SOD活力测定法(连苯三酚自氧化法)-操作图解

超氧自由基清除能力测定法-操作图解

超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧化法）（适用于：SOD及各种抗氧化剂）操作图解具体方法1 溶液配制1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。

1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。

1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。

用pH计测量，pH应为7.4。

用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。

（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。

1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。

再往里加连苯三酚14.6 mg (M。

W.126.1 )，即得。

（当天有效,以上为1个样品的用量）。

2 测试液2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。

（空白参比：Tris-HCl 缓冲液）ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。

由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。

此时的ΔA为ΔA0。

3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。

邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性

2材料与方法（1）
2.1试剂和主要仪器
一.试剂
0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2，内含2mmol/L EDTA)：0.2mol/L Tris(内含4mmol/L EDTA)100ml与0.2mol/L HCl44.76ml混合，加双蒸水至200ml，调pH8.2±0.01;邻苯三酚(45mmol/L)：以10mmol/LHCl配制成6mmol/L溶液，存放于冰箱备用;所用试剂均为国产分析纯;实验用水为自制双蒸水;
目前超氧化物歧化酶sod活性测定结果混乱为提高测定结果的可比性对邻苯三酚自氧化法测定sod活性的方法进行了研究就该活力测定体系中缓冲溶液的介质组成浓度ph及所含的edta量等因素对测定结果响进行了探讨根据实验结果提出了新的改良方法超氧化物歧化酶sod是一种特殊的金属酶它能催化超氧阴离子自由基02发生歧化反应从而能有效清除机体内超氧阴离子自由基02是生物体重要的细胞防御系统之一具有防御氧毒抗辐射防衰老以及防治肿瘤和抗炎等药用功效1超氧化物歧化酶sod这一独特的生理功能使其在医药领域具有良好的应用前景激起了人们广泛的研究热情
2.SOD或粗醉抽提液的活性浏定:
测定时按表2加样，测定步骤与测邻苯三酚的自氧化速率同。
酶活力单位定义:在1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为一个活力单位，即420nm0.030D/分为一个活力单位。若自氧化速率在36~65%，通常可按比例计算，不在此范围内的数值应增减样液量。
二、仪器:
721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)
操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率的测定:在试管中按表l加入缓冲液和双蒸水，25℃保温劝分钟，然后加入25℃预温的邻苯三酚(对照管用10mMHCI代替)，迅速摇匀，倒入比色杯中，在4加nm的分光光度计中，每隔半分钟测一次OD值，要求自氧化速率控制在0.060OD/分。

邻苯三酚法测定超氧化物歧化酶缓释片中SOD的活性

! 5 6 5 6 供试品溶液的制备取 9.: 骨架缓释片 +’ 片，研细，精密称取适量（约相当于 9.: &’’ !<），置用 0, 3(’ 磷酸盐缓冲液定容至 )’’ !# 的量瓶中，冰水浴间断超声 2’ !56，用 ’(1 ! )’’ !#， ! 微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。 ! 56 5 8 辅料对含量测定的影响按骨架缓释片的处方比例称取辅料适量，置 &’’ !# 量瓶中，照 “& J 2 J 项下方法处理，取续滤液，于 +’’ P /’’ 6! 范围内 2” 扫描，结果表明辅料在 2+) 6! 处无吸收，不影响测定。 “ & J 2 J +” 项下的对照品 ! 56 5 9 线性关系的考察取溶液，用 0, 3(’ 的磷酸盐缓冲液分别稀释成 O’、 /1、・!# % & O 种溶液，照 “ & J 2 J &” 项下方法 2O、 +/、 &+、 O! < 测定 9.: 的活力，以活力值对浓度进行线性回归，在得到回归方程： ; = 1N&(1) # Q /(&N。结果表明： %& ・线性关系良好（ $ = ’(NNNO）。 O’ P O ! < !# 范围内， ! 5 6 5 : 方法精密度考察取一批 9.: 骨架缓释片，照 “&J2J2” 项下方法制得供试品溶液，再按 “&(2(&” 项下方法进行活力测定，分别测定 ) 次， %&’ = +(2)? 。 ! 56 5 ; 空白加样回收实验按处方量的 1’? 、
其中邻苯三的顺应性。测定 ;<= 活性的方法很多，酚法简便易行，现用其测定缓释片中 ;<= 的活性，可有效地控制制剂的质量。

