免疫荧光三重标记具体方法及步骤
免疫荧光技术实验步骤及方法
免疫荧光技术实验步骤及方法免疫荧光是标记免疫技术发展最早的一种，它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，通过将抗体与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
10个关键点免疫荧光步骤包括，细胞固定和通透，封闭，孵育一抗，二抗等。
除了这些基本步骤，以下建议可以帮助您获得更好的实验结果。
1、选择合适的细胞种板密度细胞数过多时，生长过密，细胞结构不清，易导致染色背景深，细胞数过少时，会使贴壁贴壁不佳，状态不好，一般以六孔板为例，（1-5）×100000比较适宜。
2、细胞固定和通透为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。
这些步骤非常关键，细胞和抗原需要保证最佳的结构，并利于抗体与抗原结合。
现在固定液选择比较多，有4%多聚甲醛、甲醇、乙醇、丙酮以及丙酮和甲醇混合液（1：1），但效果最好的应用最多的还是推荐4%多聚甲醛。
之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100进行通透。
前者是比较温柔的处理，但是对于核内抗原可能无效，需要用到Triton。
使用皂角苷进行通透时，要注意它会引起细胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每个抗体孵育环节都需要进行通透。
另外，细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透，可以避免去垢剂的使用。
3、抗体特异性免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。
在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精准定位抗原。
使用只有二抗染色的片子作为阴性对照，有利于减少降低背景干扰。
4、合适的抗体稀释比例通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下1ug/ml的纯化抗体或者1:100-1:1000的抗血清足够达到特异性染色的结果。
但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。
如果是第一次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。
5、优化缓冲液和封闭剂尽管很多抗原在常见的Buffer如PBS中可以很好的被染色，但是对于某些目的抗原，更换一下含有不同离子的缓冲液，比如钙、镁、钾等，可以带来很大程度上的改善。
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光操作步骤及注意事项免疫荧光技术是一种常用的免疫学研究方法，可以用于检测和定位抗原或抗体在细胞或组织中的表达和定位。
免疫荧光操作步骤及注意事项如下：步骤1：样品制备1.收集需要检测的细胞或组织样品。
2.如有需要，固定细胞或组织样品以保持其形态和抗原性。
3.如有需要，对组织样品进行切片以便于检测。
步骤2：抗体选择和标记1.根据需要选择合适的一抗和二抗，一抗用于识别目标抗原，二抗用于与一抗结合并携带荧光标记。
2. 选择合适的荧光染料或荧光标记，常用的有荧光素色素（FITC）、罗丹明（Rhodamine）等。
3.根据供应商指南或经典实验文献中的方法，进行抗体标记。
步骤3：荧光标记试剂的制备1.根据推荐的配方或说明书，在标记试剂的缓冲液中加入合适的荧光染料或荧光标记，并进行充分混匀。
2.如有需要，可以在标记试剂中加入其他辅助试剂以增强染色强度或减少非特异性结合。
步骤4：样品孵育1.将样品均匀分布在载玻片或孵育板上，并使其附着。
2.加入一抗和二抗的混合物，并在暗处孵育一段时间，通常在室温下孵育1-2小时或在4°C下孵育过夜。
3.如果需要，可以在抗体孵育结束后进行染色或共孵育其他标记试剂。
步骤5：洗涤1.在孵育结束后，用洗涤缓冲液洗涤样品，以去除未结合的抗体和其他杂质。
2.洗涤次数根据需要，通常进行3-5次洗涤，每次洗涤时间约5分钟。
步骤6：显微镜观察和成像1.将标本置于显微镜上，并使用荧光显微镜或倒置显微镜观察荧光信号。
2.使用合适的荧光滤光片或滤片盒，选择适当的波长来显现荧光染色。
3.根据需要，使用数字相机或图像分析软件进行图像采集和分析。
注意事项：1.仪器和试剂的准备与操作一定要在无菌和干净的条件下进行，以避免外源性污染或感染的发生。
2.使用抗体和试剂前请仔细阅读供应商提供的说明书，遵守推荐的使用和储存条件。
3.一抗和二抗的选取要慎重，确保其与目标抗原或抗体具有高度特异性。
4.荧光标记试剂的制备要注意在无菌和干净的条件下进行，避免污染或降低荧光标记效果。
细胞免疫荧光的方法(自己实践记录)
细胞免疫荧光I、步骤：一、固定：PBS 5min×3次振荡洗涤制作好的细胞爬片。
固定液覆盖细胞，RT 静置15min。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
二、通透化：通透液覆盖细胞，RT 静置30min。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
