邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性
邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性
2.1试剂和主要仪器
一.试剂
0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2，内含2mmol/L EDTA)：0.2mol/L Tris(内含4mmol/L EDTA)100ml与0.2mol/L HCl44.76ml混合，加双蒸水至200ml，调pH8.2±0.01;邻苯三酚(45mmol/L)：以10mmol/LHCl配制成6mmol/L溶液，存放于冰箱备用;所用试剂均为国产分析纯;实验用水为自制双蒸水;
目前超氧化物歧化酶sod活性测定结果混乱为提高测定结果的可比性对邻苯三酚自氧化法测定sod活性的方法进行了研究就该活力测定体系中缓冲溶液的介质组成浓度ph及所含的edta量等因素对测定结果响进行了探讨根据实验结果提出了新的改良方法超氧化物歧化酶sod是一种特殊的金属酶它能催化超氧阴离子自由基02发生歧化反应从而能有效清除机体内超氧阴离子自由基02是生物体重要的细胞防御系统之一具有防御氧毒抗辐射防衰老以及防治肿瘤和抗炎等药用功效1超氧化物歧化酶sod这一独特的生理功能使其在医药领域具有良好的应用前景激起了人们广泛的研究热情
2.SOD或粗醉抽提液的活性浏定:
测定时按表2加样，测定步骤与测邻苯三酚的自氧化速率同。
酶活力单位定义:在1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为一个活力单位，即420nm0.030D/分为一个活力单位。若自氧化速率在36~65%，通常可按比例计算，不在此范围内的数值应增减样液量。
二、仪器:
721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)
操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率的测定:在试管中按表l加入缓冲液和双蒸水，25℃保温劝分钟，然后加入25℃预温的邻苯三酚(对照管用10mMHCI代替)，迅速摇匀，倒入比色杯中，在4加nm的分光光度计中，每隔半分钟测一次OD值，要求自氧化速率控制在0.060OD/分。
邻苯三酚法测定超氧化物歧化酶缓释片中SOD的活性
! 5 6 5 6 供试品溶液的制备 取 9.: 骨架缓释片 +’ 片， 研细， 精密称取适量 （约相当于 9.: &’’ !<） ， 置 用 0, 3(’ 磷酸盐缓冲液定容至 )’’ !# 的量瓶中， 冰水浴间断超声 2’ !56， 用 ’(1 ! )’’ !#， ! 微孔滤膜 滤过， 弃去初滤液， 取续滤液作为供试品溶液。 ! 56 5 8 辅料对含量测定的影响 按骨架缓释片的 处方比例称取辅料适量， 置 &’’ !# 量瓶中， 照 “& J 2 J 项下方法处理， 取续滤液， 于 +’’ P /’’ 6! 范围内 2” 扫描， 结果表明辅料在 2+) 6! 处无吸收， 不影响测 定。 “ & J 2 J +” 项下的对照品 ! 56 5 9 线性关系的考察 取 溶液， 用 0, 3(’ 的磷酸盐缓冲液分别稀释成 O’、 /1、 ・!# % & O 种溶液， 照 “ & J 2 J &” 项下方法 2O、 +/、 &+、 O! < 测定 9.: 的活力， 以活力值对浓度进行线性回归， 在 得到回归方程： ; = 1N&(1) # Q /(&N。结果表明： %& ・ 线性关系良好 （ $ = ’(NNNO） 。 O’ P O ! < !# 范围内， ! 5 6 5 : 方法精密度考察 取一批 9.: 骨架缓释片， 照 “&J2J2” 项下方法制得供试品溶液， 再按 “&(2(&” 项 下方法进行活力测定， 分别测定 ) 次， %&’ = +(2)? 。 ! 56 5 ; 空白加样回收实验 按 处 方 量 的 1’? 、
其中邻苯三 的顺应性。测定 ;<= 活性的方法很多， 酚法简便易行， 现用其测定缓释片中 ;<= 的活性， 可有效地控制制剂的质量。
用邻苯法三酚测定大蒜中超氧化物歧化酶活性
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得到充分的锻炼， 从而培养了他们的科研思维、 科研意识， 增加 了对科学的兴趣。
参考文献： . " / 012%34 5 0 6， 7384%982:’ ;<=13%>841 48?@<AB?1 BC 1CDE@82 F<C2A8%C F%3 13EA:3%2<=318C G :13C%2%=318C H . 5 / ’ I<3 5 J8%K:1@ ， "LML ， (## ： M*#L N
原理： 邻苯
三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出 ,$ ， +,- 能催化 ,$ ! 发生歧化反应，生成 0$ ,$ 和 ,$ ，从而抑制邻苯三酚的自氧 化， 反应如下： 样品对邻苯三酚自氧化速 $,$ F $0= 0$ ,$ F ,$ 。
!
