邻苯三酚自氧化法测定sod活性及含量
邻苯三酚—鲁米诺发光体系测定SOD活性
邻苯三酚—鲁米诺发光体系测定SOD活性
徐靖;杨秀岑
【期刊名称】《郧阳医学院学报》
【年(卷),期】1999(18)2
【摘要】目的：建立一种测定ＳＯＤ活力的方法。
方法：利用邻苯三酚在碱性条
件下自氧化—鲁米诺化学发光体系测ＳＯＤ活性。
结果：本方法一个活力单位
（抑制５０％发光程度）的ＳＯＤ量为１６ｎｇ／ｍｌ。
本法测定ＳＯＤ浓度范围为５～１５０ｎｇ／ｍｌ，线性回归方程的相关系数：ｒ＝０．９９８。
检测限为１ｎｇ。
重复性：批内Ｃ．Ｖ．＝１．０％，批间（隔７ｄ）Ｃ．Ｖ．＝５．１％。
结论：本法具有简易、灵敏、试剂价廉等优点。
【总页数】3页(P68-70)
【关键词】鲁米诺;超氧化物歧化酶;化学发光;邻苯三酚
【作者】徐靖;杨秀岑
【作者单位】郧阳医学院基础化学教研室;华西医科大学药学院应用化学研究室【正文语种】中文
【中图分类】Q554.903
【相关文献】
1.多酚氧化酶对邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的干扰 [J], 荣俊;杨待建
2.鲁米诺、异鲁米诺和邻苯三酚发光效率的比较 [J], 陈玉兰
3.邻苯三酚自氧化法在SOD活性测定中的应用 [J], 贾红玉;王亚森;田晓辉;张伟;杜
建芳;康明;刘建荣
4.邻苯三酚自氧化—化学发光法测定SOD活性 [J], 郭蔼光;王振镒
5.邻苯三酚自氧化法测定SOD活性中测定波长的选择 [J], 孙雪奇;陈齐英;别小琳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
邻苯三酚法测定超氧化物歧化酶缓释片中SOD的活性
! 5 6 5 6 供试品溶液的制备 取 9.: 骨架缓释片 +’ 片， 研细， 精密称取适量 （约相当于 9.: &’’ !<） ， 置 用 0, 3(’ 磷酸盐缓冲液定容至 )’’ !# 的量瓶中， 冰水浴间断超声 2’ !56， 用 ’(1 ! )’’ !#， ! 微孔滤膜 滤过， 弃去初滤液， 取续滤液作为供试品溶液。 ! 56 5 8 辅料对含量测定的影响 按骨架缓释片的 处方比例称取辅料适量， 置 &’’ !# 量瓶中， 照 “& J 2 J 项下方法处理， 取续滤液， 于 +’’ P /’’ 6! 范围内 2” 扫描， 结果表明辅料在 2+) 6! 处无吸收， 不影响测 定。 “ & J 2 J +” 项下的对照品 ! 56 5 9 线性关系的考察 取 溶液， 用 0, 3(’ 的磷酸盐缓冲液分别稀释成 O’、 /1、 ・!# % & O 种溶液， 照 “ & J 2 J &” 项下方法 2O、 +/、 &+、 O! < 测定 9.: 的活力， 以活力值对浓度进行线性回归， 在 得到回归方程： ; = 1N&(1) # Q /(&N。结果表明： %& ・ 线性关系良好 （ $ = ’(NNNO） 。 O’ P O ! < !# 范围内， ! 5 6 5 : 方法精密度考察 取一批 9.: 骨架缓释片， 照 “&J2J2” 项下方法制得供试品溶液， 再按 “&(2(&” 项 下方法进行活力测定， 分别测定 ) 次， %&’ = +(2)? 。 ! 56 5 ; 空白加样回收实验 按 处 方 量 的 1’? 、
其中邻苯三 的顺应性。测定 ;<= 活性的方法很多， 酚法简便易行， 现用其测定缓释片中 ;<= 的活性， 可有效地控制制剂的质量。
实验报告 猪血中超氧化物歧化酶
实验三 猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活力测定一、 实验原理超氧化物歧化酶(SOD)是一种能够专一性清除超氧离子自由基-2O 的金属酶。
它是一种酸性蛋白，对热、pH 和蛋白酶的水解较一般酶稳定。
SOD 催化下述反应：222222O O H O H +→+-+.。
机体内-2O 过量或不足都会对人体产生危害，SOD 对过量的-2O 及时清除保证-2O 含量的相对平衡。
本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为材料，从中提取SOD 并进行纯化。
该实验SOD 酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，其酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%酶量定义一个酶单位。
样品中蛋白质含量采用考马斯亮蓝250-G 法测定。
考马斯亮蓝250-G 在游离状态下呈粉红色，与蛋白质结合后呈蓝色。
在一定范围内，溶液在595nm 波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围是1-1000ug 。
SOD 同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。
二、试剂与材料[1]试剂：ACD 抗凝剂、0.9%NaCl 、丙酮、05%乙醇、氯仿、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/LEDTA 钠盐溶液、3 mmol/L 邻苯三酚钠溶液、考马斯亮蓝250-G 标准蛋白质溶液、[2]器材：分光光度计、试管、刻度吸管、离心机、烧杯。
三、操作步骤1、SOD 提取[1] 取40ml 新鲜猪血，5000r/m 离心10min ，去上层血浆，取下层红血球粘稠液。
加入2倍体积的0.9%Nacl 溶液清洗，5000r/m 离心10min ，弃上层清液。
[2] 向洗净的红血球中加入适量蒸馏水至15ml ，剧烈搅拌30min ，使其充分溶血。
