单宁酶
单宁酶的作用
单宁酶的作用
答：单宁酶的作用是：
1防止茶饮料的冷浑浊
在茶饮料的生产中，茶叶的高温提取液冷却后会变浑浊，并产生絮状沉淀（茶乳酪）。
茶叶提取液中固形物浓度越高，这种沉淀现象越严重，影响了茶饮料的稳定。
此外，茶饮料在冷藏中也会变得浑浊，滋味和香气都会产生很大的影响，这种现象使其作为冷饮的商品价值受到很大的损害。
可口可乐公司利用单宁酶解决茶饮料中的“冷后浑”，取得了良好的效果，浑浊度由80%降至8%[10] 。
对红茶进行单宁酶处理，结果发现速溶茶完全溶于冷水，而且滋味良好，而无酶处理的茶的固形物和浸提物产量均低于酶处理的茶。
2提高茶叶的提取率
单宁酶应用于红茶、绿茶、乌龙茶深加工中, 还能使茶叶中可溶性金属元素含量增加。
Lauren S.等报道，用单宁酶处理红茶，茶汤中可溶性铁、钙的含量分别增加了23%与15%；若在绿茶加工中使用单宁酶，可使离子铁的含量提高18%，并部分消除夏春茶的苦涩味，提高茶品质。
3保持色泽和减轻苦涩味
通常茶饮料由于浸出后产生沉淀，就会使提取液中的固形物浓度下, 降而色泽变淡。
单宁酶的作用提高了茶成分的得率，就能防止这种现象的发生。
同时，由于茶叶中所含的咖啡因、维生素、儿茶素类物质具有多种生理功能，例如茶多酚类的抗氧化作用、等，通过单宁酶处理，提高茶叶有效成分的得率，也就提高了其功能性。
单宁酶粉剂的制备工艺研究_保玉心
单宁酶可以应用于食品加工、皮革制造、精细化 工等行业，具有广阔的应用前景。美国食品与药物管 理局(FDA)已确定单宁酶为安全产品，国外近期的研 究主要集中在固体发酵法，很多资料[1~5]显示固体发 酵主要产胞外单宁酶，不需进行细胞破壁，容易提 取，且酶活力较高。本实验采用黑曲霉 B0201 利用五 倍子生料固体发酵生产胞外单宁酶，提取过程简单， 并对硫酸铵盐析初步提纯单宁酶进行了研究，为单 宁酶粉剂的制备提供酶液。
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遵义医学院学报
32 卷
[Abstract] Objective The preparation tannase powder, lays the foundation for the tannase's widespread application. Methods Produces the tannase through the gall nut crude material solid-state fermentation, the extraction enzyme fluid use freezing drying method preparation tannase powder.Results After freeze -drying 8h, the enzyme fluid dehydration rate achieves 94% , after enzyme vigor discovered that joins 1% polyethylene glycol to display the good stability for the protecting agent solid enzyme powder, one month later still could maintain 91% activeness.Conclusions The freezing drying method is a simple effective method of preparation tannin enzyme powder. [Key words] tannase；solid-state fermentation；freeze drying
单宁酶酶活力检测方法
单宁酶酶活力的检测1引用文件2范围本标准适用于微生物发酵产单宁酶制剂酶活力检测3.术语和定义下列术语和定义适用于本标准。
3.1酶活性单位定义在30℃、pH值为5.0的条件下，每分钟降解没食子酸丙酯（PG）溶液解释放1μmol没食子酸所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。
4.原理酶活力的测定采用保玉心的绕丹宁法，该法以没食子酸丙酯（PG）作为反应的底物，单宁酶分解PG产生的没食子酸可与绕丹宁在碱性条件下形成红色复合物，该复合物在520nm处有最大吸收，据此可通过测定A520的变化量来计算生成的没食子酸的量，从而计算酶活力。