三、封闭：封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h。
四、一抗孵育：一抗以合适浓度稀释PBS，覆盖标本表面。
4℃孵育过夜，第二天37℃复温1h。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
五、二抗孵育：FITC标记二抗以合适浓度稀释于PBS，覆盖标本表面。
37℃避光孵育<60min。
PBS 5min×3次避光振荡洗涤。
六、染核：新鲜稀释Hoechst覆盖细胞表面，RT避光静置<10min。
PBS 5min×3次避光振荡洗涤。
七、封片：在干净的载玻片上滴一滴封片剂，将爬片的细胞面扣在封片剂上。
八、镜检，4℃避光保存。
II、注：1、细胞密度要合适，状态较好。
2、从孵育二抗开始要避光（关闭室内日光灯即可）。
3、完成后最好及时镜检，照相；分别用不同波长激发荧光，在Photoshop软件下合成一张图。
III、试剂配制：1、固定液：4%多聚甲醛/PBS：4g多聚甲醛，50～80mlPBS，加热至60℃，持续搅拌至完全溶解，（通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮），定容100ml，RT保存。
2、通透液：0.5 %(v/v)TritonX-100/PBS3、封闭液：正常山羊血清稀释于PBS；或商品化封闭液成品。
4、Hoechst：Hoechst33258即可。
5、封片剂：50%(v/v)甘油/PBS。
细胞免疫荧光标记实验步骤
细胞免疫荧光标记实验步骤细胞免疫荧光标记实验是用来观察和分析细胞中的特定分子或结构的一种常用方法。
下面是一些常见的细胞免疫荧光标记实验步骤：1. 细胞培养准备:- 在无菌条件下准备所需培养基和培养器具。
- 将待标记细胞接种在培养皿中，以适当的细胞密度使其在培养基中生长。
2. 固定细胞:- 将细胞培养皿中的培养基倒掉。
- 用生理盐水或磷酸缓冲液轻轻洗涤细胞，以去除未附着的细胞和培养基残留。
- 加入适当的固定液，例如4%的乙醛，固定细胞并封存其内部结构。
3. 渗透化处理:- 使用适当的渗透剂，如0.1%的Triton X-100，以打破细胞膜，使抗体能够渗透到细胞内部。
- 进行渗透化处理的时间应根据实验要求而定。
4. 抗体标记:- 制备适当的抗体和荧光染料稀释液。
- 将抗体稀释液加入到细胞上，使其与目标分子结合。
- 按照实验要求，在适当的温度和时长下孵育细胞，促使抗体与目标分子充分结合。
5. 洗涤和染色:- 用洗涤缓冲液充分洗涤细胞，以去除未结合的抗体和荧光染料。
- 使用适当的荧光染料对细胞进行染色。
如需防褪色，可以添加适当的抑制剂。
6. 显微镜观察和图像捕获:- 用适当的显微镜观察细胞，并捕获荧光图像。
- 根据需要，使用图像处理软件对图像进行分析和量化。
注意事项：- 实验前确保实验室和设备都是清洁的，并遵守实验安全操作规范。
- 涉及有害物质时，戴好个人防护用品，如实验手套和护目镜。
- 每个实验步骤的时间和条件可能因实验要求而异，需根据具体实验方案进行调整。
这些步骤提供了一般的细胞免疫荧光标记实验的大致流程，但具体实验方法还需根据实验目的和材料的特性进行优化和调整。
参考资料：[1] Smith, C. et al. ___. Cold Spring Harb. Protoc. 7, 1052–1055 (2013).[2] Manders, E. M. M. et al. FISH: ___. Cold Spring Harb. Protoc. 2006, db.rot4111 (2006).。
细胞免疫荧光的方法(自己实践记录)
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
免疫荧光三色染色步骤
免疫荧光三色染色步骤免疫荧光三色染色是一种常用的免疫组化技术，用于检测和定位细胞或组织中的特定抗原。
通过使用三种不同的荧光染料，可以同时检测三种不同的抗原，从而在同一样本中获得更多的信息。
下面是免疫荧光三色染色的步骤：1. 样本处理：首先需要准备好待检测的细胞或组织样本。
可以通过固定、切片和脱脂等步骤来处理样本，以便于荧光染料的渗透和抗原的暴露。
2. 抗原修复：某些细胞或组织中的抗原可能会经历一定程度的损伤或变性，需要进行抗原修复以恢复其免疫反应性。
常用的抗原修复方法包括热处理、酶解和化学修复等。
3. 阻断非特异性结合：为了避免荧光染料的非特异性结合，需要使用适当的阻断剂来防止非特异性结合。
常用的阻断剂包括牛血清蛋白、小鼠或兔子血清等。
4. 一抗染色：选择合适的一抗，加入到样本中与目标抗原结合。
一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体，根据实验的需要选择合适的一抗。
5. 二抗染色：二抗是与一抗结合的抗体，通常是兔抗小鼠或小鼠抗兔的抗体。
二抗上标记有荧光染料，常见的有荧光素、荧光素同工酶和荧光素同工酶等。
6. 染色显色：将标记有荧光染料的二抗加入到样本中，与一抗所结合的抗原发生特异性反应，形成荧光染色的复合物。
7. 洗涤：染色完成后，需要进行多次洗涤以去除未结合的抗体和荧光染料，减少背景信号的干扰。
8. 封片：将处理好的样本用适当的封片剂封装在载玻片上，然后使用适当的封片胶或胶带固定样本。