再向溶血溶液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%的乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，均浆呈红色，再继续搅拌15min ，4000r/m 离心10min ，去变性蛋白质沉淀物，得上层液，留样1ml 。
猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活力测定、同工酶电泳
一、原理1.超氧化物歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基（）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、抗炎及抗癌等作用因而在医药、化妆品及食品工业等方面有了广泛的应用前景。
SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。
按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD（二聚体，蓝绿色）、Mn-SOD（紫红色）和Fe-SOD（黄褐色）三种。
SOD催化下述反应：2+2→+。
机体内的过量和不足均对机体不利，SOD 对过量的的及时清除保证了机体内的含量相对的平衡。
机体内的形成可分为生理性和病理性两方面。
在一些正常生理过程中会形成一些。
例如：呼吸链中电子传递结果可产生一些。
在某些疾病（如氩中毒、辐射病等）过程中会产生大量的。
过量的如不及时清除，会对细胞损伤。
SOD将歧化为和，而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化或氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。
2.有机溶剂沉淀法分离纯化蛋白质本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行分离纯化。
有机溶剂沉淀法的基本原理：①亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀；②水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。
常见的有机溶剂有丙酮和乙醇等。
3.邻苯三酚自氧化法测定酶活力酶活性测定的方法有以下几种方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法及亚硝酸法等。
本实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为1个酶单位。
邻苯三酚自氧化法的原理：利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，产生，生成有颜色的中间产物。
反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，吸光度值与反应时间能在3～4 min内维持线性关系。
邻苯三酚法测定超氧化物歧化酶缓释片中SOD的活性
邻苯三酚法测定超氧化物歧化酶缓释片中SOD的活性
蔡骏;李颖;尹宗宁
【期刊名称】《华西药学杂志》
【年(卷),期】2005(20)1
【摘要】目的建立超氧化物歧化酶 (SOD)缓释片的活性测定方法。
方法采用邻苯三酚自氧化法。
结果在SOD浓度为 0 .0 6 0～0 . 0 0 6mg·ml-1时线性关系良好(r=0 .9996 ) ;平均空白加样回收率为 10 1 .94 % (n=9)。
结论所用方法简单、快速 ,结果准确。
【总页数】2页(P54-55)
【关键词】缓释片;超氧化物歧化酶(SOD);超氧化物歧化酶;邻苯三酚自氧化法;活性测定;方法;线性关系
【作者】蔡骏;李颖;尹宗宁
【作者单位】四川大学华西药学院
【正文语种】中文
【中图分类】R446.11;Q503
【相关文献】
1.多酚氧化酶对邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的干扰 [J], 荣俊;杨待建
2.邻苯三酚自氧化法测定甲烷氧化菌素-铜配合物的超氧化物歧化酶活性 [J], 陈林林;张伟;王振兴;辛嘉英
3.邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的研究 [J], 许雅娟;赵艳景;胡虹
4.四种邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性方法的比较 [J], 张宏;谭竹钧
5.邻苯三酚自氧化法测定血中超氧化物歧化酶的活性 [J], 赵云斌;刘敏;余忠谊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
SOD活性测定
SOD活性测定：SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。
阻止中间物的积累而测定其酶活性。
1、试剂及仪器(1)邻苯三酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。
(2)UV－754紫外分光光度计。
2、测定方法：(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。
在25度、45ml`50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。
(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。