5.试剂和材料本标准中所有试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的二级水。
5.10.1mol/L的磷酸氢二钠：准确称取十二水合磷酸氢二钠35.814g，加入800ml水溶解，溶解后定容至1000ml。
5.20.05mol/L的柠檬酸：准确称取一水合柠檬酸10.507g，加入800ml水溶解，溶解后定容至1000ml。
5.1和5.2两者混匀，互调pH为5.0.5.30.5mol/l的KOH溶液：准确称取KOH28.055g，加入800ml水溶解，溶解后定容至1000ml。
5.40.667%（W/V）罗丹宁溶液（甲醇绕丹宁）：准确称取罗丹宁0.667g，加入80ml甲醇溶解，溶解后用甲醇定容至100ml。
5.5没食子酸标准溶液，浓度为10mmol/l称取没食子酸0.18813g，加磷酸-柠檬酸缓冲溶液溶解，定容至100ml。
5.6没食子酸丙酯（PG）溶液，浓度为10.0mmol/L称取没食子酸丙酯0.2122g，再加入80ml缓冲液，磁力搅拌加热，直至完全溶解，冷却，调节pH 至5.0，并用缓冲液定容至100ml。
使用前适当摇匀，4℃冷藏保存。
6.仪器和设备6.1实验室用样品粉碎机或碾钵。
6.2分析天平：感量0.001g。
6.3pH计：精确至0.01。
单宁酶的固态发酵生产及其茶叶深加工中的应用
单宁酶的固态发酵生产及其茶叶深加工中的应用单宁酶的固态发酵生产及其茶叶深加工中的应用茶叶是我国传统的饮品之一，深受国内外消费者的喜爱。
茶叶的质量和口感跟它的单宁酸含量和单宁酶的活性有着密切的关系。
单宁酶是一种在生物体中催化单宁酸转化的酶，它在茶叶制造过程中发挥了很重要的作用。
单宁酶的固态发酵生产及其在茶叶深加工中的应用，可以提高茶叶的质量和附加值。
一、单宁酶的固态发酵生产单宁酶的固态发酵生产是利用高效的单宁酶产生菌株在适当的条件下，利用固体底物发酵系统发酵生产出单宁酶。
目前，采用的主要固态底物是大豆粉、玉米粉和麦芽粉等。
固态发酵生产方法具有生产工艺简单、底物资源广泛、设备和人工成本较低等优点。
采用固态法生产的单宁酶稳定性好，常温下可以保存一年以上，并且产出的单宁酶活性高，纯度高达95%以上。
二、单宁酶在茶叶深加工中的应用单宁酶在茶叶深加工领域中有着广泛的应用，主要表现在以下几个方面：（一）利用单宁酶控制茶叶发酵过程。
在传统茶叶制作过程中，茶叶经过发酵处理，单宁酸含量和茶叶口感有着密切的关系。
适量的单宁酸含量可以使茶叶口感柔和，但过多的单宁酸含量则会使茶叶口感涩苦。
因此，在茶叶制作过程中添加适量的单宁酶可以控制茶叶的单宁酸含量，从而使茶叶口感更加可口。
（二）利用单宁酶提取茶叶多酚。
茶叶中多酚是一种重要的营养成分，具有很高的医学保健价值。
但茶叶中多酚不易被人体吸收，因此需要采用特殊的工艺将其提取出来。
利用单宁酶可将茶叶多酚高效地提取出来，不仅提高了茶叶的保健价值，还增加了茶叶的附加值。
（三）利用单宁酶改良茶叶的口感。
如今，随着消费者对于食品品质的要求不断提高，茶叶市场也越来越注重茶叶的口感。
在茶叶制作过程中，添加适量的单宁酶可以改良茶叶的口感，使其更加柔和清爽，极大地提升了茶叶的品质和价值。
总之，单宁酶的固态发酵生产和在茶叶深加工中的应用，已经成为茶叶行业不可或缺的一环。
在未来的发展中，随着生态和健康饮食观念的不断普及，单宁酶技术的应用将会越来越广泛，为茶叶产业的发展注入新的活力。
路邓葡萄球菌单宁酶基因的克隆、表达、纯化与改造
路邓葡萄球菌单宁酶基因的克隆、表达、纯化与改造刘鳐;胡雪丽;钟秋梅;吕蝶;吴明波【摘要】为提高路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)单宁酶(Sl-tan)的活性,该文利用化学合成方法获得Sl-tan基因,将该基因连接到重组表达质粒pET43.1-A,再转化到大肠杆菌感受态细胞BL21-DE3中进行表达,通过亲和层析柱纯化,以没食子酸甲酯为底物进行酶活性测定以及酶学性质分析,并基于生物信息学分析,结合定点突变技术对Sl-tan进行人工改造.结果显示,获得的重组单宁酶产量明显增高,最高可达42 mg/L发酵液;酶学性质研究显示该酶在pH 8.0,温度40℃时获得的活性最高(40 U/mg);Ala460突变为Pro460后的Sl-tan活性可提高82.5％.【期刊名称】《中国测试》【年(卷),期】2018(044)009【总页数】6页(P63-68)【关键词】路邓葡萄球菌;单宁酶;三明治结构;定点突变;没食子酸甲酯【作者】刘鳐;胡雪丽;钟秋梅;吕蝶;吴明波【作者单位】成都医学院,四川成都 610500;成都医学院,四川成都 610500;成都医学院,四川成都 610500;成都医学院,四川成都 610500;成都医学院,四川成都610500【正文语种】中文【中图分类】TQ9250 引言单宁是一种水溶性多酚化合物，在植物界中广泛存在[1]。
