定向进化的方法
蛋白质的体外定向进化
蛋白质的体外定向进化概述蛋白质是生物体中起着重要作用的大分子有机化合物，具有广泛的生物功能。
研究人员通过对蛋白质结构与功能的深入探索，不仅能够揭示生命的奥秘，还能够为药物设计和工业生产等领域提供重要的指导。
然而，天然界中存在的蛋白质种类有限，无法满足人们日益增长的需求。
因此，开发新型蛋白质成为现代生物科学的热点之一。
蛋白质的设计与进化是一项关键性的工作。
体外定向进化是一种重要的蛋白质工程技术，通过在体外模拟自然界的进化过程，使蛋白质的性质得以改良和优化，以满足特定的应用需求。
蛋白质的体外定向进化流程蛋白质的体外定向进化通常包括以下步骤：1.库构建：首先，需要构建一个包含大量变异蛋白质的基因库。
这可以通过人工合成DNA序列、使用随机突变或利用现有的蛋白质序列进行改造等方式实现。
2.库筛选：将基因库中的变异蛋白质表达出来，并通过适当的筛选方法对其进行选择。
常见的筛选方法包括亲和层析、抗体标记、酶活性测定等。
3.评估鉴定：对筛选出的蛋白质进行鉴定，包括测定其结构、功能和稳定性等性质，并与天然蛋白质进行比较分析。
需要特别注意的是，鉴定过程中需要采用一系列的生物化学和生物物理方法，如质谱、光谱和动力学分析等。
4.优化进化：基于初步筛选和评估鉴定的结果，对筛选出的蛋白质进行进一步的优化和进化。
这可以通过遗传算法、DNA重组技术、蛋白质工程等手段实现。
5.验证应用：最后，对优化后的蛋白质进行进一步的验证和应用，包括在生物医学研究、产业生产以及药物设计等领域的应用。
蛋白质的体外定向进化方法和技术蛋白质的体外定向进化涉及到多种方法和技术，以下是其中的一些常用手段：1.串联重组：将不同的蛋白质片段通过连接肽链的方式进行重组，生成具有新功能的蛋白质。
2.随机突变：利用化学方法或遗传方法对蛋白质的氨基酸序列进行随机改造，产生大量的变异蛋白质。
3.异源进化：将蛋白质序列从一个物种转移到另一个物种，通过适应新的环境条件，使其获得新的功能。
第八章 酶定向进化
其基本操作过程如下 : 靶基因经随机突 变产生含不同突变类型的亲本基因群, 用 DNase I 随机切割; 得到的片段经过不加 引物的多次PCR 循环, 在该过程中, 这些 片段之间互为引物和模板进行扩增, 直至 获得全长基因; 再加入基因的两端引物进 行常规PCR, 最终获得发生改组的基因库。
2.1交错延伸重组(Stagger extension process)
图给出最常用的大肠杆菌克隆用质粒pUC19的图 谱，此质粒的复制起点处序列经过改造，能高频 率起动质粒复制，使一个细菌pUC19的拷贝数可 达500-700个； 质粒携带一个抗氨芐青霉素基因，编码能水解β内酰胺环，从而破坏氨芐青霉素的酶，当用 pUC19转化细菌后放入含氨芐青霉素的培养基中， 凡不含pUC19者都不能生长，结果长出的细菌就 是都含有pUC19的。
它是由两个相互独立的关键技术组成. 一个是随机基因文 库的构建, 另一个是特定酶( 特别是增加催化活性、增强 选择性或稳定性) 的筛选策略。
第二节 定向进化的方法
一、酶基因的随机突变
1.易错PCR技术 (Error prone PCR)
易错PCR 是指从酶的单一基因出发，通过 改变PCR 的反应条件 , 使碱基在一定程度上 随机错配而引入多点突变, 构建 行全面的筛选。为此要求构建 可能完变基库容量。
所有的质粒载体都有三个 共同的特征：一个复制子、一 个选择性标志和一个克隆位点。 复制子是含有DNA复制起始 位点的一段DNA（ori），也包 括表达由质粒编码的复制必需 的RNA和蛋白质的基因。 选择性标志对于质粒在细 胞内持续存在时必不可少的。 克隆位点是限制性内切酶 切割位点，外源性DNA可由此插 入质粒内，而且并不影响质粒 的复制能力，或为宿主提供选 择性表型。
酶的定向进化的方法
酶的定向进化的方法酶是生物体内一类重要的催化剂，可加速生物体内化学反应的速率。
然而，自然界中存在的酶并不能完全满足人类的需求，因此科学家研究出了一种方法，即酶的定向进化，通过改变酶的结构和功能，使其具有更广泛的应用价值。
酶的定向进化是一种通过人工手段，模拟自然界的进化过程，从而改变酶的特性和功能的方法。