0.0700－A325mm/min----------------------------------------＊100％度0.70样液稀释倍数样液稀释倍数酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------50％样液体积3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。
蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。
4、比活(u/mg蛋白)的计算：单位活力(u/ml) 总活力比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
单项技能实训指导书-自由基清除剂SOD活性的测定(精)
样品管（mL）
pH8.2、50mmol/L
Tris-HCl
2.98
2.98
10mmol/L HCl
0.02
-
SOD样液
-
0.01
50 mmol/L邻苯三酚
-
0.01
4、结果处理
《保健食品》单项技能实训指导书
实训项目名称
自由基清除剂SOD活性的测定
学时
4学时
实训目的
1.掌握SOD活性测定的方法
2.熟练操作紫外分光光度计
一、配制试剂
1.pH8.2、50mmol/L Tris-HCl
称取Tris 0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用双蒸水溶解至80mL左右，用HCl调节pH =8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。
2.10mmol/L HCl
3.50 mmol/L邻苯三酚
称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。
4.SOD样液
二、邻苯三酚自氧化速率的测定
取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液，然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。
试剂
空白管（mL）
自氧化管（mL）
pH8.2、50mmol/L
Tris-HCl
2.98
2.98
10mmol/L HCl
0.02
0.01
50 mmol/L邻苯三酚
邻苯三酚自氧化法简易操作图解-测量SOD活性方法
邻苯三酚自氧化法简易操作图解-测量SOD活性方法连苯三酚自氧化法测定·O2-自由基的清除能力简介（适用于：SOD及各种抗氧化剂）文献来源[1] Xican Li. Improved Pyrogallol Autoxidation Method: A Reliable and Cheap Superoxide-scavenging Assay Suitable for All Antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60:6418-6424.操作图解具体方法1 溶液配制1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。
1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。
1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mgNa2EDTA，混合，稀释到80 mL。
用pH计测量，pH应为7.4。
用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。
（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。
1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。
再往里加连苯三酚14.6 mg (M。
W.126.1 )，即得。
（当天有效,以上为1个样品的用量）。
2 测试液2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。
超氧化物歧化酶的活性测定
超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。
离子(O2-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。
由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2-)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型。
最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。
每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。
第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。
第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。
Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。
[原理]SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。
其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。