通过以上步骤，可以实现免疫荧光三色染色的目的。
这种技术可以在细胞或组织中同时检测和定位多种抗原，为科研工作者提供更多的信息和数据。
需要注意的是，在进行免疫荧光三色染色时，要选择合适的一抗和二抗，以及荧光染料的激发和发射波长。
此外，还需要进行严格的实验控制，包括阴性对照和阳性对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫荧光三色染色技术在生命科学研究中具有广泛的应用，可以用于研究细胞分子机制、疾病诊断和治疗等方面。
随着技术的不断发展和改进，相信免疫荧光三色染色技术将在未来的研究中发挥更大的作用。
培养细胞的免疫荧光标记方法
培养细胞的免疫荧光标记方法
培养细胞用PBS分三次取代培养皿中的培液，取出盖玻片置于PBS中，在预冷的4%PFA 中4︒C固定30min，PBS洗去固定液。
1、培养细胞的免疫荧光反应：（免疫荧光反应在密闭避光的湿盒中进行，以保持抗体作用浓度、及稳定性）
经固定的培养细胞盖玻片
↓
0.05%Triton 室温5min
↓
PBS 5min ⨯ 2
↓
含0.5%NS、1%BSA的PBS中室温封闭30min~1hr
↓
一抗（稀释过）室温1~1.5hr或4︒C 过夜
↓
PBS 10min ⨯ 3
↓
二抗-荧光基团（稀释过）室温30min~1hr
↓
PBS 10min ⨯ 3
↓
DAPI（稀释过）室温5-10 min
↓
PBS 5min ⨯ 2
↓
荧光封固剂封片
↓
4︒C或-20︒C避光保存
2、培养细胞的免疫荧光双标记方法：
免疫标记方法与上述方法相同，不同种属来源的两个一抗可同时加入反应液中，同样，两种相应的二抗也可同时加入反应液中。
[教材]免疫荧光操作步骤及注意事项
![[教材]免疫荧光操作步骤及注意事项](https://img.taocdn.com/s3/m/bfd95ed44128915f804d2b160b4e767f5acf80ab.png)
免疫荧光操作步骤及注意事项一. 直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制搪瓷桶三只（内有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。
实验步骤1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间（参考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 冲洗后，再按顺序过 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++--++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在 1：20-100 之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从 10 min 到数小时，一般 30 min 已足够。
培养细胞的免疫荧光标记步骤
培养细胞的免疫荧光标记材料：（1）4%的仲甲醛：在一个玻璃瓶内，加热50 ml Mili-Q 水到60度。
加入2.4g仲甲醛粉到瓶内，在温度60度情况下，不断搅拌溶液。
加入10 µl 2N NaOH溶液去溶解粉末。
一旦溶液变得澄清，加入6 ml 10 x PBS，同时使之冷却到室温。
然后，调pH 到7.4，用Mili-Q 水调体积到60 ml。
（2）PBS buffer，细胞培养级（3）PBS/BSA: 2-5% BSA in PBS（4）一抗（5）对照：免疫前血清（如果使用兔多克隆抗体）或抗原，加入过量一抗（6）二抗：（与特定一抗来源地Ig种类相互作用）（7）延长抗褪色试剂盒（分子探针）：加入1 ml mounting介质到含有试剂粉的小瓶中，溶解备用试验步骤：（1）对于贴壁细胞，在试验前一天用胰酶处理细胞，并且接种到六孔板，每个孔包含一个灭菌的纤连蛋白包被的盖玻片，目的在于第二天试验时，细胞长到20% to 50%密度非贴壁细胞能被包被粘连到盖玻片上，通过提前包被盖玻片用多级赖氨酸。
将10 to 20 ul悬浮细胞滴到每个盖玻片上，静置10min ,然后进行固定或者，通过根据制造商的使用手册使用细胞离心机，将细胞连接在盖玻片上（2）置于细胞于想要的试验条件（例如，在固定和免疫染色之前，用不同的药物处理、抑制剂、或者温度改变（3）吸取培养基，加入1-2 ml 4%的仲甲醛到每个孔中，让细胞在室温下固定15-30 min.（4）吸取固定buffer，洗涤盖玻片3次，每次通过加入2 ml pH 7.4的PBS，然后洗掉PBS（5）用PBS-0.5% Triton X 100浸润细胞5 min.（6）如第四步一样洗涤（7）加入1 ml PBS/BSA到固定的盖玻片，让其静置30 min来封闭非特异的抗体结合位点注意：经过这个步骤后，不要让细胞干燥（8）在1.5 ml微型管内用PBS/BSA稀释一抗到10 µg/ml对于多克隆抗体，或者1µg/ml对于单克隆抗体而言在起始的确定特征过程中，建议设立一系列的浓度梯度（9）准备只包含PBS/BSA的对照组，或者如果有价值的话，准备包含免疫前血清的对照组（如果兔多克隆抗体正被使用），或者特异性的一抗（用过量抗原封闭过）（10）加入200ul的适合的一抗溶液到每个有盖玻片的孔中，室温下温育1 hr（11）洗涤每个盖玻片三次，以去除非特异结合的抗体，每次洗涤时，加入3 ml PBS，然后吸出溶液（12）用PBS/BSA以1:75-150的比例稀释免疫荧光物质结合的二抗（13）加入200 µl适合的二抗溶液到到每个包含盖玻片的孔中，用铝箔纸盖住六孔板以免光的影响，或者将其置于抽屉中，室温下温育1 hr（14）如第11步，洗涤盖玻片，待最后的PBS去除后，加入1 ml PBS. （15）标记slides，滴入一滴mounting溶液（延长抗褪色试剂盒）到slides上。