率的抑制率， 即反映样品中 +,- 的含量。 % " ) 邻苯三酚自氧化速率的测定。取 #3A (’33GA D = HC2I ! 用 89 ! $:( 岛津自动记录分光光度 0JA， K0L& ’ 缓冲液作空白， 迅速混匀， 然后快 计， 调零点， 再取 #3A 缓冲液加入邻苯三酚， 速倒入 "M3 石英比色杯中，置 $(N 恒温池中，波长 #$(B3，在 计算线性范围内每分钟光密 $32B 内连续测定其光密度值变化。
采用邻苯三酚自氧化法对普通大蒜、 紫皮独头蒜的酶粗液进行 +,- 活性测定。结果 紫皮独头蒜与普通大蒜酶活性不同。 紫皮独头蒜酶活性高于普通大蒜酶活性。结论 在实验教学中选用食用大蒜为材料可增加学生对科学的兴趣。 关键词： 超氧化物歧化酶； 邻苯三酚； 酶活性 中图分类号： T>$>& #" 文献标识码： U 文章编号： ":P" ! "$>: % $’’P ) ’# ! ’""# ! ’$ 度值的增加 （ ， 即为邻苯三酚自氧化速率 （ 。 E ?） E ?’ ） % $ ) 样品酶活性的测定。采用邻苯三酚自氧化法测定酶活 性。在加入邻苯三酚之前， 需先加入待测酶粗液于缓冲液中， 混 匀， 再加入邻苯三酚， 迅速混匀， 然后快速倒入 "M3 石英比色杯 中， 置 $(N 恒温池中， 波长 #$(B3， 在 $32B 内连续测定其光密 度值变化。 % # ) 样品酶活性的计算。
动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定
动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定原理超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。
离子(02-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。
由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2 -)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型。
最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D 酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。
每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。
第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。
第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。
Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。
l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。
自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。
迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。
藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。
为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。
邻苯三酚自氧化法测定血浆超氧化物歧化酶的方法学评价及临床应用探讨
邻苯三酚自氧化法测定血浆超氧化物歧化酶的方法学评价及临床应用探讨张凡;李兴武;钟政荣【期刊名称】《淮海医药》【年(卷),期】2015(000)003【摘要】目的：对邻苯三酚自氧化法测定血浆超氧化物歧化酶（ SOD）的方法学进行评价，并探索其临床应用价值。
方法根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）的评价方法，应用邻苯三酚自氧化法检测血浆SOD，评价其精密度、准确度、线性和回收率；随机选取2014年健康体检者42例作为对照组，2014年3－12月我院住院氧化应激反应相关疾病患者1580例作为疾病组，测定血浆SOD的活性水平，进行临床应用评价。
结果用邻苯三酚自氧化法测定SOD精密度试验中批内精密度为1．57％和4．8％，批间精密度为2．17和2．21％；准确性试验相对偏倚为：1．6％和2．4％；线性试验在0～250 U／ml内R2为0．9978；回收率为96．2％～103．4％；SOD在各疾病组与健康对照组差异均具有显著性（P＜0．01）。
结论邻苯三酚自氧化法测定SOD方法学评价符合要求，其精密度高、准确性好，线性范围宽，具有较高的临床应用价值。
%Objective To evaluatethe methodology of determination of plasma superoxide dismutase(SOD) by means of pyrogallol autoxidation and explore its clinicalapplication.Methods Based on the USA Clinical and Laboratory StandardsIn-stitute (CLSI),plasma SOD was determined using pyrogallol autoxidation to evaluate its precision,accuracy,linearity and re-covery rate.42 healthy checkup people in 2014 were selected as a control group and 1580 casesof inpatients from March to December in 2014 who had related disease with oxidative stress reaction were chosen as a disease group.Their level activity of plasma SOD was determined.These inpatients were divided into 6 disease groups in terms of liver,renal,digestive system,re-spiratory system,cardiovascular,and diabetes diseases.Results By the test of determining the precision of SOD with pyrogal-lol autoxidation,the within-run precision were 1.57%and 4.8%and the between-run precision were 2.17%and 2.21%.The relative biases were 1.6% and 2.4% in the accuracy test.R2 was 0.9978 within 0~250U/ml in the linear test.Recovery rates were 96.2%~103.4%.There were significant differences of SOD between each disease group and healthy control group (P<0.01).Conclusion The methodological evaluation of determining SOD with pyrogallol autoxidation meets the require-ment for its high precision,good accuracy and wide linear range.The method has high value in clinical application.【总页数】3页(P227-229)【作者】张凡;李兴武;钟政荣【作者单位】蚌埠医学院第一附属医院检验科，安徽蚌埠 233004;蚌埠医学院第一附属医院检验科，安徽蚌埠 233004;蚌埠医学院第一附属医院检验科，安徽蚌埠 233004【正文语种】中文【中图分类】R44【相关文献】1.邻苯三酚自氧化法测定血清超氧化物歧化酶变异因素的探讨和控制 [J], 张建新;石南宁;康学军;王彦;黄新生2.邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的研究 [J], 许雅娟;赵艳景;胡虹3.人血浆、红细胞超氧化物歧化酶活性邻苯三酚自氧化抑制同步测定法及其临床应用 [J], 徐元仁;穆红;孙传珍;翟德佩;苏中;刘春艳4.四种邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性方法的比较 [J], 张宏;谭竹钧5.邻苯三酚自氧化法测定血中超氧化物歧化酶的活性 [J], 赵云斌;刘敏;余忠谊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法
超氧化物歧化酶（SOD ）活性的测定方法
一、试剂
1. 0.1mol/L HCl
2. 10mmol/L HCl
3. 0.1mol/L Tris 标准溶液：12.114g 三羟甲基氨基甲烷溶于蒸馏水，并定容至1000ml.