在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。
其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。
化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。
邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性
邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的研究摘要：目前超氧化物歧化酶(SOD)活性测定结果混乱，为提高测定结果的可比性, 对邻苯三酚自氧化法测定SOD 活性的方法进行了研究，就该活力测定体系中缓冲溶液的介质组成、浓度、pH 及所含的EDTA 量等因素对测定结果的影响进行了探讨，根据实验结果，提出了新的改良方法.超氧化物歧化酶(SOD)是一种特殊的金属酶, 它能催化超氧阴离子自由基(O2—)发生歧化反应, 从而能有效清除机体内超氧阴离子自由基(O2—), 是生物体重要的细胞防御系统之一, 具有防御氧毒、抗辐射、防衰老以及防治肿瘤和抗炎等药用功效[1]，超氧化物歧化酶(SOD)这一独特的生理功能使其在医药领域具有良好的应用前景,激起了人们广泛的研究热情. 自1969 年McCord 等首次发现具有活性的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase简称SOD) 以来，众多测定SOD的方法已逐步建立起来，其中以化学法最为常用. 经典的邻苯三酚法是Marklund等[2]于1974 年发表的一种通过比色测定SOD 的简便方法. 此后，邻苯三酚法在国内外得以广泛应用. 与其他方法相比，邻苯三酚自氧化法具有操作简便，快速，试剂便宜且用量小，重复性好等优点；但文献报道的邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的测定条件各不相同，这就造成了测定结果的混乱和缺乏可比性. 为此我们对邻苯三酚自氧化法测定SOD 活性的方法进行了研究，就该测活体系中缓冲溶液的介质组成、浓度、pH及所含的EDTA 量等因素对测定结果的影响进行了探讨.1 原理在碱性条件下, 邻苯三酚迅速氧化释放出超氧化物阴离子，生成有色中间产物，吸光度随之增加，使吸光度值与反应时间呈良好的线性关系. SOD 加入邻苯三酚自氧化反应体系后，催化超氧化物阴离子生成过氧化氢，使有色中间产物的生成受阻，导致吸光值下降，邻苯三酚自氧化速率降低，可作为测定SOD 活性的理论依据.2 材料与方法（1）2.1 试剂和主要仪器一.试剂0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH8.2，内含2mmol/L EDTA)：0.2mol/L Tris(内含4mmol/L EDTA)100ml 与0.2mol/L HCl44.76ml 混合，加双蒸水至200ml，调pH8.2±0.01;邻苯三酚(45mmol/L)：以10mmol/LHCl 配制成6mmol/L 溶液，存放于冰箱备用; 所用试剂均为国产分析纯; 实验用水为自制双蒸水;二、仪器:721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)操作方法2.2 方法2.2.1 邻苯三酚自氧化速率的测定在试管中按表1加入缓冲液和双蒸水，于25℃恒温20min后加入25℃预热过的邻苯三酚(对照管用10mmol/L盐酸代替)，迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在波长325nm 处每30s 测定一次吸光值A02.2.2 SOD 活力的测定SOD 活性测定法按上述表1 操作，加入邻苯三酚前，先加入一定量SOD，并减少同体积双蒸水，其它操作均与上述2.2.1 相同，所测吸光度为方法2：一、试剂及其配制:1.pH8.2，100mM三羟甲基氨基甲烷一二甲胂酸钠缓冲液(内含2mM二乙基三氮基五乙酸)。
超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法
超氧化物歧化酶（SOD ）活性的测定方法
一、试剂
1. 0.1mol/L HCl
2. 10mmol/L HCl
3. 0.1mol/L Tris 标准溶液：12.114g 三羟甲基氨基甲烷溶于蒸馏水，并定容至1000ml.
4. 50mmol/LTris 缓冲溶液：50ml0.1mol/L Tris 标准溶液中加入0.1mol/L HCl 19.9～22.0ml,定容至100ml ，PH 为8.20。
5. 30mmol/L 邻苯三酚盐酸溶液：3.7833g 邻苯三酚溶于10mmol/LHCl 中，并用10mmol/LHCl 定容至1000ml.
二、仪器
1. 紫外分光光度计
2. 酸度计
3. 恒温水浴锅
三、操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率测定
在试管中加入4.5ml 50mmol/LTris 缓冲溶液，于25℃保温20min,加入10～20ul 30mmol/L 邻苯三酚，立即计时并摇匀，倾于比色杯内，于325nm 下，每隔1min 测吸光值一次，空白以10mmol/L HCl 代替邻苯三酚，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min 左右。
%1004
min 1min 5⨯值值－第第自氧化速率＝OD OD 2.SOD 活性测定
