萝卜CBPs溶菌酶活性的稳定性研究

萝卜CBPs溶菌酶活性的稳定性研究

摘要：植物溶菌酶是植物防御体系中的一部分，在植物防卫体系中具有重要作用。萝卜中有2个具溶菌酶活性的几丁质结合蛋白（Chitin-binding proteins，CBPs），分别是CBP1、CBP2组分。为了解CBPs的作用机制以及在萝卜中的生理功能，试验研究了CBP1、CBP2溶菌酶组分酶活性的稳定性。结果显示，CBP1、CBP2在pH 5.4、65 ℃条件下迅速失活，在pH 3.4～10.6、25 ℃条件下较稳定；CBP1较CBP2对氧化剂H2O2、NaClO敏感；CBP2较CBP1对木瓜蛋白酶敏感；2个组分对胰蛋白酶均敏感。

关键词：萝卜；溶菌酶活性；几丁质结合蛋白；稳定性

溶菌酶（Lysozyme，EC 3.2.1.17）广泛存在于生物体内，是一类专门作用于微生物细胞壁的水解酶，有抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤，增强免疫力等作用，已在医学、食品、化妆品、生物工程等多个领域得到广泛应用[1]。对于溶菌酶的发现是从Nicolle 1907年发表枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）溶解因子的报告开始的[1]；而对于溶菌酶本质的研究则是在1922年Fleming等[2]发现人的鼻涕、唾液、眼泪具有较强的溶菌活性、并把起溶菌作用的因子命名为溶菌酶后开始的[3]。在众多研究中，鸡蛋清的溶菌酶（Hen-egg white lysozyme，HEWL）含量多，制备技术较成熟，所以研究较深入[4]。现在植物溶菌酶的研究也取得了很大进展，研究者们已经先后从无花果（Ficus carica L.）[5]、芜菁（Brassica rapa L.）[6]、苋菜（Amaranthus mangostanus L.）[7]、花椰菜（Brassica oleracea L. var. botrytis L.）等植物的组织中及番木瓜（Carica papaya L.）[8]、大牛角瓜[Calotropis gigantea （L.）W. T. Aiton][9]、三叶橡胶树[Hevea brasiliensis（Willd. ex A. Juss.）Muell. Arg.][10]、冠状狗牙花[Ervatamia coronaria（Jacq.）Stap f.][11]、叙利亚马利筋（Asclepias syriaca L.）[12]等植物的乳汁中和萝卜（Raphanus sativus L.）[13]块根组织中提取到了溶菌酶；萝卜组织中有2个具有溶菌酶活性的几丁质结合蛋白（Chitin-binding proteins，CBPs）组分，业界分别表述为CBP1、CBP2；其对进一步了解植物溶菌酶的作用机制和拓展植物溶菌酶的应用范围具有一定的研究价值。为了弄清楚CBPs的作用机制以及在萝卜中的生理功能，试验探讨了CBPs 溶菌酶活性在不同环境条件下的稳定性。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

萝卜取自华南农业大学生命科学学院网室栽培的新鲜萝卜块根；溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）采用美国Sigma公司产品；木瓜蛋白酶液自行配制，由1份木瓜蛋白酶加9份激活剂组成，激活剂含2 mmol/L乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、20 mmol/L半胱氨酸（Cysteine，Cys）；胰凝乳蛋白酶（100 μg/mL）和胰蛋白酶（10 mg/mL）由华南农业大学生命科学学院中心实验室提供；不同pH的磷酸缓冲液自行配制，H2O2、NaClO等为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 具溶菌酶活性的CBPs分离及纯化参照文献[13]的方法，将萝卜块根洗净、捣碎、离心、取上清，脱氨、再生、几丁质凝胶亲和层析、羧甲基纤维素层析柱离子交换层析，结果从萝卜块根中分离到2个具溶菌酶活性的酶组分CBP1和CBP2，分别将两者冷冻干燥，得到粉末状物质，可视为试验所需的酶粉。

1.2.2 CBPs溶菌酶活性测定取2个酶组分的酶粉，在25 ℃环境下，用pH 5.4、50 mmol/L的磷酸缓冲液溶解，配成2个酶组分的酶液，待用。参照文献[13]的方法。用pH 6.2、50 mmol/L 磷酸缓冲液配制溶壁微球菌悬浮液，在30 ℃条件下取2.5 mL上述悬浮液于比色杯中，分别加入0.1 mL的2个酶组分酶液，迅速搅匀，以每分钟在450 nm处使吸光度值下降0.001所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

1.2.3 CBPs溶菌酶活性的酸碱稳定性取2个酶组分的酶粉，用不同pH的50 mmol/L磷酸缓冲液（pH 2.2～10.6、25 ℃）溶解，放置30 min，分别测定CBP1、CBP2组分的溶菌酶活性，比较2个酶组分之间的酶相对活性。

1.2.4 CBPs溶菌酶活性的热稳定性2个酶组分的酶粉用pH 5.4的50 mmol/L 磷酸缓冲液溶解，在不同温度（0～80 ℃）下放置30 min，流水冷却，分别测定CBP1、CBP2组分的溶菌酶活性，比较2个酶组分之间的酶相对活性。

1.2.5 CBPs溶菌酶活性在氧化剂H2O2、NaClO中的稳定性2个酶组分的酶粉用pH 5.4的50 mmol/L磷酸缓冲液溶解，分别加入不同终浓度的H2O2（分别配制成5、10、15、20、25 mmol/L梯度溶液）或NaClO（分别配制成5、10、15、20、25、30、35 μg/mL梯度溶液），25 ℃放置30 min，再分别测定CBP1、CBP2组分的溶菌酶活性，比较2个酶组分之间的酶相对活性。

1.2.6 CBPs溶菌酶活性对蛋白酶的稳定性分别在1 mL 2个酶组分酶液中加入1 mL木瓜蛋白酶液，37 ℃水浴10 min后分别测定CBP1、CBP2组分的溶菌酶活性；分别在1 mL 2个酶组分酶液中加入胰凝乳蛋白酶（100 μg/mL）或胰蛋白酶（10 mg/mL），经30 min后分别测定CBP1、CBP2组分在一定时间范围（60 min）内的溶菌酶活性，比较2个酶组分之间的酶相对活性。2 结果与分析

2.1 CBPs溶菌酶活性的酸碱稳定性

CBPs溶菌酶活性的酸碱稳定性测定结果见图1。从图1可见，在pH 2.2～pH 3.4时，CBP2溶菌酶组分的相对活性升幅小，而CBP1溶菌酶组分的相对活性升幅大；在pH 3.4～pH 10.6时，2个CBPs溶菌酶组分的相对活性都比较稳定；但在pH>10.6时，2个CBPs溶菌酶组分的相对活性迅速降低。

2.2 CBPs溶菌酶活性的热稳定性