免疫荧光技术原理与步骤
免疫荧光技术原理与步骤
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。
它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。
主要用于检测细胞内物质的定性、定位、定量及动态变化。
免疫荧光技术的基本原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来检测目标分子。
具体步骤如下：
1. 制备样本：将要检测的样本制备成适当的形式，如细胞涂片、组织切片等。
2. 固定样本：使用适当的固定剂将样本固定，以保持其形态和结构。
3. 抗原修复：对于某些样本，需要进行抗原修复以暴露抗原表位，使抗体能够更好地结合。
4. 封闭：使用适当的封闭液封闭样本表面的非特异性结合位点，以减少背景噪音。
5. 加一抗：将特异性的一抗加入样本中，使其与目标抗原结合。
6. 洗涤：洗涤样本以去除未结合的一抗。
7. 加二抗：将荧光标记的二抗加入样本中，使其与一抗结合。
8. 洗涤：再次洗涤样本以去除未结合的二抗。
9. 荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察样本，在合适的激发波长下，荧光标记的二抗将显示出荧光信号，从而指示目标抗原的存在和定位。
免疫荧光技术可以应用于多种领域，如细胞生物学、免疫学、遗传学等。
它不仅可以用于检测蛋白质、核酸等生物大分子，还可以用于检测细胞表面标志物、细胞内细胞器等。
需要注意的是，免疫荧光技术的结果解读需要结合荧光显微镜的成像特点和抗体的特异性等因素进行综合分析。
同时，在实验过程中需要严格控制实验条件，以确保结果的准确性和可靠性。
免疫荧光三标实验流程
Immunofluorescent ProtocolHearts were fixed in 4% paraformaldehyde overnight at room temperature. The following day, hearts were moved to 50% ethanol and stored for up to one week before paraffin embedding. Paraffin sections (5 μm) were cut through the entire ventricle. All immunofluorescence was performed on paraffin sections. For phosphohistoneH3/troponin T and Wt1/Troponin T co-staining, slides were rinsed 3 times in PBS, blocked in 10% goat serum for 20 minutes followed by 3 rinses in PBS. Sections underwent antigen retrieval by boiling in sodium citrate solution for 20 minutes. This was followed by overnight incubation with primary antibodies against phospho-histone H3 (Ser10) (1:100, rabbit polyclonal, Millipore, MA) or Wt1 (1:50, rabbit polyclonal, Santa Cruz Biotechnology, CA) and cardiac troponin T (1:100, mouse monoclonal, Thermo Scientific, IL). The following day, slides were washed 3 times in PBS and incubated with anti-mouse and anti-rabbit secondary antibodies conjugated to FITC or TRITC for 1 hour at room temperature. Slides were washed 3 times in PBS, stainedwith Hoechst 33342 or DAPI for 3 minutes to label nuclei and mounted in Vectashield.1.These protocols are from method and material of “Enzo R. Porrdllo, Ahmed I. Mahmoud, Emma Simpson, et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse Heart[J]. Science, 2011, 331(6020): 1078-108.”2.Harvard H&E staining Protocol免疫荧光三标实验方案Ab1与某种细胞表面抗原结合Ab2与某种细胞骨架DAPI标记细胞核一、脱蜡至水1. 石蜡切片56℃预热3h。