这种方法通过遗传学和分子生物学的手段，使酶在短时间内经历大量的变异和选择，从而获得新的性状和功能。
酶的定向进化主要包括以下几个步骤。
首先，选择一个目标酶，确定欲改变的特性和功能。
然后，通过基因工程的手段，产生一系列具有随机变异的酶库。
接下来，利用高通量筛选技术，对酶库进行筛选，选择出具有目标特性和功能的酶。
最后，对筛选出的酶进行进一步的优化和改良，以获得更理想的酶。
酶的定向进化的关键在于变异和选择。
变异是指通过基因工程手段，对酶的基因进行随机的改变，从而改变酶的结构和功能。
变异可以通过多种方法实现，如DNA重组、突变和错配PCR等。
选择是指通过对酶的筛选和评价，选择具有目标特性和功能的酶。
选择可以通过高通量筛选技术和活性测定等方法实现。
酶的定向进化可以用于改变酶的催化活性、底物特异性、热稳定性、耐酸碱性等特性。
例如，科学家可以通过酶的定向进化，使其在高温环境下仍能保持稳定的催化活性，从而应用于工业生产中。
此外，酶的定向进化还可以改变酶的底物特异性，使其能催化更多种类的化学反应，从而实现新药物的合成和有机合成的高效转化。
酶的定向进化在生物技术和工业生产中具有广泛的应用前景。
通过酶的定向进化，科学家可以设计和合成出具有特定功能和特性的酶，用于生物催化、药物合成、环境修复等领域。
此外，酶的定向进化还可以用于改良已有酶的性能，提高其催化效率和稳定性。
然而，酶的定向进化也存在一些挑战和限制。
首先，酶的定向进化是一项复杂而耗时的过程，需要经过多个步骤和多轮筛选。
其次，酶的定向进化的成功率并不高，往往需要大量的实验和尝试。
酶定向进化的原理和步骤
酶定向进化的原理和步骤
酶定向进化（enzyme directed evolution）是一种通过人为引
导的、基于自然选择原则的酶改造方法，可以用于提高酶的活性、稳
定性、底物范围等性质，以满足特定需要。
其原理和步骤如下：原理：
1. 酶定向进化是基于自然选择的原理。
通过引入随机突变和筛选操作，筛选出具有所需性质的变体酶，再通过重复这一过程，逐步改进和优
化酶的性能。
步骤：
1. 随机突变：通过诱发突变（例如随机突变、DNA Shuffling等）引
入酶的突变，得到一组具有多样性的突变体酶库。
2. 筛选/选优：通过选择性试剂、高通量筛选系统等手段，筛选
出表现出所需性质的突变体酶。
这一步骤需要对酶的目标特性进行准
确的定量、定性检测。
3. 特异突变体筛选：从筛选中得到的酶变体中，选出表现最佳
的数个突变体。
4. 突变组合：根据选出的突变体酶，通过多种方式（例如DNA Shuffling等）进行突变位点的组合，产生更多的突变体酶。
5. 筛选与优化：通过筛选和优化，选出具有更好性质的突变体酶。
6. 反馈循环：重复上述步骤，逐步优化酶的性质，直到满足所需。
总体来说，酶定向进化是通过不断引入突变和选择操作来改良酶
的性能，然后通过逐步筛选和优化的方式，在突变体酶库中逐渐筛选
出具有所需特性的酶。
酶定向进化的原理和步骤
酶定向进化的原理和步骤酶定向进化（Enzyme Directed Evolution）是一种模仿自然界生物进化机制的方法，用于创造或改良具有特定功能的酶。
这种方法通常涉及到以下几个关键步骤：
原理：
酶定向进化是基于达尔文的自然选择原理，通过迭代的方式筛选和优化酶的活性。
这个过程模拟了自然环境下生物进化的过程，但是速度快很多，可以在实验室条件下完成。
步骤：
1. 目标功能的确定：首先，研究人员需要确定希望改进或获得的酶的目标功能，例如催化特定反应的能力、耐受极端环境的稳定性等。
2. 构建突变库：接着，通过各种手段（如PCR、DNA合成错误、化学转化等）在酶的编码基因中引入随机突变，构建一个含有大量遗传变异的突变库。
3. 筛选和选择：将突变库中的所有突变酶进行表达，并通过高通量筛选技术检验它们的功能。
这可能包括在体外测试它们的催化活性，或者在宿主细胞内评估它们的表达水
平和稳定性。
4. 定向进化循环：挑选出表现最佳的突变酶，再次引入新的突变，然后重复筛选和选择过程。
每一轮的筛选都是针对之前未满足的特性进行的，以期望逐步逼近理想的酶功能。