将样液加入到Tris 缓冲溶液中，其余步骤同自氧化速率测定方法。
活力单位定义：将一定条件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%的酶量定义为一个单位（u ）。
样品质量样液体积样品稀释倍数自氧化速率速率自氧化速率－样液氧化＝活力（⨯⨯⨯⨯5.4%50%100)/SOD ml u。
超氧化物歧化酶(SOD)活力测定
胞外抗氧化酶类酶活力的测定
原理:在碱性条件下,邻苯三酚发生自氧化反应,并产生O2-,在SOD存在下,自氧化反应受到抑制。
参考邻苯三酚测活法(Marklund 法)孙 [66]，按下表加入0.1M Tris-HCl（PH 8.0,内含1mM EDTA）和ddH2O，25℃恒温水浴20 min，加入1 mL 待测液后加入25℃预热的邻苯三酚溶液，摇匀，立即于320nm测吸光值A320，每0.5 min测定一次，持续测到5 min。
邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活力
酶活力的定义为：温度25 ℃，pH 8.0，波长320 nm处，在每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％的酶量为1个酶活力单位，酶活力按下式计算。
单位菌体SOD酶活力（U/g）=
1
-
50%
A A
V N V A
V W
∆∆
⨯⨯⨯∆
⨯⨯
邻菌
邻
A∆
邻:1分钟邻苯三酚自氧化时A320的变化量；A∆
菌：加入待测液后1分钟邻苯三酚氧化
时A320的变化量；V：待测液总体积；N：待测液稀释倍数；V0：加入的待测液的体积;W:菌体重；V1：反应总体积。
NBT光还原法_邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性的比较_简报_
河北职业技术师范学院学报 第14卷第2期,2000年6月Journal of Hebei Vocation2Technical Teachers College Vol.14 No.2 J une2000NB T光还原法、邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性的比较(简报)张文军1,葛 超2(1河北职业技术师范学院教务处,昌黎,066600;2河北职业技术师范学院食品工程系)关键词:SOD;酶活性测定方法;NB T光还原法;邻苯三酚自氧化法中图分类号:Q554+16 文献标识码:A 文章编号:1008-9519(2000)02-0068-03超氧化物歧化酶(SOD)是催化O-2歧化反应的酶类,它催化的反应是O-2+O-2+2H+H2O+ O2。
由于O-2是一种极不稳定的氧自由基,因此,检验SOD活性一直采用间接的方法。
笔者针对目前较普遍采用的邻苯三酚自氧化法和NB T光还原法,从灵敏度、精确度、反应特异性三个方面对两方法进行比较,以确定提纯过程中非纯品SOD及纯品SOD两种材料酶活测定的适用方法。
1 材料与方法111 材料纯品牛红细胞SOD、玉米SOD粗提液(自制)、超滤液(超滤膜MW=4000)、透析液(体积分数为014～019的硫铵分步沉淀后)。
本实验所用药品牛红细胞SOD为电泳纯、核黄素(上海化学试剂采购站供应,进口分装),Met(甲硫氨酸)、邻苯三酚为国产分析纯。
112 方法11211 NB T光还原法 根据Stewart和Bewley报导[1],在3mL反应液中含有13×10-3mol甲硫氨酸;75×10-5mol NB T;2×10-6mol核黄素;100×10-9mol ED TA;50×10-3mol磷酸缓冲液(p H 718),在4000lx光下照射15min后,NB T光化还原产物蓝色甲月替在560nm有最大吸收,在此条件下,反应被抑制50%所需酶量为1个活力单位。
SOD活性的测定-邻苯三酚自氧化法
SOD活性的测定-邻苯三酚⾃氧化法SOD活性的测定-邻苯三酚⾃氧化法定义：25℃时抑制邻苯三酚⾃氧化速率50%时所需的SOD量为⼀个活⼒单位。
按照GB/T5009.171-2003中邻苯三酚⾃氧化的⽅法测定酶活⼒，利⽤邻苯三酚在碱性条件下能迅速⾃氧化，释放出O2-，⽣成带⾊的中间产物。
反应开始后先变成黄绿⾊，⼏分钟后转为黄⾊，线性时间维持在3~4min。
加⼊酶液则抑制其⾃氧化速度，在325nm处测定溶液的吸光度。
酶活性单位采⽤1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚⾃氧化速率达50%时的酶定量为⼀个活⼒单位。
⼀、试剂：1、pH 7.8, 0.05mol/L的磷酸缓冲液：A液: 称取17.9g Na2HPO4?12H2O于容量瓶中定容⾄1L；B液: 称取 7.8g NaH2PO4?2H2O于容量瓶中定容⾄1L；取A液91.5mL和B液体8.5mL混匀得到pH 7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液。
2、C液: pH 8.20 ，0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)- 盐酸缓冲液(内含1mmol/L EDTA?2Na)：称取1.2114gTris和37.2mg EDTA?2Na溶于62.4mL 0.1mol/L盐酸溶液中，⽤蒸馏⽔定容⾄100mL。
3、 0.lmol/L盐酸溶液:量取2.lmL 12mol/L盐酸，蒸馏⽔定容⾄250mL。
4、.10mmol/L盐酸溶液:量取10mLO.lmol/L盐酸，蒸馏⽔定容⾄l00mL。
5、D液:4.5mmol/L邻苯三酚盐酸溶液：称取邻苯三酚(A.R)56.7mg溶于少量的10mmol/L的盐酸溶液，并定容⾄100mL。