免疫荧光实验原理及其步骤
免疫荧光实验原理及其步骤免疫荧光实验是一种常用的生物学实验技术，用于检测和定位细胞或组织中特定的抗原或抗体。
其原理是利用荧光染料与抗原或抗体结合形成复合物，然后通过荧光显微镜观察荧光信号的强度和位置，从而确定目标物的存在和分布情况。
下面将详细介绍免疫荧光实验的步骤及其原理。
免疫荧光实验的步骤一般分为样品处理、抗体处理、荧光染色和观察四个主要步骤。
第一步是样品处理。
首先需要选择合适的样品，可以是细胞培养物、组织切片或动物体内的器官等。
样品处理的目的是使样品适应实验条件并提取目标物，一般包括固定、脱水和透明化等步骤。
固定可以采用乙醛或甲醛等化学物质，使细胞或组织保持形态结构。
脱水和透明化则是为了去除样品中的水分，并使其透明以便于观察。
第二步是抗体处理。
根据实验的需要，可以选择针对目标物的一抗或二抗进行处理。
一抗是指对目标物抗原的特异性抗体，二抗是指对一抗特异性结合的抗体。
抗体处理的目的是使抗体与目标物结合形成复合物，一般需要在适当的温度和时间下进行孵育。
在进行抗体处理之前，需要对样品进行预处理，如孵育样品以降低非特异性结合等。
第三步是荧光染色。
荧光染色是利用荧光染料标记抗体，以便于荧光显微镜观察。
常用的荧光染料有荧光素（fluorescein）和罗丹明（rhodamine）等。
荧光染色的原理是荧光染料与抗体结合后发射荧光信号，通过荧光显微镜可以观察到目标物的荧光信号。
荧光染色的过程包括将荧光染料溶液加入样品中，与抗体发生特异性结合，并进行洗涤以去除未结合的荧光染料。
最后一步是观察。
观察是通过荧光显微镜观察样品中的荧光信号，从而确定目标物的存在和分布情况。
观察时需要选择适当的荧光滤光片和荧光显微镜参数，以便于观察到荧光信号的强度和位置。
观察结果可以通过摄影或记录视频等方式保存下来，以便进一步分析和研究。
免疫荧光实验的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够诱导机体产生免疫应答的物质，可以是细菌、病毒、细胞表面的蛋白质等。
免疫荧光实验步骤+经验总结
免疫荧光实验步骤+经验总结
免疫荧光实验是一种用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的位置和表达水平的常用技术。
下面我将从步骤和经验总结两个方面来回答你的问题。
免疫荧光实验步骤：
1. 样本制备，首先，收集细胞或组织样本，然后进行固定和切片处理，以确保样本的完整性和稳定性。
2. 抗原修饰，样本经过透化处理后，使用适当的抗原修饰方法，如热处理或酶解，以增强抗体的结合效率。
3. 抗体孵育，将样本与特异性的一抗（一般为多克隆抗体）孵育，使其与目标蛋白结合。
4. 荧光二抗孵育，将荧光标记的二抗孵育，使其与一抗结合形成复合物。
5. 染色与显微镜观察，样本经过洗涤后，使用荧光显微镜观
察，检测目标蛋白在细胞或组织中的分布和表达水平。
免疫荧光实验经验总结：
1. 选择适当的抗体，选择具有高亲和力和特异性的抗体至关重要，可以通过文献综述或试验验证来确定抗体的适用性。
2. 优化实验条件，包括抗原修饰、抗体浓度、孵育时间等实验条件的优化，以确保信号强度和特异性。
3. 合理的阳性和阴性对照，使用已知表达目标蛋白的阳性对照和不表达目标蛋白的阴性对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。
4. 注意样本处理，样本处理的温和和一致性对实验结果至关重要，避免因处理不当导致假阳性或假阴性结果。
5. 数据分析和图像获取，在实验结束后，对荧光图像进行合理的获取和分析，避免图像处理过度或不足，确保结果的客观和准确。
以上是免疫荧光实验的步骤和经验总结，希望能够对你有所帮助。
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免疫荧光三标实验流程
免疫荧光三标实验流程Immunofluorescent ProtocolHearts were fixed in 4% paraformaldehyde overnight at room temperature. The following day, hearts were moved to 50% ethanol and stored for up to one week before paraffin embedding. Paraffin sections (5 μm) were cut through the entire ventricle. All immunofluorescence was performed on paraffin sections. For phosphohistoneH3/troponin T and Wt1/Troponin T co-staining, slides were rinsed 3 times in PBS, blocked in 10% goat serum for 20 minutes followed by 3 rinses in PBS. Sections