5. 分析和优化：在定向进化的过程中，可以通过测序、X射线晶体学、核磁共振等技术来分析酶的结构和功能关系，以指导后续的突变策略。
6. 验证和应用：最后，经过多轮优化的酶将被验证其在实际应用中的性能，并可能被进一步开发作为商业产品。
酶定向进化技术已经成功应用于多种酶的改造，包括氨基酸转运蛋白、脂肪酶、淀粉酶等，并且在药物制造、生物燃料生产、食品工业等领域显示出巨大的潜力。
定向进化例子
定向进化例子
定向进化是指通过人工干预，使生物体在特定方向上进化，以适应特定的环境或实现某些特定的功能。
以下是一些定向进化的例子：
1. 工业酶的定向进化：通过改变酶的底物或产物范围，提高酶的活性或改变酶的反应条件，使其在恶劣的工业环境中仍能高效工作。
例如，改变酶的底物特异性，成功合成新型抗生素前体或用于大规模生产异丁醇生物燃料。
2. 抗体的定向进化：通过改变抗体的亲和力、特异性或抗体的性质，使其在治疗或诊断中具有更好的效果。
例如，利用进化筛选来的人源化抗体，用于治疗类风湿性关节炎，彻底解决了异源抗体的免疫排斥问题。
3. 生物体的定向进化：通过基因编辑技术，使生物体在特定方向上进化，以适应特定的环境或实现某些特定的功能。
例如，为了适应高草地环境，人们通过基因编辑技术使长颈鹿的长脖子更长，以便它们能够吃到高处的叶子；或者使北极熊的毛皮更厚，以抵御寒冷的环境。
以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅相关文献或咨询生物学家。
定向进化的原理和步骤
定向进化的原理和步骤•定向进化的原理是利用人工手段产生基因多样性和选择压力，从而筛选出具有期望特征的蛋白质或核酸。
•定向进化的步骤一般包括以下几个方面：o选择初始目标蛋白或核酸：根据研究目的和需求，选择一个具有潜在功能或改造空间的蛋白或核酸作为进化的起点。
o构建突变体文库：利用不同的方法对目标蛋白或核酸的编码基因进行突变或重组，创造出大量的序列变异，形成一个多样性的文库。
突变或重组的方法可以分为随机进化、半理性进化和理性进化三种策略，根据对目标蛋白或核酸的结构和功能信息的不同程度，选择合适的方法。
o表达和筛选突变体：将突变体文库导入合适的表达系统，使之转化为蛋白或核酸，并通过高效的筛选方法，从文库中挑选出具有改进或新颖特征的突变体。
筛选方法可以根据目标特征的不同，选择不同的指标和条件。
o重复进化过程：将筛选出来的优良突变体作为下一轮进化的模板，重复上述步骤，直到达到预期的目标或无法继续改进为止。
定向进化的应用和前景•定向进化是一种有效的改造和创造生物分子功能的方法，它在生物催化、生物医药、合成生物学等领域有着广泛的应用和前景。
•在生物催化领域，定向进化可以用于改善或创造新型的酶催化剂，提高其活性、稳定性、特异性、耐受性等性能，从而实现高效、环保、经济的生物转化过程。
例如，通过定向进化，人们已经成功地开发了一些具有工业价值的酶催化剂，如抗溶血素B、绿色荧光蛋白、聚合酶等。
•在生物医药领域，定向进化可以用于改善或创造新型的药物分子，提高其效力、选择性、安全性、递送性等性能，从而实现更有效、更个性化、更靶向的治疗方案。
例如，通过定向进化，人们已经成功地开发了一些具有临床价值的药物分子，如抗体、疫苗、基因治疗载体等。
•在合成生物学领域，定向进化可以用于改善或创造新型的生物模块，提高其功能、可靠性、兼容性等性能，从而实现更复杂、更灵活、更智能的人工生命系统。
例如，通过定向进化，人们已经成功地开发了一些具有创新意义的生物模块，如开关、计数器、振荡器等。
酶的定向进化方法
酶的定向进化方法一、随机突变与筛选/选择随机突变和筛选/选择是传统的酶优化方法之一、通过实验手段引入突变体库，其中每个突变体都带有一个或多个氨基酸的突变，从而改变了酶的催化性能和特性。
然后通过筛选/选择酶的突变体库，选出具有更好性能的突变体。
随机突变是通过不同的方法引入突变体库，如辐射突变、化学突变和PCR突变等。
这些突变能导致氨基酸序列上的单个或多个碱基的突变，进而改变酶的蛋白质结构和功能。
筛选/选择是通过其中一种策略或实验步骤，将突变体库中具有更好性能的突变体选出。
这种方法可以通过酶活性检测、底物特异性筛选、抗体亲和性或酶稳定性等筛选/选择技术来实现。