4. 50mmol/LTris 缓冲溶液：50ml0.1mol/L Tris 标准溶液中加入0.1mol/L HCl 19.9～22.0ml,定容至100ml ，PH 为8.20。
5. 30mmol/L 邻苯三酚盐酸溶液：3.7833g 邻苯三酚溶于10mmol/LHCl 中，并用10mmol/LHCl 定容至1000ml.
二、仪器
1. 紫外分光光度计
2. 酸度计
3. 恒温水浴锅
三、操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率测定
在试管中加入4.5ml 50mmol/LTris 缓冲溶液，于25℃保温20min,加入10～20ul 30mmol/L 邻苯三酚，立即计时并摇匀，倾于比色杯内，于325nm 下，每隔1min 测吸光值一次，空白以10mmol/L HCl 代替邻苯三酚，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min 左右。
%1004
min 1min 5⨯值值－第第自氧化速率＝OD OD 2.SOD 活性测定
将样液加入到Tris 缓冲溶液中，其余步骤同自氧化速率测定方法。
活力单位定义：将一定条件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%的酶量定义为一个单位（u ）。
样品质量样液体积样品稀释倍数自氧化速率速率自氧化速率－样液氧化＝活力（⨯⨯⨯⨯5.4%50%100)/SOD ml u。
超氧化物歧化酶(SOD)活力测定
胞外抗氧化酶类酶活力的测定
原理:在碱性条件下,邻苯三酚发生自氧化反应,并产生O2-,在SOD存在下,自氧化反应受到抑制。
参考邻苯三酚测活法(Marklund 法)孙 [66]，按下表加入0.1M Tris-HCl（PH 8.0,内含1mM EDTA）和ddH2O，25℃恒温水浴20 min，加入1 mL 待测液后加入25℃预热的邻苯三酚溶液，摇匀，立即于320nm测吸光值A320，每0.5 min测定一次，持续测到5 min。
邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活力
酶活力的定义为：温度25 ℃，pH 8.0，波长320 nm处，在每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％的酶量为1个酶活力单位，酶活力按下式计算。
单位菌体SOD酶活力（U/g）=
1
-
50%
A A
V N V A
V W
∆∆
⨯⨯⨯∆
⨯⨯
邻菌
邻
A∆
邻:1分钟邻苯三酚自氧化时A320的变化量；A∆
菌：加入待测液后1分钟邻苯三酚氧化
时A320的变化量；V：待测液总体积；N：待测液稀释倍数；V0：加入的待测液的体积;W:菌体重；V1：反应总体积。
稻米中超氧化物歧化酶含量及活性分析
稻米中超氧化物歧化酶含量及活性分析作者：杨先炯来源：《安徽农业科学》2017年第02期摘要[目的]对不同稻米中超氧化物歧化酶（SOD）的含量及活性进行测定、分析。
[方法]采用沉淀法从不同种类稻米中提取SOD，然后用改良的邻苯三酚自氧化法进行SOD活性分析，比较不同稻米中SOD含量及活性的差异。
[结果]糯米中的SOD含量高于粳米，但两者活性差异不大。
高纬度地区所产稻米的SOD含量及活性均高于低纬度地区所产稻米。
胚芽保留程度高的鲜糙米SOD含量及活性最高。
[结论]沉淀法可以有效地从稻米中提取SOD。
不同种类、产区和加工工艺稻米中SOD含量及活性存在差异。
关键词稻米；超氧化物歧化酶；含量；活性；邻苯三酚自氧化中图分类号 S511 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）02-0011-02Abstract[Objective] To determine and analyze the content and activity of superoxide dismutase （SOD） in different types of rice.[Method] SOD was isolated by precipitation process from different types of rice， and its activity was determined through modified pyrogallol selfoxidation.[Result] Glutinous rice had higher SOD content than japonica rice， however， SOD activity did not have significant difference. Both of SOD content and activity in rice from high latitude area were higher than that of rice from low latitude region. Moreover， brown rice with germ exhibited the highest SOD content and activity.[Conclusion] Precipitation process is an effective method for SOD isolation from rice. There are significant differences of SOD content and activity in different types of rice.Key words Rice；Superoxide dismutase；Content；Activity；Pyrogallol selfoxidation超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内的重要抗氧化酶，具有特殊的生物学活性[1]。
邻苯三酚法测定3种食用菌超氧化物歧化酶_SOD_活性_张中林
185第11卷 第5期 2009 年 5 月辽宁中医药大学学报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 11 No. 5 May，2009邻苯三酚法测定3种食用菌超氧化物歧化酶（SOD）活性张中林1，孙宏伟2，郑剑玲1，李 岩1，王美惠1，段 薇1（1.辽宁中医药大学职业技术学院，辽宁 沈阳 110101；2.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032）摘 要：目的：比较3种食用菌中超氧化物歧化酶（SOD）活性。
方法：选取辽宁省农科院食用真菌研究所提供的3种鲜菌菇，采用邻苯三酚法对食用菌进行SOD 活性的测定。
结果：3种食用菌中SOD 酶活性均为阳性。
结论：3种食用菌SOD 酶活性依次递增顺序为鲜金针菇、滑子菇、草菇。