underwent antigen retrieval by boiling in sodium citrate solution for 20 minutes. This was followed by overnight incubation with primary antibodies against phospho-histone H3 (Ser10) (1:100, rabbit polyclonal, Millipore, MA) or Wt1 (1:50, rabbit polyclonal, Santa Cruz Biotechnology, CA) and cardiac troponin T (1:100, mouse monoclonal, Thermo Scientific, IL). The following day, slides were washed 3 times in PBS and incubated with anti-mouse and anti-rabbit secondary antibodies conjugated to FITC or TRITC for 1 hour at room temperature. Slides were washed 3 times in PBS, stainedwith Hoechst 33342 or DAPI for 3 minutes to label nuclei and mounted in Vectashield.1.These protocols are from method and material of “Enzo R. Porrdllo, AhmedI. Mahmoud, Emma Simpson, et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse Heart[J]. Science, 2011, 331(6020): 1078-108.”2.Harvard H&E staining Protocol免疫荧光三标实验方案Ab1与某种细胞表面抗原结合Ab2与某种细胞骨架DAPI标记细胞核一、脱蜡至水1. 石蜡切片56℃预热3h。
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光实验步骤大全(精华版)免疫荧光染色大全（精华版）组织免疫荧光法1.将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1小时，脱蜡。
2.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
3.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。
4.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
注意：步骤3和4用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原可以直接跳过这一步骤。
5.进行抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3分钟，后转成低火15分钟。
6.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
7.在室温下，使用3% H2O2孵育30分钟，目的是灭活内源性过氧化物酶。
8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
9.使用1% BSA进行室温封闭30分钟，用于封闭非特异性抗原表位。
10.按照抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4℃湿盒中静置过夜。
11.次日取出切片，室温下复温30分钟。
12.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
13.选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37℃避光孵育30分钟。
14.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
15.在避光条件下，使用DAPI染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用。
16.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
17.在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。
18.使用荧光显微镜进行观察和拍照。
贴壁细胞免疫荧光法1.在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3分钟。
2.使用4%多聚甲醛固定细胞爬片15分钟。
3.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
4.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。
5.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