二、衍生物的进化衍生物的进化是一种利用酶的天然亲和力进行定向进化的方法。
酶可以选择结合和催化一些化合物，例如酶底物或抑制剂。
利用这些底物或抑制剂的结构特征，可以设计出一系列的衍生物。
这些衍生物能与酶结合和催化，但其结合或催化性能可能比天然的底物或抑制剂更好。
通过衍生物进化，可以得到具有更高催化活性、更高底物特异性、更好稳定性或更高抑制剂亲和性的酶。
为了实现衍生物进化，需要结合合理的设计和筛选技术，如重组DNA技术、高通量筛选技术和计算模拟等。
三、DNA重组技术DNA重组技术是酶定向进化的重要手段之一，通过改变酶的基因序列，可以产生新的突变体库。
DNA重组技术通常包括酶的突变、重组和筛选等步骤。
酶的突变可以通过随机突变、有限突变或定向突变等方法实现。
随机突变通过PCR反应引入突变体库；有限突变通过合成含有特定突变位点的寡核苷酸引入突变体库；定向突变利用镊刀酶等限制修饰酶切剪酶切剪、回收酶片段并用酶反应体外合成而成的、含有特定突变位点的DNA片段。
酶的重组是将不同的突变体的DNA片段进行拼接，形成新的DNA片段，从而得到含有多个突变位点的突变体。
可以通过拼接PCR、敏感蛋白酶切剪、局部重组/突变或基因片段替换等方法进行酶的重组。
酶的筛选是通过一系列实验和检测步骤，对突变体库进行筛选，选出具有更好性能和特性的酶。
酶分子定向进化技术的原理,发展和应用
酶分子定向进化技术的原理,发展和应用一、引言酶分子定向进化技术是一种利用人工手段来加速酶的进化过程，以获取具有特定功能的酶分子的方法。
这一技术的发展，为生物科技领域带来了革命性的变化，为医药、能源、化工等领域提供了更加高效、环保的解决方案。
本文将对酶分子定向进化技术的原理、发展和应用进行深入探讨，希望能够让读者对这一技术有更深入的了解。
二、酶分子定向进化技术的原理1. 酶的定向进化原理酶分子定向进化技术的原理基于遗传学中的自然选择与突变原理，通过模拟自然界中的演化过程，人为地筛选和改造酶的DNA序列，使其在实验室条件下得到指定的功能。
具体而言，该技术包括以下几个步骤：(1) 酶库构建：通过收集、分离和筛选具有潜在进化价值的酶资源，构建一个原始的酶库。
(2) DNA随机突变：对酶的DNA序列进行随机突变，产生大量变异的酶序列。
(3) 筛选与筛除：将变异的酶序列进行筛选，保留具有目标功能的酶序列，淘汰其他无用的序列。
(4) 重复进化：通过多次重复的突变、筛选和繁殖过程，逐渐获得更符合要求的酶序列。
这一过程模拟了自然选择与突变的原理，通过实验室条件下的人为筛选与改造，最终获得了具有特定功能的酶分子。
2. 酶分子定向进化技术的原理意义酶分子定向进化技术的原理意义在于，通过人工手段对酶进行改造和优化，获取具有特定功能的酶，为人类创造了更多的生物资源。
由于天然界中存在的酶种类有限，而许多工业和生物医药领域需要定制的酶来完成特定的反应和功能，因此酶分子定向进化技术的意义不言而喻。
通过这一技术，研究人员可以获取到更为适用于特定领域的酶资源，推动了生物技术领域的快速发展。
三、酶分子定向进化技术的发展历程1. 初期探索与应用酶分子定向进化技术最早可以追溯到上世纪90年代初，当时科学家们首次尝试通过体外实验室进化来改进酶的性质。
从那时起，人们就意识到酶分子定向进化技术的巨大潜力，并开始进行更为深入的研究与应用。
早期的应用主要集中在从事生物制药和有机合成反应等领域，对酶进行改造和优化，以获得更高效的反应催化剂。
分子定向进化
分子定向进化
分子定向进化是一种利用分子生物学技术进行生物进化的方法。
它通过改变DNA序列来创造新的蛋白质、酶或其他生物分子，以实现特定的目标。
这种方法的应用范围广泛，可以用于药物研发、酶工程、农业改良等领域。
在分子定向进化中，首先需要选择一个具有潜力的分子，如酶或抗体。
然后，通过人工改变其DNA序列，引入多样性。
这种多样性可以通过随机突变、DNA重组或基因片段插入等方式引入。
接下来，需要对这些变异体进行筛选，以找到具有所需性能的变异体。
筛选方法通常是设计一种适合特定目标的高通量筛选方法，如酶活性测定、抗体结合实验等。
通过重复这个循环，可以逐步提高所需性能并优化变异体。