关键词：超氧化物歧化酶；邻苯三酚；食用菌中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1673-842X (2009)05- 0185- 02Determination of the Superoxide Dismutase in Three Typesof Edible Fungi by Hepatocyes Autoxidation ZHANG Zhong-lin 1, SUN Hong-wei 2，ZHENG Jian-ling 1, LI Yan 1，WANG Mei-hui 1，DUAN Wei 1（1.Vocational and Technical Education College of Liaoning University of TraditionalChinese Medicine ,Shenyang 110101, Liaoning,China；2. Liaoning University ofTraditional Chinese Medicine，Shenyang 110032, Liaoning, China）Abstract：Objective :To compare the superoxide dismutase （SOD ）activities of the three types of edible fungi. Methods : Fresh edible fungi were chosen from edible fungi institute liaoning academy of agricutural sciences. The SOD activities were determined by hepatocytes autoxidation. Results : It was showed that SOD activities were fond in three types of edible fungi. Conclusion : The SOD activities increases by a golden needle mushroom, pear mushroom, straw mushroom.Key words：SOD; Hepatocytes Autoxidation ; Edible Fungi 收稿日期：2008-12-02作者简介：张中林 (1963-) ，女，辽宁沈阳人，实验师，学士，主要从事免疫生化工作。
邻苯三酚自氧化法测定SOD活性中测定波长的选择
3经验交流3邻苯三酚自氧化法测定SOD活性中测定波长的选择孙雪奇,陈齐英,别小琳(四川省药品检验所,四川成都610034)提要:用岛津UV-240型、260型和T-1901紫外可见分光光度计进行实验,确定邻苯三酚自氧化法测定S OD活性的最适波长非文献使用的420nm和325nm,而应为320nm。
关键词:邻苯三酚自氧化法;S OD活性;波长中图分类号:R917文献标识码:B文章编号:1006-0103(2004)05-0404-02 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,S OD)为体内自由基的清除剂,在生物体的正常代谢中起重要作用,其活性测定常用邻苯三酚自氧化法[1]。
该方法主要是通过测定邻苯三酚自氧化前4min内, S OD对自氧化初始中间产物增加的抑制作用来测定S OD活性。
文献报道的测定波长主要有420nm[1]和325nm[2]。
为探讨初始中间产物的吸收峰位置,进而确定测定波长,特对此进行了研究。
1 实验部分111 仪器与试剂 UV-260和UV-240紫外可见分光光度计(日本岛津公司);T-1901紫外可见分光光度计(上海科学仪器厂)。
试剂均为国产分析纯。
112 方法 吸取4.5ml100mm ol・L-1的T ris-HCl缓冲液(pH812)和4146ml蒸馏水,混匀后置25℃水浴中20min,立即加入在25℃预热的30mm ol・L-1邻苯三酚40μl(10mm ol・L-1的HCl溶液配制),立即混匀,迅速倒入比色池中,以10mm ol・L-1的HCl溶液为空白,分别用上述3种型号的紫外可见分光光度计测定邻苯三酚自氧化中间产物的吸光度。
113 结果 UV-240紫外可见分光光度计测定可知,邻苯三酚自氧化初始中间产物的吸收峰在320～319nm 处。
T-1901和UV-260紫外可见分光光度计两种仪器测得的λmax均出现在320nm波长处,此时在420nm处吸光度还很小,到5min时吸光度<011,可见420nm处吸光度的变化不能反映中间产物的积累,因此,用420nm进行S OD酶活性测定是不正确的。
实验二 超氧化物歧化酶的活性测定
（2）10mmol/L HCl （3）50 mmol/L邻苯三酚
称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL， 避光保存。
（4）SOD样液
试剂和器材
1、试剂 （1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl
称取Tris 0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用双蒸水溶解至80mL左右， 用HCl调节pH =8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。
方法和步骤
试剂 空白管（mL） 自氧化管（mL）
pH8.2、50mmol/L Tris-HCl
10mmol/L HCl 50 mmol/L邻苯三酚
2.98
0.02 -
2.98
0.01 0.01
方法和步骤
2、SOD样液的活性测定 样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的 待测酶液，再加邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化 速率的测定。
（2）10mmol/L HCl （3）50 mmol/L邻苯三酚
称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL， 避光保存。
（4）SOD样液
试剂和器材
2、器材 （1）恒温水浴槽 （2）紫外分光光度计 酚自氧化速率的测定 取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加 入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯 三酚 ），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波 长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分 钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光 吸收值为0.07（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收 值）。
酶工程实验二
超氧化物歧化酶的活性测定
实验背景
实验2 大蒜SOD
大蒜中超氧化物歧化酶的提取及其酶活力测定一、实验目的：⒈掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。
⒉了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。
⒊掌握离心机的使用。
二、实验原理：邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在420nm有最大吸收峰。
邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。
颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。
三、实验材料及试剂：大蒜、磷酸缓冲液（PH7.8, 0.05mol/l）、氯仿—乙醇混合液、冷丙酮、邻苯三酚（45mmoL/L）(焦性没食子酸)、浓盐酸四、操作步骤：1、SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞，加入15ml的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm 离心，弃去沉淀，得上清液。
(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录)2、除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿－乙醇混合液搅拌10分钟，6000rpm 离心15min去沉淀，得粗酶液。
（取1ml粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）3、SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm 离心15min，得到SOD酶沉淀。
将沉淀每管先加2ml磷酸缓冲液，溶解后在加3ml 混匀。
6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。
取1ml备用，其余量取体积。
4、粗酶液活性测定（邻苯三酚法）提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下。
加入邻苯三酚后迅速混匀,准确计时4min,加一滴浓盐酸停止反应,420nm测吸光值.5、溶液中可溶性蛋白含量测定：分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度.提取液稀释:50 ×粗酶液稀释:20 ×酶液稀释:10 ×蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280 –0.74A260) ×稀释倍数6、计算：酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1(1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量)总活力U=活力单位×总体积比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力五、实验数据记录及结果计算：1、提取液、粗酶液、酶液体积记录(除去留下的1ml)2、420nm吸光值测定：3、稀释后的SOD提取液280nm\260nm吸光值：4、按公式计算蛋白质浓度：稀释提取液中蛋白质浓度：（1.45×0.055－0.74×0.082）×50=0.9535mg/ml 稀释粗酶液中蛋白质浓度：（1.45×0.098－0.74×0.144）×20=0.7108mg/ml 稀释酶液中蛋白质浓度：（1.45×0.030－0.74×0.040）×10=4.054mg/ml5、酶活力单位、总活力、比活力计算：6、粗酶液：纯化倍数=粗酶液比活力/提取液比活力=35.9595/15.1023=2.3811回收率=粗酶液总活力/提取液总活力=25.56/14.4×100%=177.5%酶液：纯化倍数=酶液比活力/提取液比活力=5.6167/15.1023=0.3719回收率=酶液总活力/提取液总活力=22.77/14.4×100%=158.1%。
牛奶中超氧化物歧化酶(SOD)活性的研究
牛奶中超氧化物歧化酶(SOD)活性的研究
王惠生;陈海萍;卞军
【期刊名称】《中国牛业科学》
【年(卷),期】2000(026)001
【摘要】本试验采用邻苯三酚自氧化法,对牛奶中SOD活性进行了研究.结果表明:在泌乳期间SOD活性是初乳＞末乳＞常乳.其测定值分别为11.4、8.0和6.9u/ml.在泌乳期内随泌乳时间呈规律性变化,初乳是产后第一天最高,以后迅速下降(C.V:16.5%);常乳是第一、二泌乳月下降,第三、四泌乳月最低,第五、六泌乳月回升,第七、八泌乳月稳定(C.V:26.0%);末乳相对比较稳定(C.V:13.2%).在不同个体间有一定程度的差异(C.V:22.8%).
【总页数】3页(P20-22)
【作者】王惠生;陈海萍;卞军
【作者单位】西北农林科技大学教学实验场,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学教学实验场,陕西杨凌,712100;西安奶业研究所,西安,710005
【正文语种】中文
【中图分类】S811.3;S852.2
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猪血中超氧化物歧化酶的提取与测定
猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的提取及其活力的测定一、实验目的了解猪血中SOD的提取及其活力测定的方法和原理，为充分利用猪血资源和提取SOD 提供技术基础。
二、实验原理（1）从猪血中分离纤维连接蛋白、免疫球蛋白和血红素后,提取SOD。
通过优化邻苯三酚的用量、SOD样液用量、反应温度和缓冲液pH值,对邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的条件进行了优化。
按照优化后的条件测定联合提取的SOD的比活力。
[结果]SOD活性测定的优化条件为50mmol/L邻苯三酚7μ,l 50mmol/LTris-HCl(pH 8.2)3m,l反应温度为25℃,SOD样液添加量为10μl。
三、实验原料与试剂氯化钠：一级工业品；乙醇：工业级；氯仿：化学纯；丙酮：工业级；磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液；柠檬酸三钠：化学纯，起抗凝作用；聚丙稀酸、离心沉淀器、生理盐水、氯化钠、去离子水、-4℃左95%的乙醇、-4℃左右氯仿、的确良布、滤纸、-4℃左右的丙酮、pH=7.6的磷酸盐缓冲液、水浴、微孔滤模或定性滤纸滤清、0.4 ml 10%浓度的聚丙烯酸液、五氧化二磷干燥、38 g/L柠檬酸三钠、50%饱和硫酸铵(pH 7.0)、蒸馏水、有机弱酸HA-有机弱碱BOH四、实验方法1、猪血中SOD提取（1）血的预处理接取新鲜猪血，迅速按7份血加1份5%柠檬酸三钠搅匀。
（2）除血清、溶血将血清放入离心沉淀器，以3 000 r/min离心处理约15~20 min。
吸取上清液，下层红血球沉淀加2~3倍生理盐水。
1.2.3配制取试剂氯化钠9 g加去离子水至1 000 ml 搅溶、搅匀，3 000 r/min离心7~8 min，如此2~3次得洗涤红血球，洗涤后红血球在-15℃条件下可保存2个月。
在洗净的红血球中加入等体积去离子水，剧烈搅拌30min，在0~4℃条件下放置10 h以上，使红血球充分破裂。
按溶血体积0.2~0.25倍缓慢加入预冷至-4℃左95%的乙醇。
大蒜SOD
