生物工程下游分离与纯化

本课程解决的问题-下游技术
生物分离的一般过程
发酵液/天 然动/植物
预处理
粉碎/加热 溶解/调pH 絮凝或凝聚 再凝聚等
胞外产物
固液分离
沉降 过滤 离心
细胞破碎
均质 超声 研磨 溶胞
细胞碎 片分离
离心分离 萃取 过滤
初步纯化
沉淀 吸附 萃取 膜过滤
高度纯化
吸附色谱 分配色谱 离子交换 凝胶色谱 亲和色谱 液相色谱
产品及包装加工
无菌过滤 超滤 冷冻干燥 真空干燥 喷雾干燥 结晶
What? 课程基本内容
• 1. 生物工程下游技术的特点和一般流程 • 2. 生物样品的预处理 （凝聚、絮凝、沉降、过滤、离心 ） • 3. 膜分离技术 (微滤、超滤、纳滤、反渗透、电渗析、透析等） • 4. 色谱分离技术 （吸附/分配/ 离子交换/凝胶/亲和） • 5. 离子交换与吸附（阳离子交换、阴离子交换、吸附分离） • 6. 萃取技术（ 溶剂/双水相/超临界） • 7. 电泳技术（等电聚焦/毛细管电泳/制备电泳） • 8. 生物样品的精制——浓缩结晶干燥
分离工程研发费用与成本
• 研究费用： 50%以上 • 产品成本： 40-80% • 人力物力： 70-90%
生物分离纯化需满足的要求——具体化
• ① 操作条件必须温和，特别是对具有生物活性的物质，在 后处理过 程中必须保持其生物活性；
• ② 分离纯化技术的选择性和专一性强，能从复杂的混合物 中有效地 将目的产物分离出来，达到较高的分离纯化倍数；
生物工程产品的特点
• ① 产物在初始物料中的含量低（ 氧传递限制；细胞量；产 物抑制 ）
• ② 初始原料的组成成分复杂（ 大分子;小分子;可溶物;不可 溶物;化 学添加物）；
• ③ 产品中有时含有微生物的细胞、代谢产物、残留培养基； • ④ 生物活性物质的稳定性差（对pH、温度、金属离子、有
机溶剂、
严谨而复杂的清除代谢废物过程！
从以上两个实例：从复杂的体系中分离纯化出目的 产物或者分离清除出代谢废物的过程至关重要！
生物技术专业还开设一门课称为《生物过程下游工艺》
生物制品生产过程示意图
生物催化剂
空气
检测 控制系统
除菌
上
游
提取纯化
生物反应器
过
程
灭菌
副产品 产品Baidu Nhomakorabea废弃物
原材料
机械能、热能
中游技术
80%乙腈 洗脱
紫
大孔吸附树脂 杉
脱色提取
醇 粗
提
物
8-12h
或纳滤浓缩
收 集
45℃减压蒸发
有
机
物
严谨而复杂的分离纯化过程！
实例二 血液透析
是急慢性肾功能衰竭患者肾脏替代治疗方式之一。它通过将体内血液引流 至体外，经一个由无数根空心纤维组成的透析器中，血液与含机体浓度相似的 电解质溶液（透析液）在一根根空心纤维内外，通过弥散/对流进行物质交换 ，清除体内的代谢废物、维持电解质和酸碱平衡；同时清除体内过多的水分， 并将经过净化的血液回输的整个过程称为血液透析。
★纯化精制阶段是在初级分离的基础上，用各种高选择性的技术手段，将 目的产物和干扰杂质尽可能地分开，使产物的纯度达到相关的要求。
活性物质分离纯化工艺选择原则
• 质量原则：保证产品的高质量，一是所选择的分离纯化方法要有利于最 大程度的去除杂质。二是在分离纯化过程中要防止生物活性物质的降解 失活。
• 收率原则：工艺条件优化时，必须考虑收率的最大化。收率与纯度是一 对矛盾体，通过工艺优化研究可以使收率与纯度都达到最佳值。
生物工程下游分离与纯化
让我们从两个实例说起
实例一 紫杉醇
树白皮色粉结碎晶---体-8粉5-9末5%。酒无精臭-，---无35味-5。5℃水热难回溶流，浸溶提于三氯次仿--、--5丙0-酮70。℃真空减压浓缩---氯紫仿杉萃醇取主--要--得适1用%于氯卵仿巢膏癌---和-氯乳仿腺完癌全，溶对解肺--癌--硅、胶大搅肠拌癌均、匀黑-色---素干瘤燥、---头-过颈筛部--癌--装、 层淋析巴柱瘤--、--氯脑仿瘤-也甲都醇有梯一度定洗疗脱效---。-浓缩----得5～8%半成品----丙酮溶解----硅胶搅拌 均1匀96-3--年-干美燥国--化--过学筛家-瓦---尼装从层美析国柱西---部-丙大酮森－林石太油平醚洋梯杉度（洗P脱ac-i-f-i-c浓Ye缩w-）---也得叫20短～叶25% 半红成豆品杉---树-丙皮酮和-石木油材醚分-离---得结到晶。3～4次----抽滤----50℃真空减压干燥----得75～80% 半从成红品豆---杉-16中M如pa何压获力得层的析呢分？离----浓缩----丙酮－石油醚结晶----抽滤----干燥，得 99．5%成品。
生物工程下游分离过程的特点
• ↗满足维持生物物质活性的要求 • ↗满足快速分离的要求 • ↗满足纯度和杂质去除的要求 • ↗满足高效分离的要求 • ↗满足成本优化的要求
生物分离的经济性
• (1) 生物分离至少占总成本50% • (2) 降低废物排放（有时甚至产品：废物=1:3250) • (3) 工艺改造
严谨而复杂的分离纯化过程！
从杉树中提取，破坏环境、破坏植物多样性、各国明令禁止！
内 生 发酵培养1个月
真
菌
20-25℃
紫
杉 醇 预处理
冷 冻
发
离
酵
心
3min
过 滤
液
滤 等体积萃取液 液 氯仿：甲醇=10:1
萃取
高
纯
度
硅胶柱层析
正 己 烷
紫 （去除酯、蜡等杂质） 杉
醇
紫
结 晶
杉 醇
真空干燥 40℃
晶 体
• 时间原则：一是掌握生物活性物质稳定性的时间；二是工艺路线设计时 各单元操作所需时间的匹配，尽量节省时间。
生物分离纯化的基本策略
• 下游分离纯化工作前的准备：全面的调查分析 ，充分地论证；准备充 足的实验和生产设备
• 提取工艺： 尽可能选择简单的提取工艺 • 分离纯化步骤：
① 原材料的预处理 ② 颗粒性杂质的去除——固液分离（离心法、过滤法） ③ 可溶性杂质的去除和目标产物的初步纯化（选择性沉淀、膜过滤、 选择性吸附以及萃取等技术，去除与目标产物混溶的可溶性杂质；必 要时采用集成分离技术） ④目标产物的精制（如：层析法和电泳法） • 工艺放大策略 ：小试－中试－大规模生产
• ③ 目的产物的量和活性具有较高的收率； • ④ 在提高单个分离技术效率的同时，注意各单元操作间的
分离纯化路线包括两个基本阶段
① 产物的初级分离阶段 ★初级分离阶段在细胞培养结束之后，主要是分离细胞和培养液、破碎细
胞释放产物（如胞内酶），溶解包涵体，复原蛋白质，浓缩产物和去除 大部分杂质等。
② 产物的纯化精制阶段