单宁中含有丰富的碳源，但由于其含有大量的芳香环类结构，易于螯合金属离子，并与蛋白聚合形成不可溶性沉淀，导致单宁难以被降解利用[2-5]。
一些微生物能够表达单宁酶，将单宁水解为五倍子酸与葡萄糖，为微生物生长提供碳源以及能源物质[6-7]。
单宁酶是已知的唯一能够降解单宁的生物酶类，因此被广泛应用于食品行业、制药行业以及动物饲料的生产中[8-13]。
目前，单宁酶的生产主要通过产单宁酶菌株的液态深层发酵以及固体发酵两种方法，耗时长、产量低、成本高、难以纯化，且生产的单宁酶通常以粗酶或者菌体形式应用，不利于单宁酶的应用[14-15]。
索莱宝 BC4070 单宁酶活性检测试剂盒说明书
单宁酶活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC4070规格：50T/24S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液液体75 mL×2瓶2-8℃保存试剂一粉剂×2支2-8℃保存标准品粉剂×1支2-8℃保存溶液的配制：1、试剂一：临用前取1支加入1.5 mL无水乙醇混匀溶解，用不完的试剂可以2-8℃保存一周；2、标准品：5 mg没食子酸丙酯。
临用前加入1.178 mL无水乙醇充分混匀溶解，配成20 μmol/mL的标准溶液，2-8℃保存两周。
产品说明：单宁酶全称是单宁酯酰水解酶(Tannase，EC 3.1.1.20)，存在于富含单宁的植物，也广泛存在于微生物中，可以水解酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖。
使用没食子酸丙酯（PG）作为单宁酶酶促反应的底物，其在270nn下有特征吸收峰，根据其反应前后吸光度的变化来计算单宁酶活力。
Gallic Acid Array注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：紫外分光光度计、1mL石英比色皿、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、超声破碎仪、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液，冰浴匀浆。
10000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、细胞或细菌样本的制备：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或细菌加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）。
10000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤1、紫外分光光度计预热30min，波长调至270nm，蒸馏水调零。
产单宁酶真菌的筛选及产酶条件
单宁酶（ Tannase，EC3. 1. 1. 20） ，全称单宁酰 基水解酶（ Tannin Acyl Hydrolase） ，属于诱导型胞 外酶，可高效、专一、定向裂解单宁中的酯键、缩酚 键和糖苷键。单宁酶主要由丝状真菌产生，如曲霉 属（ Aspergillus） 、青霉属（ Penicillium） 、根霉属（ Rhizopus） 、毛霉属（ Mucor） 等均可产单宁酶［1 － 2］；在某 些酵母［3］和细菌［4 － 5］的培养物中也有发现。单宁 酶可作为脱除单宁成分的添加剂［6 － 7］用于茶、葡萄 酒、啤酒及果汁饮料的生产。另外，单宁酶可将五 倍子单宁降解为没食子酸（ gallic acid，GA） ，而后 者是一种重要的化工原料，应用范围很广，用量大， 现已成 为 市 场 畅 销 产 品 ［2，8］。 通 过 单 宁 酶 水 解 单 宁生产 GA，与化学方法相比具有产率高、反应条
