SOD活力测定法(连苯三酚自氧化法)-操作图解
超氧自由基清除能力测定法-操作图解
超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧化法）（适用于：SOD及各种抗氧化剂）操作图解具体方法1 溶液配制1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。
1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。
1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。
用pH计测量，pH应为7.4。
用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。
（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。
1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。
再往里加连苯三酚14.6 mg (M。
W.126.1 )，即得。
（当天有效,以上为1个样品的用量）。
2 测试液2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。
（空白参比：Tris-HCl 缓冲液）ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。
由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。
此时的ΔA为ΔA0。
3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。
邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性
2.1试剂和主要仪器
一.试剂
0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2，内含2mmol/L EDTA)：0.2mol/L Tris(内含4mmol/L EDTA)100ml与0.2mol/L HCl44.76ml混合，加双蒸水至200ml，调pH8.2±0.01;邻苯三酚(45mmol/L)：以10mmol/LHCl配制成6mmol/L溶液，存放于冰箱备用;所用试剂均为国产分析纯;实验用水为自制双蒸水;
目前超氧化物歧化酶sod活性测定结果混乱为提高测定结果的可比性对邻苯三酚自氧化法测定sod活性的方法进行了研究就该活力测定体系中缓冲溶液的介质组成浓度ph及所含的edta量等因素对测定结果响进行了探讨根据实验结果提出了新的改良方法超氧化物歧化酶sod是一种特殊的金属酶它能催化超氧阴离子自由基02发生歧化反应从而能有效清除机体内超氧阴离子自由基02是生物体重要的细胞防御系统之一具有防御氧毒抗辐射防衰老以及防治肿瘤和抗炎等药用功效1超氧化物歧化酶sod这一独特的生理功能使其在医药领域具有良好的应用前景激起了人们广泛的研究热情
2.SOD或粗醉抽提液的活性浏定:
测定时按表2加样，测定步骤与测邻苯三酚的自氧化速率同。
酶活力单位定义:在1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为一个活力单位，即420nm0.030D/分为一个活力单位。若自氧化速率在36~65%，通常可按比例计算，不在此范围内的数值应增减样液量。
二、仪器:
721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)
操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率的测定:在试管中按表l加入缓冲液和双蒸水，25℃保温劝分钟，然后加入25℃预温的邻苯三酚(对照管用10mMHCI代替)，迅速摇匀，倒入比色杯中，在4加nm的分光光度计中，每隔半分钟测一次OD值，要求自氧化速率控制在0.060OD/分。
邻苯三酚法测定超氧化物歧化酶缓释片中SOD的活性
! 5 6 5 6 供试品溶液的制备 取 9.: 骨架缓释片 +’ 片， 研细， 精密称取适量 （约相当于 9.: &’’ !<） ， 置 用 0, 3(’ 磷酸盐缓冲液定容至 )’’ !# 的量瓶中， 冰水浴间断超声 2’ !56， 用 ’(1 ! )’’ !#， ! 微孔滤膜 滤过， 弃去初滤液， 取续滤液作为供试品溶液。 ! 56 5 8 辅料对含量测定的影响 按骨架缓释片的 处方比例称取辅料适量， 置 &’’ !# 量瓶中， 照 “& J 2 J 项下方法处理， 取续滤液， 于 +’’ P /’’ 6! 范围内 2” 扫描， 结果表明辅料在 2+) 6! 处无吸收， 不影响测 定。 “ & J 2 J +” 项下的对照品 ! 56 5 9 线性关系的考察 取 溶液， 用 0, 3(’ 的磷酸盐缓冲液分别稀释成 O’、 /1、 ・!# % & O 种溶液， 照 “ & J 2 J &” 项下方法 2O、 +/、 &+、 O! < 测定 9.: 的活力， 以活力值对浓度进行线性回归， 在 得到回归方程： ; = 1N&(1) # Q /(&N。结果表明： %& ・ 线性关系良好 （ $ = ’(NNNO） 。 O’ P O ! < !# 范围内， ! 5 6 5 : 方法精密度考察 取一批 9.: 骨架缓释片， 照 “&J2J2” 项下方法制得供试品溶液， 再按 “&(2(&” 项 下方法进行活力测定， 分别测定 ) 次， %&’ = +(2)? 。 ! 56 5 ; 空白加样回收实验 按 处 方 量 的 1’? 、
其中邻苯三 的顺应性。测定 ;<= 活性的方法很多， 酚法简便易行， 现用其测定缓释片中 ;<= 的活性， 可有效地控制制剂的质量。
SOD酶活力测定实验
摘要：通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。
跟踪提纯过程活性的分布，并评价提取过程各步骤的效率。
实验结果证实随着不断的分离提纯，总活力以及总蛋白不断减小，比活力不断上升，最终得到的结果为总纯化倍数为0.68，活性得率为5.24%。
一、前言：超氧化物歧化酶简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶。
分布很广，几乎从哺乳动物到细菌，以及植物中均存在。
在微生物中主存于需氧菌。