大蒜中超氧化物歧化酶的提取及其酶活力测定一、实验目的：⒈掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。
⒉了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。
⒊掌握离心机的使用。
二、实验原理：邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在420nm有最大吸收峰。
邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。
颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。
三、实验材料及试剂：大蒜、磷酸缓冲液（PH7.8, 0.05mol/l）、氯仿—乙醇混合液、冷丙酮、邻苯三酚(焦性没食子酸)、浓盐酸四、操作步骤：1、SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞，加入15ml的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm 离心，弃去沉淀，得上清液。
(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录)2、除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿－乙醇混合液搅拌10分钟，6000rpm 离心15min去沉淀，得粗酶液。
（取1ml粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）3、SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm 离心15min，得到SOD酶沉淀。
将沉淀每管先加2ml磷酸缓冲液，溶解后在加3ml 混匀。
6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。
取1ml备用，其余量取体积。
4、粗酶液活性测定（邻苯三酚法）提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下。
加入邻苯三酚后迅速混匀,准确计时4min,加一滴浓盐酸停止反应,420nm测吸光值.5、溶液中可溶性蛋白含量测定：分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度.提取液稀释:50 ×粗酶液稀释:20 ×酶液稀释:10 ×蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280 –0.74A260) ×稀释倍数6、计算：酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1(1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量)总活力U=活力单位×总体积比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力五、实验数据记录及结果计算：1、提取液、粗酶液、酶液体积记录(除去留下的1ml)2、420nm吸光值测定：3、稀释后的SOD提取液280nm\260nm吸光值：4、按公式计算蛋白质浓度：稀释提取液中蛋白质浓度：（1.45×0.055－0.74×0.082）×50=0.9535mg/ml 稀释粗酶液中蛋白质浓度：（1.45×0.098－0.74×0.144）×20=0.7108mg/ml 稀释酶液中蛋白质浓度：（1.45×0.030－0.74×0.040）×10=4.054mg/ml5、酶活力单位、总活力、比活力计算：6、粗酶液：纯化倍数=粗酶液比活力/提取液比活力=35.9595/15.1023=2.3811回收率=粗酶液总活力/提取液总活力=25.56/14.4×100%=177.5%酶液：纯化倍数=酶液比活力/提取液比活力=5.6167/15.1023=0.3719回收率=酶液总活力/提取液总活力=22.77/14.4×100%=158.1%。
超氧化物歧化酶两种邻苯三酚自氧化测定活力方法的比较
超氧化物歧化酶两种邻苯三酚自氧化测定活力方法的比较杨明琰1,2,张晓琦2,沈 俭2,黄继红2,郭爱莲1(1.西北大学生命科学院,陕西西安 710069;2.陕西省微生物研究所,陕西西安 710043)摘 要 在同一反应条件下,以酵母SOD为原料,对2种邻苯三酚自氧化测定SOD的方法进行了比较,实验结果表明325nm法测定的酶活力单位与420nm法测定的酶活力单位的比值约为2.7,考察了不同浓度邻苯三酚对SOD活力的影响。
关键词 酵母菌超氧化物歧化酶;活力测定;420nm法;325nm法;比值中图分类号 Q550 文献标识码 A 文章编号 1005-7021(2006)03-0040-03SOD Activity Determination Comparison bet w eenTwo Pyrogallol AutoxidationYAN G Ming2yan1,2,ZHAN G Xiao2qi2,SHEN Jian2,HUAN G Ji2hong2,GUO Ai2lian1(1.Sch.of L if e Sci.N W U niv.Xi’an710069;2.Inst.of Microbiol.Xi’an710043)Abstract Under identical testing circumstance,take yeast SOD as raw materials,two pyrogallol auxidation deter2 mination methods were compared.The results showed that the ratio of enzyme activity unit determined with325nm and420nm was about2.7,the effects of different concentrations of pyrogallol on SOD activity were also considered.K eyw ords yeast SOD;activity determination;method of325nm;method of420nm;ratio 超氧化物歧化酶(SOD)是一种重要的氧自由基清除剂,与人类健康有密切的关系,现已广泛应用在食品、化妆品及药品领域[1]。
邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶的活性
超氧化物歧化酶（SOD）的活性测定——邻苯三酚自氧化法一、实验原理本实验采用邻苯三酚自氧化法测定SOD的活力。
邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出超氧阴离子O2-，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。
这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长出有强烈光吸收。