（2） 产单宁酶菌株的初步筛选。配制 0. 1 g / mL 的单宁酸溶液，在无菌条件下用移液枪吸取 1 mL 单 宁酸溶液加入预先倒好的马丁氏培养基平板表面并 涂布均匀，使单宁酸溶液中的单宁被平板表面均匀 吸附，形成白色、不透明的单宁薄层，然后用移液枪 吸出多余的单宁酸溶液。挑取少许菌丝体，接种在 吸附了单宁的培养基表面，28 ℃ 下培养 2 ～ 3 d。观 察各个菌株的生长状况。若在菌落周围出现透明的 水解圈则表明该菌具有产生单宁酶的能力，可将菌 落周围的单宁水解；若没有透明水解圈则表示此菌
（4） 酶活力的测定方法。取少量培养液，滤去 菌丝体，吸取 50 μL 滤液于 5 mL 离心管中作为酶 液，另取 50 μL 滤液煮沸 15 min 灭活，所得灭酶液作 为对照。分别向酶液和灭酶液中加入预先配好的 950 μL 2 mg / mL 的标准单宁酸溶液，调 pH 至 5. 0， 30 ℃ 恒温下反应 30 min。向两支离心管中分别加 入 4 mL 蒸馏水，再加入 0. 1 g 铬皮粉，充分振荡除去 剩余的单宁酸，静 置。取 0. 1 mL 上 清 液，稀 释 至 1 mL后调 pH 为 3. 0，10 000 r / min 下离心10 min，取 离心后的上清液，用 HPLC 在 263 nm （ V （ 甲 醇） ∶ V（水） = 1∶ 1）、流速 1 mL / min、柱温 25 ℃ 、进样量 3 μL条件下，分别测定酶液和灭酶液的没食子酸峰 面积，与 0. 01 mg / mL 没食子酸标品溶液的结果对照 计算相应的浓度。通过两者之间的差值可推算出该 菌株培养液单宁酶活力，重复 2 次，取平均值。酶活 的定义 为：30 ℃ 下 每 分 钟 单 宁 酶 水 解 单 宁 产 生 1 μmol没食子酸所对应ol / （ min·mL） 。
单宁酶活力测定方法的研究
将不同浓度的 PG 与其在 260nm、270nm、 280nm 处吸收值的关系分别作散点图( 图 1) 。
从散点 图作初 步判 断, 在 270nm 处 PG 浓度与其吸收值之间呈直线关系, 散点集中 于同一直线上。在 260nm、280nm 处, 散点不 完全集中于同一直线上, 而直线 1 斜率最大,
第 10 卷第 6 期 2000 年 12 月
生物技术 BIOTECHNOLOGY
Vol. 10, No. 6 Dec, 2000
图 1 两种方法提取的粗酶液的 聚 丙烯酰胺凝胶电泳
A: 渗透压冲击法; B: 超声波法
从图 1 可知, 渗透压冲击法提取的粗酶 液杂蛋白含量少, 而超声波法提取的粗酶液 杂蛋白含量多。测定结果表明二者比活相差 10 倍以上, 与电泳结 果一致, 活 性染色显示 第一条带为酶带。
将反应温度为 40 条件下, 1ml 酶液每 分钟使 PG 液在 270nm 处减少 0 001 个吸收 值定义为 1 个酶活力单位。
2 结果与讨论
2 1 没食子酸丙酯在紫外光区不同波长处 的吸收值
波长 ( nm)
250 260 270 280 290 300 310 320 330
表 1 不同浓度 PG 在紫外区不同波长下的吸收值( OD) T able 1 The absorption value of PG on different wavelength in ultraviolet district
0. 083 0. 187 0. 287 0. 389 0. 484 0. 588 0. 685 0. 784 0. 883
0. 076 0. 167 0. 241 0. 337 0. 437 0. 538 0. 627 0. 700 0. 802
微生物单宁酶研究现状及其在滇橄榄果酶法加工中的应用
2010年第6期收稿日期：2010-03-07基金项目：攀枝花市中国科学院科技成果孵化资金资助。
作者简介：杨亚力(1978-)，工程师，一直从事工业微生物及生物技术研发工作。
*通讯作者：杨顺楷（1943-），研究员，长期从事微生物转化及酶法加工过程研究与开发。
前言植物单宁，俗称鞣质，或植物多酚(plantpolyphenols),该天然产物化学结构多样性，反应多重性，分子量在500~3,000之间，或者更高的生物大（中）分子物质。
其生物活性成分主要功能有止血，抗氧化，抗病毒，促进氮代谢，改善肾功能，以及精神病治疗，故称植物单宁为天然有机化合物的新家族。
国际上统一将单宁的化学结构分为可水解单宁（hy-drolyzable tannins）和缩合单宁(condensed tannins)。
可水解单宁物质在水相介质存在酸、碱、以及生物催化剂———单宁酶或加热时易水解为酚酸、糖或多元醇酸。