SOD酶活力测定实验

摘要：通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。

跟踪提纯过程活性的分布，并评价提取过程各步骤的效率。

实验结果证实随着不断的分离提纯，总活力以及总蛋白不断减小，比活力不断上升，最终得到的结果为总纯化倍数为0.68，活性得率为5.24%。

一、前言：超氧化物歧化酶简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶。

分布很广，几乎从哺乳动物到细菌，以及植物中均存在。

在微生物中主存于需氧菌。

SOD是催化超氧阴离子（O2-）歧化反应的酶类，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2.H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O 和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。

它的存在与生物体内的解毒作用有关，也发现与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病等有关。

自1968 年发现SOD 后，立刻引起科学界的高度重视，近40 年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD 也有了产品.国外从牛红细胞中制得的超氧化物歧化酶，其商品名为Orgotein.不少人研究Orgotein的药理性质，证明它无毒，无抗原性，能抗发炎、抗超氧离子、抗病毒感染。

二十世纪80 年代后期，我国关于SOD 的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。

SOD作为治因而受到医药界的关注。

目前中国国内已进入临床试验阶段。

本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。

二、实验材料与方法：<一>材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用.<二>试剂:葡聚糖（sephadexG-100）, NaCl（AP）, 磷酸氢二钠（AP）, 磷酸二氢钠（AP）, 三羟甲基氨基甲烷（Tris）, 盐酸（浓盐酸），硫酸铵（AP）, PEG6000 ，考马斯亮蓝G250 , 磷酸，乙醇（95%），牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶（sigma公司）。

SOD活性测定

SOD活性测定：SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。

阻止中间物的积累而测定其酶活性。

1、试剂及仪器(1)邻苯三酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。

(2)UV－754紫外分光光度计。

2、测定方法：(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。

在25度、45ml`50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。

(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。

0.0700－A325mm/min----------------------------------------＊100％度0.70样液稀释倍数样液稀释倍数酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------50％样液体积3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。

蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。

4、比活(u/mg蛋白)的计算：单位活力(u/ml) 总活力比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。

SOD酶的提取及测定

三．材料器具
2. 仪器：高速组织捣碎机；高速冷冻离心机；层析柱（1×40cm）；自动部分收集器；恒流泵；进样器和微量进样器；可见/紫外分光光度计。 3. 试剂：（ 1 ） pH7.8, 5mmol/L磷酸缓冲液（内含 1mmol/L EDTA）；（2）考马斯亮蓝溶液：称取 100mg考马斯亮蓝G―250于50ml 95%乙醇中，摇动，待溶解后，加入100ml 85%磷酸，反复震动后加蒸馏水定容至 1000ml, 过滤待用；（ 3 ） pH8.2, 50mmol/L Tris-HCl缓冲液；（4）50mmol/L 邻苯三酚溶液；（5）10mmol/L HCl溶液
邻苯三酚自氧化法原理：
邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出 O2 - （超氧阴离子自由基），生成带色的中间产物（红桔酚），反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。本实验中测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～ 45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在 4min的范围内，中间物在325nm波长出有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2 -与H+结合生成O2 和H2O2，从而阻止了中间有色产物的积累，导致吸光值下降因此，通过测定它们在特定波长下得光吸收变化速率计算出SOD的酶活性。
四.实验操作
(一) SOD的提取
1. 取当年大豆适量,冷水浸泡24h,沥干，加冰冻的pH7.8, 5mmol/L磷酸缓冲液适量，用高速组织捣碎机捣碎。 2. 用高速冷冻离心机以8000rpm离心除去固型物（需4—5次，每次15min）,上清液即SOD 酶液。
（二）SOD的凝胶层析分离纯化

超氧化物歧化酶的活性测定

超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。

它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。

离子(O2-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。

由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2-)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。