当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。
酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。
该法所用试剂和仪器比较普通，测试方便，灵敏度高，是目前应用最广泛的一种测试方法，但对温度、PH、邻苯三酚浓度、SOD待测液存放时间等诸因素比较敏感，因此测定时严格控制这些因素。
二、试剂和器材1、试剂（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用双蒸水溶解至80mL 左右，用HCl调节pH =8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。
（2）10mmol/L HCl（3）50 mmol/L邻苯三酚称取邻苯三酚(A.R)0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。
（4）SOD样液2、器材（1）恒温水浴槽（2）紫外分光光度计（3）试管、刻度吸管、微量注射器三、方法和步骤1、邻苯三酚自氧化速率的测定取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s 读数一次，测定4min 内每分钟光吸收值的变化。
改良后的邻苯三酚自氧化法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性
改良后的邻苯三酚自氧化法A.1试剂的制配A.1.1A液：pH8.200.1mol/l三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲溶液（内含1mmol/L EDTA·2Na）。
称取1.2114g Tris和37.2mg EDTA·2Na溶于62.4ml0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100ml。
A.1.2B液：4.5mmol/l邻苯三酚盐酸溶液。
称取邻苯三酚（A.R）56.7mg溶于少量10mmol/L盐酸溶液，待邻苯三酚完全溶解后，用10mmol/L盐酸溶液定容至100ml。
A.1.310mmol/l盐酸溶液。
A.1.4供试品溶液：取1ml于500ml容量瓶中，用蒸馏水定容到500ml。
即得供试液。
A.1.5蒸馏水：双重石英蒸馏水。
A.2仪器紫外-可见分光光度仪，精密酸度计（精密度0.01pH），试管数支，100μl移液枪，1000μl移液枪，10ml移液枪。
A.3方法A.3.1调零在25℃左右，取2支试管，分别依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.15ml；在325nm波长条件下，调零。
A.3.2邻苯三酚自氧化速率测定△A325在25℃，取2支试管（A管和B管），A 管中依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.00ml；B管中分别加入B液0.15ml，把A管倒入B管中，迅速摇匀，倾入比色皿，以A液2.35ml+蒸馏水2.15ml作为空白对照，在325nm波长下每隔30s记录一次A值，共测6次，要求自氧化速率控制在0.060（±0.003）OD/min。
A.3.3酶活测定在25℃，在试管中加入A液2.35ml，蒸馏水1.8ml，在25℃的水浴中预热5min,然后加入Vml的样液，再加入0.15mlB液，迅速摇匀，倾入比色皿，以A液2.35ml+蒸馏水2.15ml作为空白对照，在325nm波长下每隔30s 记录一次A值，共测6次。
在此条件下，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率50%的酶量定为1个活力单位，即△A′325=1/2△A325。
植物超氧化物歧化酶活性测量
植物超氧化物歧化酶活性测量一、实验目的及要求（1）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。
（2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。
二、实验原理超氧化物歧化酶(SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。
它可以催化超氧负离子（O-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2-+H2→O2+H2O2. 大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，糖果组合组织或者细胞破碎后，可用Ph7.8的磷酸缓冲液提取。
邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在420nm有最大吸收峰。
邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40秒-3分钟这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。
颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。
三、实验材料、仪器设备及试剂1、实验材料：大蒜2、仪器：离心机3、试剂：(1)磷酸缓冲液（pH7.8, 0.05mol/L）)(PH8.3 Tris-HCl )（2）浓盐酸(3)邻苯三酚（50mmol.L-1）：称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。
(5) 考马斯蓝G-250：100mg 考马斯蓝G250溶于50 ml 95%乙醇中，加入100ml 85%(W/V)正磷酸，用蒸馏水稀释至1L，过滤。
（6）牛血清蛋白（1mg/100ml, 即ml=1 l）四、实验方法1、材料准备：每组30g大蒜，加入90 ml pH7.8 0.05 mol/L 磷酸缓冲液，匀浆机匀浆，两层纱布过滤，冷冻离心（5000 rpm，20min）得清液测体积，取少量清液进行SOD活性测量。
2、将上清液置于60℃20min,使杂蛋白变性，然后5000r.min-1冷冻离心20min，取上清液测体积，并进行SOD活性测量。
3、SOD活性测定（邻苯三酚法）采用改良的邻苯三酚自氧化法。
邻苯三酚自氧化速率为325 nm, 0.070D /min左右,以 1 mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚的速率达到50%的酶量作为一个酶活力单位(U)。
生物抗氧化成分的测定
第八章 生物抗氧化成分的测定第一节 SOD(超氧化物歧化酶）活力和含量的测定一、SOD 活力的测定（邻苯三酚氧化法）1.原理利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O - 2，生成带色的中间产物。
反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min 。
加入SOD 酶液则抑制其氧化速度，在325nm 处测定溶液的吸光量。
酶活性单位采用1mL 反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个活力单位。