例如，真菌单宁酶（EC3.1.1.20）可以在温和的生理水相反应介质体系中直接酶水解单宁底物的缩酚键、酯键，积累显著数量的小分子优势产物没食子酸（GA），以及其它化合物，如五倍子单宁的葡萄糖，塔拉单宁的奎尼酸等[1-3]。
滇橄榄（又名余甘子，Phyllanthus emblica L.）生长在我国西南川滇两省金沙江干热河谷地域，现分布在尚未规模开发的植物野生群落2×104hm2，对该植物资源深度开发其“药食两用”功能食品（饮料）保健产品中具有重要价值，尤其是橄榄果以富含高稳定性维生素C、高含量单宁等生理活性物质著称，公认它是一种有效的自由基清除剂、抗氧剂，其果实含有高水平的酶型自由基清除剂———超氧化物歧化酶（SOD）。
滇橄榄果富含45%~55%（水提取物干燥粉剂，GB皮粉法测定）植物单宁物质，这就导致工业开发果汁加工过程中果汁产品总是产生浑浊沉淀，即后浑浊，果汁不耐贮藏（未发表资料）。
同时，这也是国内商品果汁加工出口遍存在的技术难题。
中科院科技成果——单宁酶的发酵制备及没食子酸丙酯一步生物合成
中科院科技成果——单宁酶的发酵制备及没食子酸
丙酯一步生物合成
成果简介
单宁酶又称单宁酰基水解酶，能够降解单宁酸分子中酯键和缩酚键。
单宁酶广泛应用于食品加工、饮料处理、酒风味调配、药物及其中间体和相关精细化学品的制备等领域。
没食子酸丙酯是一种具有优良抗氧化性能的酯类化合物，可以通过滞缓氧化的方式保护有机体免受各类活性自由基的损伤，是最常用的多酚类抗氧化剂之一。
本项目内容包括两个方面：
1、发酵法制备单宁酶制剂；
2、非水相生物催化一步酯转换单宁酸合成没食子酸丙酯。
技术特点
单宁酶发酵酶活53.6IU/mL；采用一步催化法，通过单宁酶印迹技术和反应体系优化，底物转化率达到75%；半连续催化，底物转化率达到90%。
市场分析
单宁酶广泛应用于食品加工,饮料处理、酒风味调配,药物及其中间体和相关精细化学品的制备等领域。
没食子酸丙酯是一种具有优良抗氧化性能，并是医药、农药中间体，市场需求很大。
建立在酶催化基础上的生物合成方法较酸碱化学催化有更强的生命力。
微生物单宁酶与植物单宁知识介绍
微生物单宁酶与植物单宁知识介绍微生物单宁酶是同“植物单宁”一类生物活性有机化合物的“新家族”这一与时俱进的新概念提出密切相关。
伴随着植物和微生物生物学的迅猛发展，对植物单宁（同义语：植物多酚，鞣质）这一古老而又现代的复杂天然有机化合物的神秘面纱正在逐步揭开，旧有的知识概念正在柀修订，植物单宁生物化学，分子细胞生物学前沿科技领域不断推出的新研究成果，反过来又给传统的应用领域带来创新机遇，影响最直接的莫过于食品药品保健品等工业生物技术领域。
植物单宁，俗称鞣质，或植物多酚(plant polyphenols),表明该天然产物化学结构的多样性，反应的多重性，分子量在500~3,000之间，或者更高的生物大（中）分子物质。
这类化合物已经给公衆键康施加了重大的影响，其生物活性成分主要功能有止血，抗氧化，抗病毒，促进氮代谢，改善肾功能，以及精神病治疗，故称植物单宁为天然有机化合物的新家族。
国际上统一将单宁的化学结构分为可水解单宁（hydrolyzable tannins）和缩合单宁(condensed tannins)。
前者母核为葡萄糖或多羟基化合物如儿茶素的没食子或并没食子酸酯的多聚物。
新近有关可水解单宁生物合成形成和沉积位点在叶肉细胞壁这一主要场所，这已为酶学—免疫组织化学实験证据所证实；这与早期报告的“单宁液泡说”不同。
因此，现在可以把单宁液泡内容物看作本质未定的多酚化合物，由于使用非特异性显色反应检测法所致。
缩合单宁，如称为原花色素（proanthocyanidins），大多数发现在飼料豆科植物中，但是它的生物合成仍是不确定性的[6]。
可水解单宁物质在水相介质存在酸、碱、以及生物催化剂—单宁酶或加热时易水解为酚酸、糖或多元醇酸。
例如，真菌单宁酶（EC 3.1.1.20）可以在温和的生理水相反应介质体系中直接酶水解单宁底物的缩酚键、酯键，积累显著数量的小分子优势产物沒食子酸（GA），以及其它化合物，如五倍子单宁的葡萄糖，塔拉单宁的奎尼酸等。
黑曲霉固态生料发酵产单宁酶小试研究
． ０ － ． — ５． —３ — —
空气的方法 ， 将通风和保湿很好地结合在一起 ， 既能对微生物 提供氧气 ， 有利于热量的散发 ， 又能为生微生物生长提供湿润 的环境。本试验用湿度探 头对培养基 的湿度进行测量 ， 结果 表明 ， 发酵罐不 同于培养 箱 ， 通过鼓热 空气 吹动水面雾化来加 湿空气的方法 ， 不管发酵罐底部是否水 ， 都能使发酵罐内湿度 保持在 ７ ％左右 。通风也是影响发酵主要原 因之 一 ， ０ 随着厚