⼆、仪器：1.冷冻离⼼机2.⽔浴锅；3．电⼦天平；4．紫外-可见分光光度计；5．精密酸度计，精确到0.01pH；6．10mL⽐⾊管；7．10mL离⼼管；8．玻璃乳钵。
三、实验步骤1．SOD粗酶液的提取称取叶⽚1g，置于研钵中研磨，加⼊3mL 0.05mol/L磷酸缓冲液，加⼊少量⽯英砂，继续在冰浴中的研钵内研磨成匀浆，取4mL⾄离⼼管中，于4℃10000r/min离⼼20min，上清液即为SOD粗提液。
猪血中超氧化物歧化酶的提取与测定
猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的提取及其活力的测定一、实验目的了解猪血中SOD的提取及其活力测定的方法和原理，为充分利用猪血资源和提取SOD 提供技术基础。
二、实验原理（1）从猪血中分离纤维连接蛋白、免疫球蛋白和血红素后,提取SOD。
通过优化邻苯三酚的用量、SOD样液用量、反应温度和缓冲液pH值,对邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的条件进行了优化。
按照优化后的条件测定联合提取的SOD的比活力。
[结果]SOD活性测定的优化条件为50mmol/L邻苯三酚7μ,l 50mmol/LTris-HCl(pH 8.2)3m,l反应温度为25℃,SOD样液添加量为10μl。
三、实验原料与试剂氯化钠：一级工业品；乙醇：工业级；氯仿：化学纯；丙酮：工业级；磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液；柠檬酸三钠：化学纯，起抗凝作用；聚丙稀酸、离心沉淀器、生理盐水、氯化钠、去离子水、-4℃左95%的乙醇、-4℃左右氯仿、的确良布、滤纸、-4℃左右的丙酮、pH=7.6的磷酸盐缓冲液、水浴、微孔滤模或定性滤纸滤清、0.4 ml 10%浓度的聚丙烯酸液、五氧化二磷干燥、38 g/L柠檬酸三钠、50%饱和硫酸铵(pH 7.0)、蒸馏水、有机弱酸HA-有机弱碱BOH四、实验方法1、猪血中SOD提取（1）血的预处理接取新鲜猪血，迅速按7份血加1份5%柠檬酸三钠搅匀。
（2）除血清、溶血将血清放入离心沉淀器，以3 000 r/min离心处理约15~20 min。
吸取上清液，下层红血球沉淀加2~3倍生理盐水。
1.2.3配制取试剂氯化钠9 g加去离子水至1 000 ml 搅溶、搅匀，3 000 r/min离心7~8 min，如此2~3次得洗涤红血球，洗涤后红血球在-15℃条件下可保存2个月。
在洗净的红血球中加入等体积去离子水，剧烈搅拌30min，在0~4℃条件下放置10 h以上，使红血球充分破裂。
按溶血体积0.2~0.25倍缓慢加入预冷至-4℃左95%的乙醇。
生物化学实验报告
⽣物化学实验报告⽣物化学实验报告动物营养研究所张树润2015.10.12猪⾎中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定⼀．实验⽬地1.通过实验了解活性物质的分离提取。
2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应⽤。
⼆．实验原理超氧化物歧化酶是⼀种酸性蛋⽩，是唯⼀以⾃由基为底物的酶，具有清除⾃由基的功能酶，在酶分⼦上共价连接⾦属辅基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。
该酶⾸次从⽜红细胞中分离得到，是⼀种蓝⾊含铜蛋⽩，之后，研究发现该蛋⽩酶具有催化氧发⽣歧化反应的能⼒，因此将其命名为超氧化物歧化酶1-2。
超氧化物歧化酶是⼀种能专⼀地清除超氧离⼦⾃由基（O2-）的⾦属酶，它具有抗衰⽼、抗辐射、抗炎抗癌等作⽤，因⽽在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、⾷品⼯业（SOD灵芝菌5等）等⽅⾯具有了⼴泛的应⽤前景。
超氧化物歧化酶是⼴泛存在于⽣物体内的⼀种⾦属酶,可催化超氧阴离⼦⾃由基(O2-)与H+发⽣歧化反应, ⽣成H2O2和O2。
SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。
超氧化物歧化酶按照它所含⾦属离⼦的不同，可分为Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。
Cu-Zn-SOD为⼆聚体，呈蓝绿⾊；Mn-SOD呈紫红⾊；Fe-SOD呈黄褐⾊。
SOD提取、纯化制备⽅法各异, 常⽤⽅法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。
本实验采⽤有机溶剂沉淀法8以新鲜猪⾎为原料，从中提取SOD并进⾏纯化。
酶活⼒测定可⽤以下⽅法：邻苯三酚⾃氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素⾃氧化法、亚硝酸法等。
该实验SOD酶活性采⽤邻苯三酚⾃氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚⾃氧化速率达50%的酶量定义为⼀个酶单位。
样品中蛋⽩质含量⽤考马斯亮蓝G-250法测定。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红⾊，与蛋⽩质结合呈现蓝⾊。
邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶的活性
超氧化物歧化酶（SOD）的活性测定——邻苯三酚自氧化法一、实验原理本实验采用邻苯三酚自氧化法测定SOD的活力。
邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出超氧阴离子O2-，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。
这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长出有强烈光吸收。
当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。
酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。
该法所用试剂和仪器比较普通，测试方便，灵敏度高，是目前应用最广泛的一种测试方法，但对温度、PH、邻苯三酚浓度、SOD待测液存放时间等诸因素比较敏感，因此测定时严格控制这些因素。
二、试剂和器材1、试剂（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用双蒸水溶解至80mL 左右，用HCl调节pH =8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。
（2）10mmol/L HCl（3）50 mmol/L邻苯三酚称取邻苯三酚(A.R)0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。
（4）SOD样液2、器材（1）恒温水浴槽（2）紫外分光光度计（3）试管、刻度吸管、微量注射器三、方法和步骤1、邻苯三酚自氧化速率的测定取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s 读数一次，测定4min 内每分钟光吸收值的变化。
改良后的邻苯三酚自氧化法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性
改良后的邻苯三酚自氧化法A.1试剂的制配A.1.1A液：pH8.200.1mol/l三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲溶液（内含1mmol/L EDTA·2Na）。
称取1.2114g Tris和37.2mg EDTA·2Na溶于62.4ml0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100ml。
A.1.2B液：4.5mmol/l邻苯三酚盐酸溶液。
称取邻苯三酚（A.R）56.7mg溶于少量10mmol/L盐酸溶液，待邻苯三酚完全溶解后，用10mmol/L盐酸溶液定容至100ml。
A.1.310mmol/l盐酸溶液。
A.1.4供试品溶液：取1ml于500ml容量瓶中，用蒸馏水定容到500ml。
即得供试液。
A.1.5蒸馏水：双重石英蒸馏水。
A.2仪器紫外-可见分光光度仪，精密酸度计（精密度0.01pH），试管数支，100μl移液枪，1000μl移液枪，10ml移液枪。
A.3方法A.3.1调零在25℃左右，取2支试管，分别依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.15ml；在325nm波长条件下，调零。
A.3.2邻苯三酚自氧化速率测定△A325在25℃，取2支试管（A管和B管），A 管中依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.00ml；B管中分别加入B液0.15ml，把A管倒入B管中，迅速摇匀，倾入比色皿，以A液2.35ml+蒸馏水2.15ml作为空白对照，在325nm波长下每隔30s记录一次A值，共测6次，要求自氧化速率控制在0.060（±0.003）OD/min。
A.3.3酶活测定在25℃，在试管中加入A液2.35ml，蒸馏水1.8ml，在25℃的水浴中预热5min,然后加入Vml的样液，再加入0.15mlB液，迅速摇匀，倾入比色皿，以A液2.35ml+蒸馏水2.15ml作为空白对照，在325nm波长下每隔30s 记录一次A值，共测6次。
在此条件下，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率50%的酶量定为1个活力单位，即△A′325=1/2△A325。
试验一 SOD
试验一：猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活力测定一、原理超氧化物歧酶(Superoxidedismutase,SOD)是一种能专一地清除超氧离子自由基(02-)的金属酶，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定，其催化反应为：2H++2O2- H2O2+O2 按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。
Cu-Zn-SOD为二聚体，呈蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。
本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。
采用邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为一个酶单位。
样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。
考马斯亮蓝G-250 (Coomassic brilliant blue G-250)在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。
在一定范围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围1-1000ug。