按金属辅基成分的不同可分成3种类型。

最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。

每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。

第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。

第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。

Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。

[原理]SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。

其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。

在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。

其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。

化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。

邻苯三酚自氧化法

1、目的采用邻苯三酚自氧化法测定大蒜不同部位的SOD酶活性2、原理根据国际酶学委员会规定，酶的比活性（specific activity）用每mg蛋白质具有的酶活性单位（U∕mg蛋白）来表示。

因此，测定样品的比活性必须测定：每mL样品中的蛋白质mg数（m g∕mL）;每ml 样品中的酶活性单位数（U∕mL）。

酶的纯度越高酶的活性也就越高。

SOD酶活性测定方法很多，如邻苯三酚自氧化法、肾上腺素自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法等。

在一般情况下，SOD酶活性只能应用间接活性测定法，本实验采用邻苯三酚自氧化法测定。

利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。

反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。

加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm[1]处测定溶液的吸光度。

酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。

邻苯三酚自氧化速率随其浓度的升高而增加[1,2]。

3、仪器、试剂和材料1)仪器UV-260紫外分光光度计（或其他型号），比色杯，样品管，自氧化管2)试剂和材料a)取培育的大蒜等量的须根，茎，叶；b)所用试剂邻苯三酚、聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)、EDTA-2Na、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、30%H2O2、三(羟甲基)氨基甲烷、浓HCl,均为分析提纯。

c)Tris-HCl 缓冲液4、操作步骤4.1SOD粗酶液的提取称取鲜重3.00 g的样品,加入少量预冷的pH=7.8的磷酸缓冲液(含0.1 mmol/L的EDTA、质量浓度为4 %的聚乙烯吡咯酮烷),冰浴研磨.将匀浆液于4 000 r/min下离心20 min.取其上清液,于60℃水浴15 min,待其冷却后,于4 000 r/min离心20 min,弃去沉淀,将上清液定容到10 mL容量瓶,4℃冰箱中保存备用[3,4]。