酸丙酯 ， 湖南省张家界 贸源化工 有限公 司生产 ； 绕单 宁， 上海
君创 化工有 限公司生产 ； 五倍 子取 自贵州省遵 义市余庆 县。
（ Ｈ ）Ｓ ＭｇＯ ７ ２ Ｎ Ｃ ， Ｏ Ｎ ：Ｏ ， Ｓ ４・ Ｈ ０， ａ １Ｋ Ｈ等均为化学纯。 １４ 培 养基 ． 斜面 菌 种 培 养 基 ： 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 斜 面 培 养 基 马 （Ｄ ； Ｐ Ａ） 一级种子 培养基 ： 马铃薯葡 萄糖 液态培养基 ； 二级种
１ ２ 主 要 仪 器 与设 备 ．
稀释， 以蒸馏水作 空 白， 紫外 一可见 分光光度计在 ５０ｎｎ 用 ２ ｌ 波长下检测没食 子酸标准 溶液 的吸光值 ， 得到 没食 子酸水溶 液标准 曲线 。
１７ 粗 酶液 的提 取 ．
立式压力蒸汽灭菌器 ： Ｘ Ｌ ５ Ｓ， Ｙ Ｑ— Ｓ一 ０ Ｉ上海 博讯实业有
于 ４℃保 藏 ３个月后 ， 单宁酶相对酶活仍 接近 ７ ％。 ０
关键词 ： 宁酶 ； 单 黑曲霉 ； 发酵罐培养小试 中图分类号 ： Ｑ ２ ． Ｔ ９５ ９ 文献标志码 ： Ａ 文章编 号 ：０２—１０ （ ０２ ０ —００ ０ １０ ３ ２ ２ １ ） １ ３４— ３
单宁酶
2、单宁酶的性质
2.1单宁酶的酶学性质 来源于不同菌种的单宁酶动力学性质稍有区别。 Yamada H.等[4]报道的黄曲霉单宁酶活性稳定pH 值范围最窄,为5.0~5.5。另据韩国的Chae SooKyu等[8]报道的曲霉菌种AN-11单宁酶活性稳定的 pH值为5.0~6.5。其他菌种单宁酶活性稳定pH范 围大都在3.0~8.0之间,最适pH值为4~6,热稳定范 围在70~80℃以下,最适反应温度为35~60℃。各 种金属离子以及EDTA对酶活性影响报道结论不 一。
在液态茶和速溶茶的生产中，由于多酚类、 咖啡碱、蛋白质等物质生成成络合物，形 成所谓的“冷后浑”，因此需要进行“转 溶”工艺。单宁酶就是酶法转溶的专一酶。 它能断裂儿茶酚与没食子酸间的酯键，使 苦涩味的酯型儿茶素水解，释放出的没食 子酸阴离子又能与茶黄素、茶红素竞争咖 啡碱，形成分子量较小的水溶性短链物质， 从而降低荼汤的混浊度[22]。
Mikukarl K.[27]研究认为：添加0.001％的单 宁酶和0.2％的β-环糊精于红茶提取物中， 可防止茶汤乳化有利于风味和色泽。 同样，日本专利也有报道添加单宁酶和环 状糊精能够改善茶提取物的品质。 刘胜祥[28]等研究表明：向1％的茶汤中加入 3％的单宁酶液。在35℃,pH6.0条件下，反 应速度最快。
c.细胞破壁→聚合物沉淀→透析[11]
d.细胞破壁(几丁质酶等)→反向胶束系统[12]
4、单宁酶活力测定方法
(1)滴定法.由于单宁在单宁酶作用下分解生 成游离的没食子酸,可用碱对之进行滴定,确 定底物单宁的减少量而测得酶活力.但是,因 为缓冲液对碱的缓冲力以及单宁本身的褐 色干扰了滴定终点,再者,随溶液pH值增高, 单宁会逐渐发生水解,将影响测定结果的稳 定性与准确性[13]
微生物单宁酶与植物单宁知识介绍
微生物单宁酶与植物单宁知识介绍微生物单宁酶是一种能够降解和转化多酚类化合物的酶，特别是对于植物单宁具有高度的活性和特异性。
植物单宁是一类重要的多酚物质，在自然界中广泛存在于植物体内，例如树皮、果实、叶片等部位。
植物单宁具有多种生物活性，包括抗氧化、抗菌、抗病毒等，因此在医学、食品、农业等领域具有广泛的应用价值。
而微生物单宁酶的研究和应用，可以帮助我们更好地理解植物单宁的代谢途径和生物功能，并通过酶的工程改造，实现对植物单宁的高效利用和产业化应用。
首先，微生物单宁酶的研究和开发对于植物单宁的降解和解毒具有重要意义。
植物单宁在植物体内起到重要的保护作用，能够抵御有害生物的入侵和环境的胁迫，但同时也对植物自身的生长和发育产生一定的抑制作用。
微生物单宁酶通过降解植物单宁，可以减轻植物自身的毒害效应，促进植物的生长和发育。
此外，微生物单宁酶还可以降解植物单宁与其他物质的复合物，提取并修饰其中的活性成分，用于药物和保健品的开发。
其次，微生物单宁酶的研究和应用对于农业生产具有重要的意义。
植物单宁在农作物的种子、果实和叶片等部位的积累，不仅会影响农产品的质量和口感，还会降低其营养价值和商业价值。
通过利用微生物单宁酶，可以促进农作物中植物单宁的降解和代谢，提高作物的营养品质和市场竞争力。