SOD是催化超氧阴离子（O2-）歧化反应的酶类，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2.H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O 和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。
它的存在与生物体内的解毒作用有关，也发现与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病等有关。
自1968 年发现SOD 后，立刻引起科学界的高度重视，近40 年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD 也有了产品.国外从牛红细胞中制得的超氧化物歧化酶，其商品名为Orgotein.不少人研究Orgotein的药理性质，证明它无毒，无抗原性，能抗发炎、抗超氧离子、抗病毒感染。
二十世纪80 年代后期，我国关于SOD 的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。
SOD作为治因而受到医药界的关注。
目前中国国内已进入临床试验阶段。
本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。
二、实验材料与方法：<一>材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用.<二>试剂:葡聚糖（sephadexG-100）, NaCl（AP）, 磷酸氢二钠（AP）, 磷酸二氢钠（AP）, 三羟甲基氨基甲烷（Tris）, 盐酸（浓盐酸），硫酸铵（AP）, PEG6000 ，考马斯亮蓝G250 , 磷酸，乙醇（95%），牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶（sigma公司）。
SOD活性测定
SOD活性测定：SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。
阻止中间物的积累而测定其酶活性。
1、试剂及仪器(1)邻苯三酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。
(2)UV－754紫外分光光度计。
2、测定方法：(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。
在25度、45ml`50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。
(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。
0.0700－A325mm/min----------------------------------------＊100％度0.70样液稀释倍数样液稀释倍数酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------50％样液体积3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。
蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。
4、比活(u/mg蛋白)的计算：单位活力(u/ml) 总活力比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
SOD酶的提取及测定
三．材料器具
2. 仪器：高速组织捣碎机；高速冷冻离心机；层析柱 （1×40cm）；自动部分收集器；恒流泵；进样器 和微量进样器；可见/紫外分光光度计。 3. 试 剂 ： （ 1 ） pH7.8, 5mmol/L磷 酸缓 冲 液 （ 内 含 1mmol/L EDTA）；（2）考马斯亮蓝溶液：称取 100mg考马斯亮蓝G―250于50ml 95%乙醇中，摇 动，待溶解后，加入100ml 85%磷酸，反复震动后 加 蒸 馏 水 定 容 至 1000ml, 过 滤 待 用 ； （ 3 ） pH8.2, 50mmol/L Tris-HCl缓冲液；（4）50mmol/L 邻苯 三酚溶液；（5）10mmol/L HCl溶液
邻苯三酚自氧化法原理：
邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出 O2 - （超氧阴离子自由基），生成带色的中间产物 （红桔酚），反应开始后反应液先变成黄棕色，几分 钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的 中间物不断氧化的结果。本实验中测定的是邻苯三酚 自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～ 45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在 4min的范围内，中间物在325nm波长出有强烈光吸收。 当有SOD存在时，由于它能催化O2 -与H+结合生成O2 和H2O2，从而阻止了中间有色产物的积累，导致吸光 值下降因此，通过测定它们在特定波长下得光吸收变 化速率计算出SOD的酶活性 。
四.实验操作
(一) SOD的提取
1. 取当年大豆适量,冷水浸泡24h,沥干，加冰 冻的pH7.8, 5mmol/L磷酸缓冲液适量，用 高速组织捣碎机捣碎。 2. 用高速冷冻离心机以8000rpm离心除去固型 物（需4—5次，每次15min）,上清液即SOD 酶液。
（二）SOD的凝胶层析分离纯化
超氧化物歧化酶的活性测定
超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。
离子(O2-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。
由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2-)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型。
最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。
每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。
第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。
第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。
Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。
[原理]SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。
其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。
在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。
其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。
化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。
邻苯三酚自氧化法
1、目的采用邻苯三酚自氧化法测定大蒜不同部位的SOD酶活性2、原理根据国际酶学委员会规定，酶的比活性（specific activity）用每mg蛋白质具有的酶活性单位（U∕mg蛋白）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：每mL样品中的蛋白质mg数（m g∕mL）;每ml 样品中的酶活性单位数（U∕mL）。
酶的纯度越高酶的活性也就越高。
SOD酶活性测定方法很多，如邻苯三酚自氧化法、肾上腺素自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法等。
在一般情况下，SOD酶活性只能应用间接活性测定法，本实验采用邻苯三酚自氧化法测定。
利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。
反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。
加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm[1]处测定溶液的吸光度。
酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。
邻苯三酚自氧化速率随其浓度的升高而增加[1,2]。
3、仪器、试剂和材料1)仪器UV-260紫外分光光度计（或其他型号），比色杯，样品管，自氧化管2)试剂和材料a)取培育的大蒜等量的须根，茎，叶；b)所用试剂邻苯三酚、聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)、EDTA-2Na、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、30%H2O2、三(羟甲基)氨基甲烷、浓HCl,均为分析提纯。
c)Tris-HCl 缓冲液4、操作步骤4.1SOD粗酶液的提取称取鲜重3.00 g的样品,加入少量预冷的pH=7.8的磷酸缓冲液(含0.1 mmol/L的EDTA、质量浓度为4 %的聚乙烯吡咯酮烷),冰浴研磨.将匀浆液于4 000 r/min下离心20 min.取其上清液,于60℃水浴15 min,待其冷却后,于4 000 r/min离心20 min,弃去沉淀,将上清液定容到10 mL容量瓶,4℃冰箱中保存备用[3,4]。
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SOD活力测定法（连苯三酚自氧化法）简介
（适用于：SOD及各种抗氧化剂）
操作图解
具体方法
1 溶液配制
1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。
1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。
1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）
40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。
用pH
计测量，pH应为7.4。
用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。
（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。
1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）
取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。
再往里加连苯三酚14.6 mg (M。
W.126.1 )，即得。
（当天有效,以上为1个样品的用量）。
2 测试液
2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。
（空白参比：Tris-HCl 缓冲液）
ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。
由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。
此时的ΔA为ΔA0。
3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。
（空白参比：Tris-HCl缓冲液）
ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。
此时的ΔA为ΔA样。
3 计算公式
清除率＝(ΔA0-ΔA样)/ΔA0 *100
4 注意事项
由于连苯三酚自氧化反应对温度和pH值很敏感，而pH值又受温度的波动而变化。
因此，实验过程中，要严格控制温度。
缓冲液宜多，比色皿用3.5mL规格。
这样数据才比较稳定。
5 实验结果（以原儿茶酸为例）
采用文献[1]的改进方法，测原儿茶酸的·O2-自由基的清除能力，结果如图2（pH7.4）。
用旧方法，在pH8.2时测量，结果有很大误差，是不可取的。
图2 原儿茶酸的·O2-自由基的清除能力的对比（pH7.4 vs pH8.2）
参考文献:
[1] Xican Li. Improved Pyrogallol Autoxidation Method: A Reliable and Cheap Superoxide-scavenging Assay Suitable for All Antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60:6418-6424.
致谢：本文由广州中医药大学李熙灿教授依据其发表的论文[1]，整理而成。