邻苯三酚自氧化法测定SOD活性

万方数据邻苯三酚自氧化法测定SOD活性作者：李永利，张焱作者单位：河南省卫生防疫站,郑州,450003刊名：中国卫生检验杂志英文刊名：CHINESE JOURNAL OF HEALTH LABORATORY TECHNOLOGY年，卷(期)：2000,10(6)被引用次数：33次1.戴有盛食品的生化与营养 19942.胡学智;张惠荪酶法食品分析 19801.王文博.孙建光.徐晶螺旋藻产品活性物质检测与免疫功能研究[期刊论文]-中国食品卫生杂志 2011(1)2.赵文宝.张珍.郭建华.金晶牦牛血中超氧化物歧化酶提取工艺研究[期刊论文]-甘肃农业大学学报 2010(1)3.陈世彪.李莉.李海涛柑橘黄酮体外清除活性氧自由基作用的研究[期刊论文]-安徽农业科学 2010(9)4.徐玲玲.张均平.邵邻相.张耀斌.毕洁琼.巩菊芳大豆磷脂对老龄大鼠学习记忆及抗氧化能力的影响[期刊论文]-浙江师范大学学报（自然科学版） 2010(2)5.李志明.陈青.金启安.唐超.温海波.彭正强高温对椰心叶甲啮小蜂保护酶系活性的影响[期刊论文]-热带作物学报 2010(6)6.万军.黄国钧.周霞邻苯三酚自氧化法测定SOD活性中检测波长的优化[期刊论文]-安徽农业科学 2010(14)7.张瑞东.迟玉杰.陈晨.阮长青蛋清蛋白酶解物抗氧化与血管紧张素转换酶抑制活性的研究[期刊论文]-营养学报2010(4)8.武夷岩茶茶多酚的体外抗氧化作用[期刊论文]-武夷学院学报 2009(2)9.汪福保.罗莉.张桂众.颜忠.刘本祥Fe、Zn、Cu不同组合对岩原鲤生长、体组成和血清生化指标的影响[期刊论文]-淡水渔业 2009(4)10.原龙.王新.杨平大蒜中超氧化物歧化酶提取工艺的研究[期刊论文]-西安工程大学学报 2009(1)11.印君.尹宗宁超氧化物歧化酶的固定及其活性检测[期刊论文]-中国生物制品学杂志 2009(7)12.陈晨.迟玉杰.刘丽蛋清的蛋白酶解物清除自由基能力的研究[期刊论文]-营养学报 2009(5)13.苏传福.罗莉.李芹.文华.汪福保硒对草鱼抗氧化功能及组织结构的影响[期刊论文]-西南师范大学学报(自然科学版) 2008(5)14.张贵生镧暴露对鲤鱼脑和肌肉中酶和脂质过氧化水平的影响[期刊论文]-水生生物学报 2008(4)15.张贵生.朱道玉镧长期暴露对鲤鱼的毒性影响研究[期刊论文]-中国饲料 2008(10)16.张贵生稀土元素对鲤鱼肝胰脏多种酶及MDA含量的影响[期刊论文]-生物技术 2008(2)17.张贵生镧对鲤鱼五种组织超氧化物歧化酶同工酶及酶活性的影响[期刊论文]-四川动物 2008(4)18.刘晓红.李向东.刘婷.周帼萍热变性法提纯猪血SOD的工艺优化[期刊论文]-武汉工业学院学报 2008(1)19.张贵生镧对鲤鱼肾和鳃抗氧化性和酯酶同工酶的影响[期刊论文]-生态学杂志 2008(8)20.李书倩.辛广.戴亚东.刘长江白灵菇多糖抗氧化性质的研究[期刊论文]-鞍山师范学院学报 2007(2)21.王学军自组装分子印迹聚合物制备及其水相识别的研究[学位论文]博士 200722.孙桂玲.孟磊.何华红.张相年.赵树进大蒜超氧化物歧化酶分离方法的研究[期刊论文]-中药材 2006(12)23.蔡英卿.赖钟雄.沈金山.陈义挺.李国清.林玉玲.郑文炉余甘子各器官超氧化物歧化酶活性的测定[期刊论文]-热带作物学报 2006(4)24.李鸿梅.郭平.倪鹏.冯永巍.徐力.张学忠玉米蛋白粉制备玉米肽脱脂及水解工艺研究[期刊论文]-吉林农业大学学报 2006(3)25.蔡英卿.赖钟雄.徐丽珠.陈义挺.陈怀宇.庄卫东.林文忠.林玉玲龙眼各营养器官SOD活性的测定分析[期刊论文] -河北林果研究 2006(4)26.耿晓修.丁诗华.孙翰昌.廖品福.张涛六价铬对草鱼肝脏SOD和GSH-Px活力的影响[期刊论文]-西南农业大学学报（自然科学版） 2006(2)27.孙希云.刘宁.陈波.孟宪军马齿苋总黄酮抗氧化性质的研究[期刊论文]-沈阳农业大学学报 2006(1)28.阿祥仁.张鑫生利舒康胶囊对高原地区中老年人氧自由基代谢指标的影响[期刊论文]-中国老年学杂志2005(10)29.大蒜中SOD的提取研究[期刊论文]-化学与生物工程 2005(10)30.侯建平中药黄芪有效成分的抗氧化活性及其对益生菌促生作用的研究[学位论文]硕士 200531.卜春文鹅血中SOD、IgG的提取工艺研究[期刊论文]-食品科技 2004(5)32.陈田飞.吴大洋.李春峰家蚕冷冻精液超氧化物歧化酶(SOD)活性分析[期刊论文]-蚕学通讯 2004(4)33.侯振建.王帅领.余军锁活性花粉酒的研制[期刊论文]-酿酒 2004(3)34.王文博.孙建光.徐晶螺旋藻产品活性物质检测与免疫功能研究[期刊论文]-中国食品卫生杂志 2011(1)本文链接：/Periodical_zgwsjyzz200006016.aspx。