6.使用1% BSA室温封闭30分钟。
7.弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜。
8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
免疫荧光技术操作步骤
免疫荧光技术操作步骤 Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT免疫荧光技术操作步骤一. 直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：L，荧光标记的抗体溶液：以 L，的 PBS 进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ 碳酸盐缓冲液 1 份配制搪瓷桶三只（内有 L，的 PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。
实验步骤1. 滴加 L，的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间（参考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用 L，的 PBS 冲洗后，再按顺序过 L，的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++--++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在 1：20-100 之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从 10 min 到数小时，一般 30 min 已足够。
染色温度多采用室温（25℃左右），高于 37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用 0-2℃的低温，延长染色时间。
免疫荧光标记的方案
免疫荧光标记的方案一、实验前准备。
1. 材料收集。
首先呢，我们得把主角细胞或者组织样本准备好。
如果是细胞，就像呵护小宝贝一样，把培养的细胞从培养箱里温柔地取出来。
要是组织的话，就像对待珍贵的宝藏，小心地把组织切好，大小要合适，大概像小指甲盖那么大就行啦。
然后就是我们的荧光标记抗体，这可是这场派对的“魔法颜料”。
要根据我们想要标记的目标蛋白，从那些装满各种抗体的小瓶子里精挑细选出来。
还有固定液、通透液、封闭液这些小助手，一个都不能少。
2. 器材准备。
拿出干净的载玻片或者盖玻片，就像给小客人准备干净的座位一样。
还有多聚赖氨酸处理过的玻片，如果是细胞样本，这就像给细胞铺上了柔软的小毯子，让它们能舒舒服服地待着。
准备好微量移液器，这可是我们精确操作的小神器，就像小滴管一样，但是超级精准。
还有湿盒，这就像给样本打造的一个小小的“保湿房”，能让样本在实验过程中不会干巴巴的。
二、样本处理。
1. 固定。
如果是细胞，我们轻轻地把细胞培养液吸掉，就像给细胞洗个小澡，然后加入适量的固定液。
固定液就像给细胞拍了一张瞬间的照片，让它们保持住现在的模样。
一般用4%的多聚甲醛固定个15 30分钟就好啦。
对于组织样本呢，把切好的组织块放到固定液里浸泡，时间可以稍微长一点，大概30 60分钟。
2. 通透。
固定完了之后，细胞或者组织就像穿上了一层硬壳，这时候我们要用通透液来给它们开一些小通道，这样抗体才能进去找到目标蛋白。
对于细胞，用0.1% 0.5%的Triton X 100处理10 15分钟就可以啦。
组织的话，处理时间可能要稍微长一点，大概15 20分钟。
3. 封闭。
通透之后，样本表面就像有很多小坑坑洼洼，可能会吸引一些不必要的东西。
这时候我们要用封闭液来把这些小坑填满。
一般用5%的BSA（牛血清白蛋白）或者10%的正常血清，在室温下封闭30 60分钟。
这就像给样本穿上了一件防护服，只让我们想要的抗体进去。
三、免疫荧光标记。
1. 一抗孵育。
三重免疫荧光染色原理
三重免疫荧光染色原理
三重免疫荧光染色是一种用于检测细胞或组织中多种蛋白质表达的方法。
其原理是利用多种荧光标记的抗体同时与待检测的蛋白质结合，通过荧光显微镜观察不同荧光标记的抗体在细胞或组织中的分布情况，从而实现对多种蛋白质的定位和表达水平的检测。
在进行三重免疫荧光染色时，首先需要选择适当的一抗（primary antibody），这是针对待检测蛋白的特异性抗体，它将与待检测蛋白结合。
然后使用不同荧光标记的二抗（secondary antibody）结合到一抗上，这些二抗将分别与不同颜色的荧光染料结合。
最后，通过荧光显微镜观察样品，可以根据不同颜色的荧光信号来确定不同蛋白质的位置和表达水平。
三重免疫荧光染色的原理基于多种抗体和荧光标记的选择，以及对不同荧光信号的识别和分析。
通过合理设计实验方案和选择合适的抗体和荧光标记，可以同时检测多种蛋白质在细胞或组织中的表达情况，为细胞生物学和病理学研究提供重要的信息。
总的来说，三重免疫荧光染色原理是利用多种荧光标记的抗体同时与不同蛋白质结合，通过荧光显微镜观察不同荧光信号的位置
和强度，从而实现对多种蛋白质的定位和表达水平的检测。
这种方法在细胞生物学和病理学研究中具有重要的应用意义。
免疫荧光原理和步骤
免疫荧光原理和步骤