此外，微生物单宁酶还可以用于减轻农作物对重金属和有机污染物的毒害，提高农作物的抗逆性和环境适应性。
另外，微生物单宁酶的研究和开发对于环境保护和资源循环利用也具有重要的意义。
植物单宁在自然界中的分布广泛，含量丰富，但其排放和处理成本较高。
利用微生物单宁酶可以高效地降解和转化植物单宁，减少植物单宁在环境中的积累，降低对生态环境的影响。
此外，微生物单宁酶还可以用于高效转化和利用废弃植物材料，实现对资源的循环再利用，减少对自然资源的依赖和开采。
最后，微生物单宁酶的研究和应用还具有重要的经济和社会价值。
众所周知，植物单宁在医学、食品、农业等领域都具有广泛的应用价值。
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摘要
单宁酶是一种水解酶，能水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚酸键，生成没食子酸和其他化合物。
在酶制剂工业发达的国家，如日本、美国，单宁酶的基础理论和应用研究工作开展得较早，并已在茶饮业中取得了较好的经济效益。
随着国民经济的不断发展，人们生活水平的不断提高，单宁酶得到了更广泛的应用。
人们已在皮革业、饲料业、化妆品业等方面开发了单宁酶的多种用途。
中国是个茶叶大国，而且可开发资源丰富，单宁酶的应用前景十分广阔。
单宁酶的性质
国外对单宁酶性质的研究相对较多，也较深入，为今后的应用研究提供了有价值的参考。
单宁酶的酶学性质
来源于不同菌种的单宁酶动力学性质稍有区别。
Yamada H. 等报道的黄曲霉单宁酶活性稳定pH值范围最窄，为5. 0～5. 5另据韩国的Chae Soo-Kyu 等报道的曲霉菌种AN-11单宁酶活性稳定的pH值为5. 0～6. 5其他菌种单宁酶活性稳定pH 范围大都在3.0～8.0之间，最适pH值为4～6，热稳定范围在70～80 ℃以下，最适反应温度为35～ 60 ℃。
日本科学家Hdeaki Yamada等就底物浓度对黄曲霉的影响进行了研究，测出Km (以单宁为底物) 为0.5×10-4 mol/L; Km (以葡萄糖212没食子酸为底物) 为1.4×10-4mol/L；Km (以没食子酸甲酯为底物) 为8.6×10-4mol/L。
经6mol/L盐酸胍处理后，单宁酶将发生不可逆失活，各种金属离子以及EDTA 对酶活性影响报道结论不一。
单宁酶的物理化学性质
纯单宁酶在紫外光区280nm 处，有一个最大吸收峰，在浓度为10% ，比色皿为1 cm×1 cm 条件下，吸光系数a为11.8，260nm处吸光度与280nm处吸光度之比为0. 51。
Sadaak i Iibuchi，Chae Soo-Kyu分别用凝胶过滤法测定出它们各自选育的菌种单宁酶相对分子质量都为200 000。
O sao A dachi等分别用沉降法和电泳法测定黄曲霉单宁酶相对分子质量，分别是194 000和192 000。
Chantal等测出黑曲霉LCF8单宁酶相对分子质量为186 000，其等电点在4左右。
Chantal和Chae Soo-Kyu在对各自提纯的酶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析时发现，单宁酶分子由2种亚基组成，但这个结果与Kengi Aoki对酵母单宁酶结构分析的结果有所不同。
后者用同样的方法，只得到一条电泳蛋白带。
O sao A dachi等进一步研究了黄曲霉单宁酶的其他结构特性，其分子中氮含量为12.9% (凯氏定氮法)，用二硝基氟苯法测氨基末端，有2个DNP-氨基酸产物，分别为DNP-丙氨酸与DNP-精氨酸,这一结果进一步指明黄曲霉单宁酶为2种亚基组成。
单宁酶另一重要特征是，它为一种糖蛋白，而不同来源的单宁酶糖含量有差异。
例如，黄曲霉单宁酶糖基占总相对分子质量的25% ，糖基为甘露糖。
Chantal从黑曲霉中提取的单宁酶，其糖基含量高达43% ，而酵母单宁酶糖基含量为62%。
Parthasarathy N. 等探明其选育的黑曲霉单宁酶碳水化合物为
葡萄糖和甘露糖，肽链通过丝氨酸和苏氨酸与糖基相连接。
糖基与酶的功能关系还未见报道。
单宁酶的催化性质
Saddak i Iibuchi等对米曲霉单宁酶的催化途径、底物的专一性和阻遏作用进行了研究。
结果表明，单宁酶催化葡萄糖酸酯，水解成没食子酸与葡萄糖。
中间产物为1，2，3，4，6-黄酰单宁和2，3,4，6-四酰单宁以及两种没食子酸葡萄糖。
反应途径如下所示：
单宁酶只能水解没食子酸化合物中的酯键，不对底物类似物如甲基间二羟甲酸盐起作用。
