参数而不影响检测灵敏度，仪器采用了新型光路信号收集检测技术，利用光反射大于光透射的原理，被接收的荧光信号经过一系列双色性反射镜，几种不同波长的荧光信号经过几次反射，被分离开来，光路信号收集系统收集检测反射光信号，而被检测的信号透过反射镜，由相应荧光检测器接收。这样，在增加荧光检测器的同时，大大提高了信号检测灵敏度。

图3：FACSCanto六色流式细胞仪

2．新荧光染料的开发：由于多色分析的需要，人们发现了更多的不同激光激发的不同波长的荧光染料。如紫外光激发的Pacific Blue，Alexa Fluora 405；蓝光激发的Alexa Fluora 488；红光激发的Alexa Fluora 647等。另外，为了使用一个激光器，同时检测更长波长的荧光信号，还使用荧光耦连物，如PE-Cy5，Cy5为吲哚双羰花青衍生物，最大吸收峰为640nm，单独使用时可被红光激发，在安装488nm激光的流式细胞以上，PE被激发光激发，其发射的红光能量被传递给Cy5，仪器上检测到的信号是Cy5发射的红光。这类荧光染料还有PE-Cy7，APC-Cy7，PerCP-Cy5.5等。