连苯三酚-邻苯三酚SOD 超氧自由基清除-过氧自由基清除-过氧阴离子自由基清除-超氧阴离子自由基清除

改进的连苯三酚法：一种适用于所有抗氧化剂超氧自由基（•O2-）清除试验（适用于SOD）【名词辨析】•O2-：该微粒既含有一个成单的电子，所以，可以属于自由基，又带一个单位负电荷，也属于阴离子。

所以，可以称为“超氧自由基”、“过氧自由基”、“过氧阴离子自由基”、“过氧阴离子”、“超氧阴离子自由基”、“超氧阴离子”。

SOD：过氧化物歧化酶，使过氧自由基发生岐化反应，而清除之。

连苯三酚：有些文献也称为“邻苯三酚”。

但邻苯三酚是不准确的名称。

因为分子含有三个取代基，应当称为“连”。

【操作示意图】操作示意图[1]操作示意图的说明：最初的连苯三酚（1,2,3-三羟基苯）法是专门为超氧化物歧化酶开发的，现在广泛用于测量其他抗氧化剂的超氧化物清除。

然而，强烈的pH影响被忽略了。

在本研究中，首次系统地研究了影响因素，大量实验证明pH值至关重要。

由于主要抗氧化剂含有羧酸、酯或内酯基团，pH 8.2应改为生理pH 7.4。

改进的程序如下。

将连苯三酚溶液（在1 M HCl中）与pH 7.4的Tris-HCl溶液充分混合；在37°C下每隔30秒测量一次A325nm值，持续5分钟。

由于ΔA325nm，控制值反映基质•O2-的初始浓度−, 应妥善控制，以保证方法的准确性。

改进的连苯三酚法是一种可靠且廉价的超氧自由基清除试验，适用于所有类型的抗氧化剂。

用石英比色皿，不能用玻璃比色皿，因为玻璃比色皿在325nm处有吸收。

【详细介绍】[1]有几种方法可以测定食品的超氧阴离子交换活性，包括细胞色素还原、硝基四氮唑蓝（NBT）、电子自旋共振（ESR）、化学发光、荧光和高效液相色谱。

所有这些方法都需要特殊且昂贵的仪器或生物试剂。

连苯三酚（1,2,3-三羟基苯）自氧化法相对便宜。

它最初由Marklund 专门为超氧化物歧化酶（SOD）而设计，而不是为其他抗氧化剂而设计。

近几十年来，由于其方便性，它还被用于测定其他抗氧化剂，如多酚、酚酸、单宁、黄酮、花青素、蒽醌、多糖，甚至各种营养添加剂和提取物。

NBT光还原法_邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性的比较_简报_

河北职业技术师范学院学报　第14卷第2期,2000年6月Journal of Hebei Vocation2Technical Teachers College Vol.14　No.2　J une2000NB T光还原法、邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性的比较(简报)张文军1,葛　超2(1河北职业技术师范学院教务处,昌黎,066600;2河北职业技术师范学院食品工程系)关键词:SOD;酶活性测定方法;NB T光还原法;邻苯三酚自氧化法中图分类号:Q554+16 文献标识码:A 文章编号:1008-9519(2000)02-0068-03超氧化物歧化酶(SOD)是催化O-2歧化反应的酶类,它催化的反应是O-2+O-2+2H+H2O+ O2。

由于O-2是一种极不稳定的氧自由基,因此,检验SOD活性一直采用间接的方法。

笔者针对目前较普遍采用的邻苯三酚自氧化法和NB T光还原法,从灵敏度、精确度、反应特异性三个方面对两方法进行比较,以确定提纯过程中非纯品SOD及纯品SOD两种材料酶活测定的适用方法。

1　材料与方法111　材料纯品牛红细胞SOD、玉米SOD粗提液(自制)、超滤液(超滤膜MW=4000)、透析液(体积分数为014～019的硫铵分步沉淀后)。

本实验所用药品牛红细胞SOD为电泳纯、核黄素(上海化学试剂采购站供应,进口分装),Met(甲硫氨酸)、邻苯三酚为国产分析纯。

112　方法11211　NB T光还原法　根据Stewart和Bewley报导[1],在3mL反应液中含有13×10-3mol甲硫氨酸;75×10-5mol NB T;2×10-6mol核黄素;100×10-9mol ED TA;50×10-3mol磷酸缓冲液(p H 718),在4000lx光下照射15min后,NB T光化还原产物蓝色甲月替在560nm有最大吸收,在此条件下,反应被抑制50%所需酶量为1个活力单位。