分子定向进化的核心是模拟自然选择的过程。
通过引入多样性和筛选，可以在实验室中模拟自然界中的进化过程。
这种方法的优点是速度快、效率高，可以在较短的时间内创造出具有所需性能的分子。
与传统的基因工程方法相比，分子定向进化更加灵活和高效。
分子定向进化的应用非常广泛。
在药物研发中，可以通过分子定向进化来优化药物的效果、改善药物的稳定性和生物利用度。
在酶工程中，可以利用分子定向进化来改善酶的催化活性、稳定性和特异性。
在农业改良中，可以利用分子定向进化来提高农作物的抗病性、耐盐碱性等性状。
分子定向进化是一种强大的工具，可以用于改良生物分子的性能。
它在药物研发、酶工程、农业改良等领域具有广泛的应用前景。
通过模拟自然选择的过程，可以在实验室中创造出具有所需性能的分子，从而推动科学研究和应用的发展。
酶的改造
Myc ds-DNA的富集
实例：天冬氨酸转氨酶的热稳定性的定向进化
研究内容及执行情况
高通量筛选方法的建立
生物信息学技术手段的建立 天冬氨酸转氨酶热稳定性的改造
高通量筛选方法的建立
基于酶联免疫分析方法，选用医用检测试剂盒作为
检测试剂，建立了快速高效的酶活性检测方法，结合 使用96孔酶标板，形成了酶的高通量筛选方法。
提高镁离子浓度（常规PCR时浓度为0.5-2.5mmol/L）； 添加一定浓度的锰离子；
易错PCR方法实例
1993年，Chen and Arnold在非水相DMF中，定 向进化枯草杆菌蛋白酶E活力获得成功，在60
％和85％的DMF中，活力分别提高256和131倍；
优点：操作简便，随机用于较小基因的定向进化
科学家在线形虫体内植入 绿色荧光蛋白质
绿荧光水母—通过体内绿色 荧光蛋白发光
绿色荧光蛋白的应用
分子标记：GFP标记的微管结构
绿色荧光蛋白的应用
(a)
(b)
(c)
（d）
(e)
分子标记： FISH分析菌株
（a）未加探针；（b）DAPI染色（c）α-探针杂交（d） Msint-1268探针杂交菌株Y1；（e）Msint-1268探针杂交M. trichosporium OB3b
4、定向进化的原理
在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合 酶不具有3’->5’校对功能的性质，配合适当条件， 以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变 库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶 (或蛋白质)，从而排除其他突变体。 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者 虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选 择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个 进化过程完全是在人为控制下进行的
蛋白质工程定向进化
蛋白质工程定向进化概述蛋白质工程定向进化是一种通过改变蛋白质的氨基酸序列和结构，从而创造新的功能和性质的生物技术方法。
其在药物研发、酶工程和功能蛋白设计等领域具有广泛的应用。
蛋白质工程定向进化的基本原理蛋白质工程定向进化的基本原理是通过模拟自然界中的进化过程，从大量的蛋白质变异体中筛选出具有特定功能和性质的蛋白质。
1. 构建蛋白质变异库为了利用蛋白质工程定向进化的方法，首先需要构建一个包含大量蛋白质变异体的库。
这可以通过多种方法实现，如随机突变、DNA重组和基因片段替换等。
2. 筛选和筛选条件优化构建蛋白质变异库后，需要使用适当的筛选方法和筛选条件来筛选出具有所需功能和性质的蛋白质。
筛选方法可以是高通量筛选、酶活性测定、抗体结合等。
为了提高筛选效率，还可以通过筛选条件的优化来改进筛选系统。
例如，可调节温度、pH值、盐浓度等条件，以提高筛选的灵敏度和特异性。
3. 进一步优化和改良从筛选中获得的蛋白质变异体可能仍然存在改良的空间。
这时可以通过进一步的蛋白质优化和工程来改善其性能。
常见的优化方法包括有限制性水解、点突变、插入和删除氨基酸等。