酶对底物是否有催化作用决定于ES复合物的形成。
ES复合物形成条件有3点：a.只要是没食子酸形成的酯,对醇没有限制；b.酚羟基在苯环上相对位置不同，将影响其与酶的结合作用；
c.形成的ES复合物中酚羟基形成的酯键可被水解，而其他酯键或羧基由于没有直接与酶结合，不能发生以上的反应。
酶反应受到含酚羧基的底物类似物的竞争性抑制，但2,6--二羟基苯甲酸是非竞争性抑制。
这表明尽管底物与酶结合的复合物都是没食子酸化合物，但因酶与底物结合位点不同，它对某些酚羟基底物起作用，而对另一些底物类似物又不起作用。
单宁酶的来源
单宁酶主要来源于微生物，菌种主要为曲霉菌。
另外，青霉、酵母、细菌、植物也有产单宁酶的报道，国外资料报道的各种产酶菌种列于表1. 这些菌种都是以单宁作为诱导物来产生
单宁酶的，充分证明单宁酶为一种诱导酶。
Doi Seniji等从基因表达调控方面对菌种产生单宁酶进行了探索, 证明指导单宁酶生物合成的mRNA极不稳定, 而放线菌酮可迅速阻止单宁酶的产生。
单宁酶的提取与纯化
单宁酶的提纯技术随着蛋白质提纯技术的进步而不断提高。
在分离纯化此酶的过程中，主要困难表现在破壁取酶。
曲霉单宁酶为胞内酶，它分布于真菌的细胞壁与细胞膜之间，结合得非常牢固，可以认为是固定在细胞中。
要充分提取酶，首先面临的是如何有效地破壁，使酶最大限度地释放出来。
利用超声波、石英砂研磨、渗透法等经典方法破壁时，酶得率较低。
法国科学家利用冻融法，再加入伴刀豆球蛋白(凝集素) 破壁，此法是在菌种产酶高峰过后，待胞壁韧性降低时采用的，酶得率虽较第一类方法有所提高，但损失仍然严重。
翌年，他们将生产几丁质酶的链霉素菌丝体与产单宁酶菌种保温培养一段时间后，53%的胞内酶得以释放。
在此之前，也有关于几丁质酶、α-葡聚糖酶或β-葡聚糖酶破壁的报道。
酶法破壁大大提高了酶得率，但也不可避免地给后期提纯工作带来了麻烦。
单宁酶的分离提纯手段大致可以归纳为以下几条路线：
硫酸铵沉淀
A、细胞破壁（物理方法）→利凡诺（乳酸-6，9-二氨基-7-氧基吖啶）沉淀→
丙酮沉淀
阴离子交换柱→葡聚糖凝胶过滤
B、细胞破碎（物理方法）→超滤（200 000）→超滤（100 000）→Protein Pak SW300
C、细胞破壁→聚合物沉淀→透析
D、细胞破壁（几丁质酶等）→反向胶束系统。
上述几条路线表明：为适应单宁酶商品化需求，单宁酶的提纯技术在从复杂且成本高的实验室提纯手段向简明的工业化生产过渡。
Chantal报道的反向胶束系统可有效地提高酶产量，大大地缩短纯化过程。
反向胶束系统是80年代初期兴起的一项蛋白质提纯技术，它的基本原理是利用表面活性剂在有机溶剂中形成一个个胶团，极性基团向内排列，而形成极性区域，胶团内部能为酶提供最佳微环境，在热力学上稳定且表面活性剂的性质和水含量最佳化时，反向胶束系统中的酶稳定性可大大提高。
酶分子可容纳于此，这样酶分子就可与其他杂质分
开。
与其他提纯手段相比，反向胶束系统更适于工业化生产。
单宁酶活力测定方法
单宁酶活力测定方法有滴定法、紫外分光光度法、比色法以及高效液相色谱法, 各种方法基本原理简述如下.
滴定法
由于单宁在单宁酶作用下分解生成游离的没食子酸，可用碱对之进行滴定，确定底物单宁的减少量而测得酶活力。
但是，因为缓冲液对碱的缓冲力以及单宁本身的褐色干扰了滴定终点，再者，随溶液pH值增高，单宁会逐渐发生水解，将影响测定结果的稳定性与准确性。
紫外分光光度法
日本Sadaaki Iibuchi 等于1967年建立了紫外分光光度法，基本原理是通过测定底物单宁反应前后在紫外光区310nm处光密度的变化，求得单宁酶活力。
这个方法成为以后单宁酶活力测定的经典方法。
此法简单快捷，且误差在1%～3%之间，但底物单宁纯度要求非常高。
1995年, Sadaaki Iibuchi建立的紫外分光光度法基础上，改建了单宁酶活力测定方法，以没食子酸丙酯(PG)为底物，在270 nm处,PG浓度在一定范围内与吸光度成正比，根据此原理建立的酶活力测定方法，简便灵敏，重复性好。
视读法
1993年，澳大利亚科学家O saw e R.等建立了细菌单宁酶活力测定方法，其根据有两点：
a. 单宁可水解生成游离的没食子酸；
b. 没食子酸在空气中暴露被氧化，颜色从绿色变成褐色。
通过比色求其变化量而测得酶活力。
高效液相色谱法
1994年, 法国的Chantal Barthomeuf等用高效液相色谱法连续测定反应过程中产物没食子酸变化量，直接测定出酶反应的初速度，此法迅速准确，但对仪器要求较高。