保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定

实验十保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定一、实验原理根据GB/T5009.171-2003，将25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%所需的SOD定义为一个活力单位。

在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化，可根据SOD 抑制邻苯三酚自氧化能力测定SOD活力。

二、实验试剂A液：pH 8.20的0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（内含1mmol/L EDTA·2Na）。

称取 1.2114g三羟甲基氨基甲烷和37.2mgEDTA·2Na溶于62.4ml0.1mol/l盐酸溶液中，用蒸馏水定溶至100ml。

B液：4.5mmol/L邻苯三酚盐酸溶液。

称取邻苯三酚56.7mg溶于少量10mmol/L盐酸溶液，并定容至100ml。

盐酸溶液：10mmol/L 蒸馏水：二重石英蒸馏水三、实验仪器紫外-可见分光光度计精密酸度计（0.01pH）离心机10ml比色管10ml 离心管玻璃乳钵。

四、测定步骤⑴取茶叶样品1.00g置于研钵中，加入9.0ml蒸馏水研磨5分钟，移入10ml 离心管。

用少量蒸馏水冲洗研钵，洗液并入离心管中，加蒸馏水至刻度，经4000r/min离心15分钟，取上清液测定。

⑵在25℃左右，于10ml比色管中依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.00ml，B 液0.15ml。

加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325nm波长条件下初始时和1Min后吸光度值，二者之差为邻苯三酚自氧化速率△A325（min-1）为0.060。

⑶在25℃左右，于10ml比色管中依次加入20.0ul样液或酶液，A液2.35ml，蒸馏水2.00ml，B液0.15ml。

加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325nm 波长条件下初始时和1分钟后吸光度值，二者之差为样液或酶液抑制邻苯三酚自氧化速率△A′325（min-1）。

加入样液或酶液的量使抑制邻苯三酚自氧化速率为1/2△A′325（min-1），即0.030。

邻苯三酚自氧化法测定SOD活性中测定波长的选择

3经验交流3邻苯三酚自氧化法测定SOD活性中测定波长的选择孙雪奇,陈齐英,别小琳(四川省药品检验所,四川成都610034)提要:用岛津UV-240型、260型和T-1901紫外可见分光光度计进行实验,确定邻苯三酚自氧化法测定S OD活性的最适波长非文献使用的420nm和325nm,而应为320nm。

关键词:邻苯三酚自氧化法;S OD活性;波长中图分类号:R917文献标识码:B文章编号:1006-0103(2004)05-0404-02 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,S OD)为体内自由基的清除剂,在生物体的正常代谢中起重要作用,其活性测定常用邻苯三酚自氧化法[1]。

该方法主要是通过测定邻苯三酚自氧化前4min内, S OD对自氧化初始中间产物增加的抑制作用来测定S OD活性。

文献报道的测定波长主要有420nm[1]和325nm[2]。

为探讨初始中间产物的吸收峰位置,进而确定测定波长,特对此进行了研究。

1　实验部分111　仪器与试剂 UV-260和UV-240紫外可见分光光度计(日本岛津公司);T-1901紫外可见分光光度计(上海科学仪器厂)。

试剂均为国产分析纯。

112　方法吸取4.5ml100mm ol・L-1的T ris-HCl缓冲液(pH812)和4146ml蒸馏水,混匀后置25℃水浴中20min,立即加入在25℃预热的30mm ol・L-1邻苯三酚40μl(10mm ol・L-1的HCl溶液配制),立即混匀,迅速倒入比色池中,以10mm ol・L-1的HCl溶液为空白,分别用上述3种型号的紫外可见分光光度计测定邻苯三酚自氧化中间产物的吸光度。