夫免疫荧光者，乃以荧光素与抗体结合，借荧光之光辉，观察抗原、抗体间之相互作用也。
其法，先以特异之抗体与待测之抗原相结合，继之以荧光素标记之二抗或直接荧光素标记之抗体，使之形成复合体。
于特定光源照射下，荧光素受激而发光，故能明察抗原之所在，且可定量其多寡。
此法之妙，在于荧光之明显与特异性之高，使微量之物质亦能被侦知。
步骤如下：
一曰制备标本，将所欲观照之物，置于载玻片之上，固定之，以备后续之用。
二曰阻断非特异结合，以蛋白或其他阻断液覆盖标本，俾除杂念，令抗体专注其职。
三曰加初抗，以特异抗体润之，使其与抗原相遇，如君子之交淡如水。
四曰洗去浮游之抗体，用清水冲洗，如洗尘垢，唯留所需。
五曰加二抗，或直标荧光素之抗体，如锦上添花，增其光彩。
六曰再次洗涤，去其杂质，如剥茧抽丝，得其精华。
七曰镜检，置之于荧光显微镜下，细观其变化，如观星辰，洞悉宇宙之奥妙。
八曰记录所得，以笔札之，传之后世，如遗珠遗玉，光耀千秋。
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免疫荧光三重标记具体方法及步骤
即利用抗原抗体特异性结合原理，在同一张切片上3个抗原进行同时标记，从而实现定位，定性，半定量的分析
1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。
2、抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。
中火8min停火8min转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。
自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
(修复液和修复条件根据组织来确定)
3、画圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)
4、血清封闭:在圈内滴加BSA孵育30min。
(一抗若是山羊来源，则加兔血清)
5、加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
6、加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。
次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加CY3荧光增强剂，避光室温孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min
8、微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。
9、加第二种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
10、加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
11、加FITC荧光增强剂：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加FITC荧光增强剂，避光室温孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min
12、微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。
13、加第三种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的CY5标记荧光二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
孵育完后，玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
15、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
16、自发荧光淬灭：切片稍甩干后，在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。
17、封片：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次
5min。
切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
18、镜检拍照：切片置于扫描仪下采集图像。
(DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光;FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光;CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光. CY5激发波长608-648nm, 发射波长672-712,，CY5原本为正红色，为了与CY3区分开，我们设定为粉色光。
DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光，粉光，绿光。
注意
样本放置于20倍样本体积的固定液中固定24h以上，常温运输送样。
切勿固定时间过长，切勿冷冻结冰。
荧光三标只能做石蜡包埋切片，不能做冰冻切片和细胞爬片。