肿瘤耐药基因检测的临床应用

肿瘤耐药基因检测的临床应用

摘要目的：探讨耐药基因组合检测的临床应用问题和表达结果与药物间在个体化化疗中的适配分析。方法：90例恶性肿瘤病例，应用免疫组化染色检测耐药基因TS、GST-Pi、TOPOⅡ和Ki-67的表达结果用以指导临床化疗；以定性结果与不同的半定量表达法结合指导选药作适配分析。结果：总的阳性表达率TS48%，GST-Pi69%，Ki-67和TOPOⅡ均为99%，而同一耐药基因表达产物在不同类型肿瘤组织中的阳性表达率，TS为41%~100%，GST-Pi为24%~91%；在阳性半定量中，TS为10%~60%，GST-Pi和TOPOⅡ均为10%~80%，Ki-67为10%~90%。三组适配分析方案中，以定性结果指导选药，两类以上药物适配的病例只有66%；而以定性结合分级定量结果指导选药可达到80%；再以定性联合百分比定量结果指导选药则上升到99%。结论：TS、GST-Pi、TOPOⅡ和Ki-67组合检测，基本上满足各类恶性肿瘤耐药基因的检测需要；定性联合百分比定量结果指导选药能够达到“个体化”的最佳适配。

关键词耐药基因临床应用半定量表达法药物适配

资料与方法

选择2005年7月~2006年8月在我院行手术治疗患者，患方同意该项检测的，术前未使用化疗、放疗和免疫治疗的恶性肿瘤病例的术后标本90例。男51例，女39例。年龄10~79岁，平均53岁。样本包括：腺癌41例，鳞癌18例，乳腺浸润性导管癌11例，非霍奇金恶性淋巴瘤5例，浸润性小叶癌2例，滑膜肉瘤2例，大细胞间变型淋巴瘤、霍奇金恶性淋巴瘤、多型性胶质母细胞瘤、骨巨细胞瘤、肝细胞癌、上皮样平滑肌肉瘤、胃间质肿瘤、粒层细胞瘤、无性细胞瘤、恶纤组和恶性神经鞘瘤各1例。

标本处理和免疫组化染色：标本均用4%中性甲醛固定，组织处理温度≤60℃，石蜡包埋，每例选择1个典型肿瘤蜡块，连续切片厚4μm。玻片用2%APES的纯丙酮溶液涂布。应用标记的葡聚糖-聚合物免疫组化染色法（LDP两步法），采

用3%H2O2孵育阻断内源性过氧化物酶、柠檬酸缓冲液高压锅抗原修复。

定性分析:①阳性：TS和GST-Pi胞浆/胞核胞浆均染成棕黄色，TOPOⅡ和Kl-67胞核染成棕黄色则判为阳性细胞［2］。②阴性：TS和GST-Pi胞浆无着色，TOPOⅡ和Ki-67胞核无着色，或与背景颜色一致，或阳性细胞＜5%则判为阴性。

半定量分析:①分级表达法（DAKO 基因公司推荐的常用标准）: 阳性细胞数5-25%（+），25-75%（+[KG-*2]+），＞75%（+[KG-*2]+[KG-*2]+）。②百分比表达法（我们摸索的标准，理论根据见讨论部分）：阳性细胞数精确到10%。

结果

切片染色背景清晰，阴性与阳性细胞对比鲜明。

统计分析:①定性分析结果见表。②半定量分析结果：a.分级表达结果：TS:（+）21例，（+[KG-*2]+）22例；GST-Pi：（+）11例，（+[KG-*2]+）48例，（+[KG-*2]+[KG-*2]+）3例；TOPOⅡ：（+）23例，（+[KG-*2]+）65例，（+[KG-*2]+[KG-*2]+）1例；Ki-67：（+）9例，（+[KG-*2]+）72例，（+[KG-*2]+[KG-*2]+）8例。b.百分比表达结果：TS：32%（10~60）；GST-Pi：49%（10~80）；TOPOⅡ：36%（10~80）；Ki-67：53%（10~90）。

讨论

结果分析:①两种半定量表达法比较在定性分析中，三种耐药基因的阳性表达率均较高，而同一耐药基因表达产物在不同类型肿瘤组织中的阳性表达率亦有差异，表明相同类型肿瘤个体间和不同类型肿瘤间均存在耐药差异，故耐药基因检测具有重要的临床意义。在半定量分析中，三种耐药基因阳性定量在各个体间变异较大（10%~90%），分级表达法中25%与75%的阳性表达细胞数划分在同一级中，其差异太大，不能精确反映出个体间的变异，从分级表达统计结果中可见（+[KG-*2]+）均占阳性病例的大部分，表明直接影响总体精确度的反映；而百分比表达法精确到10%时，即使误差也不会导致如此大的表达值差异，从而较精确地反映出个体化的具体变异值，而且有助于选择药物与耐药基因表达结果间达到最佳适配（见后文），也可根据个体对各类药物敏感细胞的比例作为相应药物用量比例的参考；配合Ki-67的表达结果，有助于周期特异性与非特异性抗癌药物的较好搭配与选择。由于Topo II也作为细胞增殖指数［１］，基本上可替代Ki-67表达的意义，但我们的结果中Topo II半定量（36%）低于Ki-67（53%），并不能完全替代Ki-67表达的意义。②根据耐药机制将耐药基因检测阳性结果与不同的半定量表达法结合直接影响化疗选药与检测结果间的适配；三种适配分析方案中，如果仅以定性结果指导选药，达到两大类以上药物适配，即两类以上药物敏感细胞百分比之和达到110%~200%的病例只有66%；如以定性结合分级定量结果指导选药，达到上述标准的病例可达到80%；若以定性联合百分比定量结果指导选药达到同样标准的病例则上升到99% (仅1例乳腺浸润性导管癌为一类药物适配，但GST-Pi与ER、PR的表达呈负相关［3］，本例ER、PR亦阳性）；结果表明三种方案中以定性联合百分比定量结果指导选药能达到二者间的最佳适配，更精确地反映“个体化”特点，且在同等检测条件下获得优于其他方法的效果，则最大限度地利用了资源。如果增加目前进入临床的耐药基因抗体的检测种类，因其耐药谱与上述重叠，不能扩大耐药谱，故只宜与耐药谱相近的耐药基因抗体互换应用；如果减少检测种类，耐药谱过窄，可能出现无效检测，不能为患者提供有效的药物选择数据，也不能满足绝大多数类型恶性肿瘤的耐药检测需要，最终将使耐药基因检测无法推广应用。

结论:应用TS、GST-Pi、TOPOⅡ三项耐药基因和Ki-67组合检测，基本上满足各种类型恶性肿瘤的化疗选药需要，采用定性加百分比定量表达结果指导选药能获得二者间的最佳适配，用以指导化疗是有效解决肿瘤耐药的重要途径之一。