113　结果 UV-240紫外可见分光光度计测定可知,邻苯三酚自氧化初始中间产物的吸收峰在320～319nm 处。

T-1901和UV-260紫外可见分光光度计两种仪器测得的λmax均出现在320nm波长处,此时在420nm处吸光度还很小,到5min时吸光度<011,可见420nm处吸光度的变化不能反映中间产物的积累,因此,用420nm进行S OD酶活性测定是不正确的。

SOD酶测定的方案

二）连苯三酚自氧化法测SOD连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出，生成带色的中间产物。

在自氧化过程的初始阶段，黄色中间物的积累在滞后30~45s后就与时间成线性关系。

中间产物在420nm处有强烈的光吸收，在有SOD存在时由于它能催化生成O2与H2O2，从而阻止了中间物的积累，通过计算就可以求出SOD的活力。

紫外分光光度计、pH计。

【一】连苯三酚，K2HPO4•3H2O，KH2PO4，HCl均为分析纯级；所用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。

（2）连苯三酚液：用1×10-2mol/L HCl将之配成浓度5×10-2mol/L连苯三酚液。

（3）pH8.3, 5×10-2mol/LK2HPO4- KH2PO4缓冲液。

4. 测定步骤（1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。

（2）连苯三酚自氧化速率的测定：取4.5Ml ph8.3, 5×10-2mol/LK2HPO4- KH2PO4缓冲液，在25℃水浴中保温15min，加入10μL5×10-2mol/L连苯三酚液，迅速摇匀（空白以K2HPO4- KH2PO4缓冲液代替），倒入光径1cm的比色杯内，在420nm波长下于恒温池中每隔30s测A值一次。

计算线形范围内每1min A的增值，此即为连苯三酚的自氧化速率，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min左右。

（3）酶活测定：测定方法与测连苯三酚自氧化速率相同，在加入连苯三酚之前，先加入待测SOD酶液，缓冲液减少相应体积。

计算加酶后测连苯三酚自氧化速率，按以下公式计算酶活。

5. 结果计算样品酶活单位表示在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。

改良后的邻苯三酚自氧化法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性

改良后的邻苯三酚自氧化法A.1试剂的制配A.1.1A液：pH8.200.1mol/l三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲溶液（内含1mmol/L EDTA·2Na）。

称取1.2114g Tris和37.2mg EDTA·2Na溶于62.4ml0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100ml。

A.1.2B液：4.5mmol/l邻苯三酚盐酸溶液。

称取邻苯三酚（A.R）56.7mg溶于少量10mmol/L盐酸溶液，待邻苯三酚完全溶解后，用10mmol/L盐酸溶液定容至100ml。

A.1.310mmol/l盐酸溶液。

A.1.4供试品溶液：取1ml于500ml容量瓶中，用蒸馏水定容到500ml。

即得供试液。

A.1.5蒸馏水：双重石英蒸馏水。

A.2仪器紫外-可见分光光度仪，精密酸度计（精密度0.01pH），试管数支，100μl移液枪，1000μl移液枪，10ml移液枪。

A.3方法A.3.1调零在25℃左右，取2支试管，分别依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.15ml；在325nm波长条件下，调零。

A.3.2邻苯三酚自氧化速率测定△A325在25℃，取2支试管（A管和B管），A 管中依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.00ml；B管中分别加入B液0.15ml，把A管倒入B管中，迅速摇匀，倾入比色皿，以A液2.35ml+蒸馏水2.15ml作为空白对照，在325nm波长下每隔30s记录一次A值，共测6次，要求自氧化速率控制在0.060（±0.003）OD/min。

A.3.3酶活测定在25℃，在试管中加入A液2.35ml，蒸馏水1.8ml，在25℃的水浴中预热5min,然后加入Vml的样液，再加入0.15mlB液，迅速摇匀，倾入比色皿，以A液2.35ml+蒸馏水2.15ml作为空白对照，在325nm波长下每隔30s 记录一次A值，共测6次。

在此条件下，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率50%的酶量定为1个活力单位，即△A′325=1/2△A325。