2.仪器及试剂（1）UV-260自动紫外光分光光度计（或其他型号）。
（2）pH8.2、50mmol/L Tris - HCl 缓冲液 50mL 50mmol/L Tris 加20mL 50mmol/L HCl ，用水稀释至100mL ，调pH 至8.20。
（3）50mmol/L KH 2PO 4-NaOH 缓冲液 5mL0.2mol/L KH 2PO 4-NaOH 加4.5mL0.2mol/L NaOH ，用水稀释至20mL ，调pH 至7.8。
（4）50mmol/L 邻苯三酚溶液 用10mmol/L HCl 配制。
3.测定步骤样品液制备：称取5.0g 鲜样，加10mL50mmol/L pH7.8磷酸盐缓冲液，匀浆，过滤，滤液置透析袋内，于5~7℃冰箱内动态透析6~8h （亦可每小时换透析液一次，透析液为pH7.8磷酸盐缓冲液）。
若样品为溶液，可直接加pH7.8磷酸盐缓冲液透析。
邻苯三酚自氧化速率的测定：在室温下（20~22℃），取5mL 50mmol/L pH8.2 Tris-HCl 缓冲液，加5μL 50mmol/L 邻苯三酚，摇匀，在325nm 下，1cm 比色皿，以pH8.2 Tris-HCl 缓冲液为空白，立即测定吸光度，并每隔0.5min 测定一次，自氧化速率控制在每分钟0.060~0.065（一般测定4min ，求得每分钟平均变化率）。
样品中SOD 测定：取5mL 50mmol/L pH8.2 pH8.2 Tris-HCl 缓冲液，加待测样品透析液5~20μL ，加5μL 50mmol/L 邻苯三酚，摇匀，立即同上测定。
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三、温度对邻苯三酚自氧化的影响
实验表明，温度对邻苯三酚自氧化速率的影响远比pH要小得多。特别在25一27.5℃时，其影响差别小于4%，基本上不变化。这对测定带来方便。本法测定的灵敏度与经典的黄嗓吟氧化酶法基本相同。
二、不同的邻苯三酚浓度对自氧化速率
的影响:图3和图4都表明:不同的邻苯三酚浓度对自氧化速率有影响。在一定的范围内，线性速率随邻苯三酚浓度的增加而增加，见图3，这是本法的优点之一。这样，我们就可在较大范围内选用邻苯三酚的浓度，以便更显著地观察邻苯三酚被SOD抑制的情况。根据图4的关系表明在温度和pH不变情况下，可以灵敏地检测贮存的邻苯三酚溶液的自氧化程度，以便决定要否新鲜配制。
SOD活性测定法按上述表1操作，加入邻苯三酚前，先加入一定量SOD，并减少同体积双蒸水，其它操作均与上述2.2.1相同，所测吸光度为
方法2：
一、试剂及其配制:
1.pH8.2，100mM三羟甲基氨基甲烷一二甲胂酸钠缓冲液(内含2mM二乙基三氮基五乙酸)。以加200mM三羟甲基氨甲烷-二甲胂酸钠50ml(内含4mM二乙基三氮基五乙酸)加200mN盐酸22.38ml，然后用双蒸水稀释至100ml。2.10mN盐酸3.6mM邻苯三酚，用10mN盐酸配制，4℃保存。4.实验用水均应用玻璃双蒸水
二、仪器:
721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)
操作方法
2.2方法
2.2.1邻苯三酚自氧化速率的测定
在试管中按表1加入缓冲液和双蒸水，于25℃恒温20min后加入25℃预热过的邻苯三酚(对照管用10mmol/L盐酸代替)，迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在波长325nm处每30s测定一次吸光值A0
2.2.2 SOD活力的测定
2材料与方法（1）
2.1试剂和主要仪器
一.试剂
0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2，内含2mmol/L EDTA)：0.2mol/L Tris(内含4mmol/L EDTA)100ml与0.2mol/L HCl44.76ml混合，加双蒸水至200ml，调pH8.2±0.01;邻苯三酚(45mmol/L)：以10mmol/LHCl配制成6mmol/L溶液，存放于冰箱备用;所用试剂均为国产分析纯;实验用水为自制双蒸水;
2.SOD或粗醉抽提液的活性浏定:
测定时按表2加样，测定步骤与测邻苯三酚的自氧化速率同。
酶活力单位定义:在1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为一个活力单位，即420nm0.030D/分为一个活力单位。若自氧化速率在36~65%，通常可按比例计算，不在此范围内的数值应增减样液量。
及所含的EDTA量等因性条件下,邻苯三酚迅速氧化释放出超氧化物阴离子，生成有色中间产物，吸光度随之增加，使吸光度值与反应时间呈良好的线性关系. SOD加入邻苯三酚自氧化反应体系后，催化超氧化物阴离子生成过氧化氢，使有色中间产物的生成受阻，导致吸光值下降，邻苯三酚自氧化速率降低，可作为测定SOD活性的理论依据.
邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的研究
摘要：目前超氧化物歧化酶(SOD)活性测定结果混乱，为提高测定结果的可比性,对邻苯三酚自氧化法测定SOD活
性的方法进行了研究，就该活力测定体系中缓冲溶液的介质组成、浓度、pH及所含的EDTA量等因素对测定结果的影
响进行了探讨，根据实验结果，提出了新的改良方法.
邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，而在酸性环境中却相当稳定。为了尽可能使缓冲液的pH维持恒定，要求加样量尽可能少些，因为PH变化对自氧化速率有较大的影响，见图2
实验表明:不同pH对滞后时间和线性维持时间影响不大，而对线性速率影响很大。实验还表明，降低pH要比升高pH对速率影响更大。测定时，要求将反应液pH严格控制在8.2，误差不得超过士0.01。
邻苯三酚自氧化的机理极为复杂，从实验来看，邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧
化，释放出O易一，生成带色的中间产物。反应开始后溶液先变成黄棕色，几分钟后遂转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。我们测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，在这阶段，中间物的积累在滞后30~45秒后，就与时间成线性关系，一般线性时间维持在4，~411511。中间产物在4幼nm时有强烈的光吸收，在有超氧物岐化酶存在时由于它能催化O玉一与H十结合生成O:和HZO:，从而阻止了中间产物的积累，因此通过计算就可求出SOD的活性。邻苯三酚自氧化结果见图1.
二、仪器:
721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)
操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率的测定:在试管中按表l加入缓冲液和双蒸水，25℃保温劝分钟，然后加入25℃预温的邻苯三酚(对照管用10mMHCI代替)，迅速摇匀，倒入比色杯中，在4加nm的分光光度计中，每隔半分钟测一次OD值，要求自氧化速率控制在0.060OD/分。