优化的目标通常是提高蛋白质的稳定性、活性和选择性。
蛋白质工程定向进化在药物研发中的应用蛋白质工程定向进化在药物研发中具有重要的应用价值。
通过改变蛋白质的结构和功能，可以获得具有更好疗效和更低副作用的药物。
1. 抗体药物定向进化可以用于提高抗体药物的亲和力和特异性。
通过对抗体的变异和选择，可以获得更好的结合亲和力和更低的非特异性结合，从而提高药物的疗效和安全性。
2. 酶替代治疗定向进化也可以用于改进酶替代治疗的效果。
通过改变酶的催化效率、稳定性和特异性，可以获得更有效的酶替代治疗药物。
3. 蛋白质药物输送蛋白质工程定向进化还可以用于改进蛋白质药物的输送系统。
通过改变蛋白质的结构和亲和性，可以实现药物的准确输送和控制释放。
蛋白质工程定向进化在酶工程中的应用蛋白质工程定向进化在酶工程中也具有广泛的应用。
蛋白质分子定向进化其他方法
蛋白质分子定向进化其他方法自然界在长期的进化过程中．产生了许多具有重要功能的符合人们需要的理想蛋白质，然而，当它们处于复杂的化学反应体系时，则往往不能满足人们的需要。
为此，必须不断推出新的方法来改造现有的蛋白质，以满足工业的需要。
自然进化是有机体在长期的进化过程中自发出现的非常缓慢的过程。
自然选择往往是朝着有利于机体的方向进行的。
大量定点基因突变实验表明，蛋白质功能和性质的改变来自于许多小的内部修饰的积累，这些小的修饰或突变分布于较大的序列空间内，人们试图利用已有的结构生物学信息对蛋白质进行合理设计（rational design），但蛋白质结构的复杂性极大地增加了合理设计的难度，更何况，对于大多数要改造的蛋白质来说，我们并不清楚其三维结构信息，不能进行合理设计，而近年来发展的分子定向进化（molecular directed evolution）策略属于蛋白质的非合理设计范畴，它不需要事先了解蛋白质的三维结构信息和作用机制，而是在体外模拟自然进化的过程（随机突变、重组和选择），使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能，从而在几天或几周内实现自然界需数百万年才能完成的事情。
定向进化第一步是由一个靶基因或一群相关的家族基因起始创建分子多样性（突变和／或重组）；然后对该多样性文库的基因产物进行筛选，那些编码改进功能产物的基因被利用来继续下一轮进化；重复这个过程直到达到目标。
该进化策略有以下三个显著特征：a.进化的每一关键步骤都受到严密控制；b.除修饰改善蛋白质已有特性和功能外，还可引入一个全新的功能，来执行从不被生物体所要求的反应；甚至为生物体策划一个新的代谢途径；c.能从进化结果中探索蛋白质结构和功能的基本特征。
蛋白质定向进化通常分三步进行：基因随机诱变、体外重组和筛选。
每一步都可以有多种方法。
常见的定向进化方法有：①易错PCR技术②DNA改组技术③外显子改组④交错延伸重组⑤随机引物体外重组法（RPR）。
什么是定向进化？
什么是定向进化？定向进化是一种生物进化理论，也被称为领域进化、方向进化、目标进化等，指的是生物种群在进化中受到某些环境因素的限制，从而出现个体特征的偏向性。
在生物进化的过程中，自然选择是起到决定性作用的因素。
而定向进化则是一种受到环境因素联系的选择策略。
比如当被捕食者仅挑选某一种外表特征的猎物时，这种外表特征和生存能力之间的关联就被强化了，进而导致定向进化的出现。
那么定向进化具体是如何进行的呢？1. 针对某种环境压力的选择策略生物在进化过程中，会根据环境变化，发生适应性进化，以适应外部压力。
而当环境压力呈现一定的趋势，生物自然也会发生相应的变化，以适应环境压力，并逐步形成定向进化。
例如，若某个地区食物素来不足，那么生物就会发生相应的进化，以适应缺乏食物的环境，食物占份额大的物种会发展体积较小的个体，而易于把握食物的物种会发展具有灵活性的身体构造，以保证其生存。
2. 人为选择人类的文化活动也能影响到生物的进化，比如养殖业中根据需求，人们通过生产力的选择来繁殖具有特定特征的生物。
在产业化的所谓小包装时代里，鸡的产蛋能力就是个明显的例子，而奶牛乳量、肉鸭重量等就更加显而易见。
3. 基因漂变及突变基因漂变及基因突变是定向进化中的两个常见现象。