植物超氧化物歧化酶活性测量

植物超氧化物歧化酶活性测量一、实验目的及要求（1）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。

（2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。

二、实验原理超氧化物歧化酶(SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。

它可以催化超氧负离子（O-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2-+H2→O2+H2O2. 大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，糖果组合组织或者细胞破碎后，可用Ph7.8的磷酸缓冲液提取。

邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在420nm有最大吸收峰。

邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40秒-3分钟这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。

颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。

三、实验材料、仪器设备及试剂1、实验材料：大蒜2、仪器：离心机3、试剂：(1)磷酸缓冲液（pH7.8, 0.05mol/L）)(PH8.3 Tris-HCl )（2）浓盐酸(3)邻苯三酚（50mmol.L-1）：称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。

(5) 考马斯蓝G-250：100mg 考马斯蓝G250溶于50 ml 95%乙醇中，加入100ml 85%(W/V)正磷酸，用蒸馏水稀释至1L，过滤。

（6）牛血清蛋白（1mg/100ml, 即ml=1 l）四、实验方法1、材料准备：每组30g大蒜，加入90 ml pH7.8 0.05 mol/L 磷酸缓冲液，匀浆机匀浆，两层纱布过滤，冷冻离心（5000 rpm，20min）得清液测体积，取少量清液进行SOD活性测量。

2、将上清液置于60℃20min,使杂蛋白变性，然后5000r.min-1冷冻离心20min，取上清液测体积，并进行SOD活性测量。

3、SOD活性测定（邻苯三酚法）采用改良的邻苯三酚自氧化法。

邻苯三酚自氧化速率为325 nm, 0.070D /min左右,以 1 mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚的速率达到50%的酶量作为一个酶活力单位(U)。

植物sod测定方法

植物sod测定方法一、植物SOD测定的重要性。

1.1 植物的健康指标。

植物SOD（超氧化物歧化酶）就像是植物体内的小卫士。

它的含量和活性对植物健康有着至关重要的意义。

如果把植物比作一个小王国，那SOD就是守护这个王国免受自由基侵害的英勇战士。

自由基就像一群小坏蛋，到处搞破坏，而SOD能把这些自由基转化为无害的物质，让植物茁壮成长。

1.2 研究植物生理的关键。

在植物生理学的研究领域里，SOD测定那可是相当重要的一环。

就好比我们要了解一个人的身体状况，得先看看他身体里的免疫系统强不强一样。

对于植物来说，SOD 的情况就是了解其生理状态的一个关键窗口。

通过测定SOD，我们可以知道植物在不同环境下的适应能力，是被干旱折磨得奄奄一息，还是在肥沃土壤里生机勃勃。

二、常见的植物SOD测定方法。

2.1 邻苯三酚自氧化法。

这种方法有点像一场化学魔术。

邻苯三酚在一定条件下会自氧化，产生超氧阴离子自由基，这就像是魔法里召唤出了小恶魔。

而SOD呢，它能抑制这个自氧化的过程，就像正义的魔法师出手阻止恶魔作恶。

我们通过测量不同反应体系中邻苯三酚自氧化的速率，就能算出SOD的活性。

这就好比看魔法师出手的速度和力度，来判断他的魔法能力有多强。

不过呢，这个方法也有点小脾气，对实验条件要求比较严格，就像娇贵的大小姐，稍有不慎就可能得出不准确的结果。

2.2 氮蓝四唑法。

氮蓝四唑法也是个挺常用的办法。

在这个方法里，SOD就像是个神秘的画家。

在有光的情况下，植物的叶绿体或者其他相关物质会产生超氧阴离子自由基，这个自由基会和氮蓝四唑发生反应，让溶液变色，就像画布被涂上了颜色。

而SOD会阻止这个变色的过程，我们根据溶液颜色变化的程度就能确定SOD的活性。

这就好比看画家阻止画布被乱涂乱画的能力，来判断他的绘画功力。

这个方法相对来说比较稳定，就像老实可靠的老黄牛，虽然可能没有那么多花哨的地方，但能稳稳地给出结果。

2.3 化学发光法。

化学发光法那可有点高大上了。