二、实验试剂与器材[试剂]1.SOD的提取①ACD抗凝剂：柠檬酸10g柠檬酸钠30g，葡萄糖25g，用适量蒸馏水溶解并稀释至1000ml②0.9%NaCl：称取NaCl 0.9g，溶于100ml蒸馏水中③丙酮④95%乙醇⑤氯仿2.SOD活力测定①50 mmol/L pH8.3磷酸缓冲液②10 mmol/L EDTA钠盐溶液③3 mmol/L邻苯三酚溶液(用10mmol /L盐酸配制)3.考马斯亮蓝G-250法测蛋白质①考马斯亮蓝G-250试剂：称取l00mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%(W/V)的磷酸，蒸馏水定容至1000ml。
此试剂常温下可保存30天。
②标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清白蛋白25mg，加蒸馏水溶解并定容至100ml，吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml，即为100ug/ml的标准蛋白质溶液。
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邻苯三酚自氧化法测定sod活性及含量
一、实验原理:
邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。
当有SOD存在时，由于
它能催化O2-与H+结合生成O
2和H
2
O
2
，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过
测定光吸收即可求出SOD的酶活性。
二、实验试剂：
大宝sod蜜、冷丙酮、磷酸缓冲液（PH7.8，0.05mol/L)、氯仿-乙醇混合液、邻苯三酚、浓盐酸、天平、石英砂、研钵、冷冻离心机、50mL离心管 8个、紫外-可见分光光度计、250mL三角瓶8个、玻璃棒8根、试剂瓶250mL 3个、500mL 3个、250mL烧杯16个、试管带胶塞80根、移液管各5根
这个液体貌似是不能研磨的，而且本身就是酶，正常的生物体内的酶不都是可溶的？研磨是为了破碎细胞的。
我觉得应该是通过加水——打碎胶体，把抗氧化剂全都搞到水中（这个拜托查下）——分液——乙醇-氯仿沉淀（用来鉴别是带Mn还是CuZn）（不知道会不会有另外两种抗氧化剂干扰）——透析（去离子电泳用）
乙醇-氯仿的浓度比
酶的保存问题：测一下大宝pH应该可以作为参考，但是这个酶种类太多了，要点就是pH至少不能小于6，关于最适合pH是否也要测量？还是说我们是为了测量大宝里面SOD的活性所以就按照大宝的pH保存。
还有一个小小的想法就是。
这部分是1次做完还是两次做完？
EDTA二钠：几乎不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3。
用于络合金属离子和分离金属。
干扰物，但是没有氧化性
三、实验步骤：
（1）SOD提取：
取大宝sod蜜加入15mL的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。
(留出1mL备用，准确量取剩余上清液体积，记录)
（2）除杂蛋白：
提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅拌10min，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。
（取1mL粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）
（3）SOD酶的沉淀分离：
剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。
将沉淀先加2mL磷酸缓冲液，溶解后再加3mL混匀。
6000rpm 离心15min，取上清得到SOD酶液。
取1mL备用，其余量取体积。
（4）粗酶液活性测定：
提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下。
加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸光值。
（5）溶液中可溶性蛋白含量测定：
分别从1mL备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3mL按以下倍数稀释，260nm/280nm测定吸光值，按公式计算蛋白质浓度。
提取液稀释：50 ×
粗酶液稀释：20 ×
酶液稀释：10 ×
四、实验数据：
五、实验结果及数据处理：
（1）酶活力单位
提取液酶活力单位：=2（OD
1-OD
2
）×5/0.1=
粗酶液活力单位：=2（OD
1-OD
2
）×5/0.1=
酶液活力单位：=2（OD
1-OD
2
）×5/0.1=
（2）总活力
提取液总活力U=活力单位×总体积=
粗酶液总活力=活力单位×总体积=
酶液总活力=活力单位×总体积=
（3）比活力
提取液酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度= 粗酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=
酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=
（4）纯化倍数
粗酶液纯化倍数=粗酶液比活力/提取液比活力= 酶液纯化倍数=酶液比活力/提取液比活力= （5）回收率
粗酶液回收率=粗酶液总活力/提取液总活力=
酶液回收率=酶液总活力/提取液总活力=。