因为基因漂变及基因突变都代表了基因发生了一些不可逆转的变化，这些变化可以反映出环境及生物的进化历程。
基因漂变在定向进化中的表现是某些群体具有特定的基因型，并随着环境的变化而逐渐被其他群体所替代；基因突变表现为新型群体的突然出现和有继承关系的新特征。
生物的个体变异异千差万别，会产生各种各样的特征，有利于其迅速地适应新情况，进而形成新的物种。
总结定向进化是解析生物进化过程的重要工具之一。
尽管对于生物的进化在研究中还存在一些难题，但定向进化已经成为了理解及预测生物进化的一个重要论据。
在未来的研究过程中，定向进化将在许多领域发挥更加重要的作用。
分子定向进化
分子定向进化是指模仿自然进化过程的策略，通过人为操作实现分子的改造。
这种进化方法无需预先了解蛋白质的结构和作用机制，即可获得具有特定功能或全新功能的蛋白质或DNA。
定向进化通常从靶基因或一组相关家族基因或DNA 开始，通过突变或重组等手段创建分子的多样性，然后对多样性文库进行筛选，以获得具有新功能的基因或DNA。
定向进化可以在试管中模拟达尔文进化过程，按需施加选择压力，以筛选出具有期望特征的蛋白质，从而在分子层面上实现模拟进化。
这种方法已被广泛用于改善蛋白质性能，比如改进蛋白质药物的稳定性、半衰期、免疫原性，开发酶的新底物利用以及改进或拓展新的代谢途径等。
定向进化常用的策略包括易错PCR技术，这种方法对于建立任意核苷酸序列文库或在表达及筛选过程引入突变同样有用。
分子定向进化
该技术打破不同种、属间的遗传界限,利用同源 基因之间的同源序列进行DNA改组,通过提高亲本 基因群中差异的地产生满足需要的突变体。与其他DNA改组 技术相比,DNA家族改组技术不仅可以显著加速有 益突变的累积,还易于实现目的蛋白多种特性的共 进化。
图2 重叠延伸PCR技术流程
A、D分别表示基因上下游引物；B、C分别表示靶位点正反向突变引物；基因上 的黑色区域为靶位点，NNN表示兼并引物或突变核苷酸
该法主要优点: (1)能方便地对基因中间的靶位点进行点饱和 突变,解决中间靶位点不易突变的难题; (2)突变与重组同时完成,大大缩短实验周期; (3)不存在突变修复问题,容易筛选出全部突
④DNA改组比随机突变显著提高了良性突变 的概率。研究表明，DNA改组比随机突变 具有较大的优势，随机突变的方法一般产 生1%的良性突变，但DNA改组可产生13%的 良性突变。
Canada等通过对Burkholderia cepacia G4来源的甲
苯单加氧酶进行体外定向分子进化,以提高其对氯乙烯和 萘氧化物的活性。经过体外分子进化,获得活性提高的突 变酶。在大肠杆菌中表达突变的突变酶,其降解三氯乙烯、 二氯乙烯速率明显加快。表达突变酶的整个细胞的合成1萘酚速度比野生型的突变酶快6倍,而且突变酶其区域专一 性没有改变。进一步研究发现,在大肠杆菌中表达的突变 酶表现出对三环复合物菲、芴和蒽较野生型更快的氧化效 率。
费力、费时，且易出现同型碱基转换
2、 DNA shuffling
1994年,Stemmer在Nature发表了一篇题为Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling的文章,首次提出了DNA改组(DNA shuffling)技术。Stemmer以β-内酰胺酶系统为试 验对象,用DNA改组,经过三轮筛选和两次回交得到一
第九章分子定向进化
一、酶定向进化发展历史
定向进化是近20年发展起来的一项新技术， 是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白等分子 水平上的延伸和应用。它不需要深入了解蛋白质 的结构功能关系，在实验室条件下人工模拟生物 大分子自然进化过程，在体外对基因进行随机诱 变，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性 质的突变体，从而可以在短时间内实现自然界几 百万年才能完成的进化过程。
进行基因组改组首先需要有一个含有各种不 同正突变的基因组库(例如:通过经典的诱变育 种得到目的性状发生改进的不同的正突变菌株 就构成了所需的基因组库),随后通过原生质体 融合将这些正突变菌株的全基因组进行随机重 组,并筛选目的性状得到进一步改进的菌株来进 行下一轮基因组改组,这样,通过循环多轮的随 机重组可以快速、高效地选育出表型得到较大 改进的杂交菌种。
Crameri等通过DNA shuffling技术来改造砷抗性基因, 通过三轮的改组和筛选,得到了对砷的抗性提高40倍的突 变体,虽然在还原酶的基因里并未发现突变,但还原酶的活 性提高了近10倍,推测可能是侧翼序列突变引起的。
Suenaga等在序列分析的基础上,结合推理设计,构建 了12个定点的bphA1突变,其中3个突变酶改变了多氯联苯 复合物的降解特异性区域。尤其是Ile335Phe突变体在提 高了降解多氯联苯的能力外,还具备了降解2,3-双加氧酶 和3,4-双加氧酶的活性。
二、理性设计
➢ 寡核苷酸引物介导的定点突变 ➢ PCR介导的定点突变 ➢ 盒式突变
点饱和突变技术是通过对目的蛋白的编 码基因进行改造,短时间内获取靶位点氨基酸 分别被其它19种天然氨基酸所替代的突变子。 它不是定点突变技术的简单延伸,而是蛋白质 设计理念的全面升华,广泛地应用于蛋白质改 造及结构—功能关系研究中,并取得了一系列 令人瞩目的成绩。如利用点饱和突变技术鉴 定蛋白质功能位点,提高酶比活力,改善酶热 稳定性、底物结合特异性及立体异构特异性 等多方面性质。
分子定向进化
基因组改组重组几个菌株同源染色体可以提 高整个生物体的活性。该方法已用于生物修复中 五氯酚的降解，Dai等通过三轮基因组改组将
Sphingobilum chlorophenolicum对剧毒杀虫剂
五氯苯酚的耐受浓度提高了10倍以上,并可将培 养基中所含的3mmol·L-1五氯苯酚完全降解。
Vezina等借助DNA家族改组技术探索了苯双加氧 酶BPDOs底物的立体专一性和结构之间的关系,获得 了对2,2’-CB(2,2’-二氯联苯)中C5和C6的氧化活 性提高的新酶S100、S149和S151。其中,S100还能催 化2,2’-CB得到顺-5,6-二氧-5,6-二羟基-2,2’-二 氯联苯,而且能降解一些其野生型双加氧酶所不能降 解的苯、甲苯类单环芳香化合物,扩大了酶的底物范 围。
Crameri等通过DNA shuffling技术来改造砷抗性基因, 通过三轮的改组和筛选,得到了对砷的抗性提高40倍的突 变体,虽然在还原酶的基因里并未发现突变,但还原酶的活 性提高了近10倍,推测可能是侧翼序列突变引起的。
Suenaga等在序列分析的基础上,结合推理设计,构建 了12个定点的bphA1突变,其中3个突变酶改变了多氯联苯 复合物的降解特异性区域。尤其是Ile335Phe突变体在提 高了降解多氯联苯的能力外,还具备了降解2,3-双加氧酶 和3,4-双加氧酶的活性。
Keenan等还获得了活性提高11、14、15倍的萘双加氧 酶,另外在单加氧酶的功能改进方面取得了较好的进展。
3、DNA家族改组
Crameri等于1998年首次提出“DNA家 族改组”的概念。他们发现,采用传统的 DNA改组方法虽然能完成定向进化的目的, 但其中随机产生的多为点突变,且有益突 变频率低,导致筛选工作艰巨且进展缓慢。
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定向进化（Directed Evolution）是一种在试管中模拟达尔文进化过程的方法，通过随机突变和重组，人为制造大量的突变，按照特定的需要和目的给予选择压力，筛选出具有期望特征的蛋白质，实现分子水平的模拟进化。
定向进化的基本步骤包括：
1. 随机突变：在DNA或蛋白质序列中引入随机变化，通常通过使用化学诱变剂或逆转录病毒等。
2. 重组：通过将不同突变体进行基因交换或交叉重组，产生新的变异。
3. 选择压力：根据特定需要和目的，对变异体进行选择，通常通过特定环境下的生存测试或特定酶活性的测定等。
4. 筛选：从大量突变体中筛选出具有期望特征的变异体，通常通过克隆筛选或表型筛选等方法。
定向进化可以在短时间内对蛋白质进行大量改造，是一种非常有效的改善蛋白质性能的方法。
它已经在医药、工业和农业等领域得到广泛应用，例如开发新的药物、生物催化剂和农作物品种等。