连苯三酚自氧化法的简易操作图解-邻苯三酚自氧化法-SOD活性测量方法
邻苯三酚法测定超氧化物歧化酶缓释片中SOD的活性
! 5 6 5 6 供试品溶液的制备 取 9.: 骨架缓释片 +’ 片， 研细， 精密称取适量 （约相当于 9.: &’’ !<） ， 置 用 0, 3(’ 磷酸盐缓冲液定容至 )’’ !# 的量瓶中， 冰水浴间断超声 2’ !56， 用 ’(1 ! )’’ !#， ! 微孔滤膜 滤过， 弃去初滤液， 取续滤液作为供试品溶液。 ! 56 5 8 辅料对含量测定的影响 按骨架缓释片的 处方比例称取辅料适量， 置 &’’ !# 量瓶中， 照 “& J 2 J 项下方法处理， 取续滤液， 于 +’’ P /’’ 6! 范围内 2” 扫描， 结果表明辅料在 2+) 6! 处无吸收， 不影响测 定。 “ & J 2 J +” 项下的对照品 ! 56 5 9 线性关系的考察 取 溶液， 用 0, 3(’ 的磷酸盐缓冲液分别稀释成 O’、 /1、 ・!# % & O 种溶液， 照 “ & J 2 J &” 项下方法 2O、 +/、 &+、 O! < 测定 9.: 的活力， 以活力值对浓度进行线性回归， 在 得到回归方程： ; = 1N&(1) # Q /(&N。结果表明： %& ・ 线性关系良好 （ $ = ’(NNNO） 。 O’ P O ! < !# 范围内， ! 5 6 5 : 方法精密度考察 取一批 9.: 骨架缓释片， 照 “&J2J2” 项下方法制得供试品溶液， 再按 “&(2(&” 项 下方法进行活力测定， 分别测定 ) 次， %&’ = +(2)? 。 ! 56 5 ; 空白加样回收实验 按 处 方 量 的 1’? 、
其中邻苯三 的顺应性。测定 ;<= 活性的方法很多， 酚法简便易行， 现用其测定缓释片中 ;<= 的活性， 可有效地控制制剂的质量。
邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性
邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的研究摘要：目前超氧化物歧化酶(SOD)活性测定结果混乱，为提高测定结果的可比性, 对邻苯三酚自氧化法测定SOD 活性的方法进行了研究，就该活力测定体系中缓冲溶液的介质组成、浓度、pH 及所含的EDTA 量等因素对测定结果的影响进行了探讨，根据实验结果，提出了新的改良方法.超氧化物歧化酶(SOD)是一种特殊的金属酶, 它能催化超氧阴离子自由基(O2—)发生歧化反应, 从而能有效清除机体内超氧阴离子自由基(O2—), 是生物体重要的细胞防御系统之一, 具有防御氧毒、抗辐射、防衰老以及防治肿瘤和抗炎等药用功效[1]，超氧化物歧化酶(SOD)这一独特的生理功能使其在医药领域具有良好的应用前景,激起了人们广泛的研究热情. 自1969 年McCord 等首次发现具有活性的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase简称SOD) 以来，众多测定SOD的方法已逐步建立起来，其中以化学法最为常用. 经典的邻苯三酚法是Marklund等[2]于1974 年发表的一种通过比色测定SOD 的简便方法. 此后，邻苯三酚法在国内外得以广泛应用. 与其他方法相比，邻苯三酚自氧化法具有操作简便，快速，试剂便宜且用量小，重复性好等优点；但文献报道的邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的测定条件各不相同，这就造成了测定结果的混乱和缺乏可比性. 为此我们对邻苯三酚自氧化法测定SOD 活性的方法进行了研究，就该测活体系中缓冲溶液的介质组成、浓度、pH及所含的EDTA 量等因素对测定结果的影响进行了探讨.1 原理在碱性条件下, 邻苯三酚迅速氧化释放出超氧化物阴离子，生成有色中间产物，吸光度随之增加，使吸光度值与反应时间呈良好的线性关系. SOD 加入邻苯三酚自氧化反应体系后，催化超氧化物阴离子生成过氧化氢，使有色中间产物的生成受阻，导致吸光值下降，邻苯三酚自氧化速率降低，可作为测定SOD 活性的理论依据.2 材料与方法（1）2.1 试剂和主要仪器一.试剂0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH8.2，内含2mmol/L EDTA)：0.2mol/L Tris(内含4mmol/L EDTA)100ml 与0.2mol/L HCl44.76ml 混合，加双蒸水至200ml，调pH8.2±0.01;邻苯三酚(45mmol/L)：以10mmol/LHCl 配制成6mmol/L 溶液，存放于冰箱备用; 所用试剂均为国产分析纯; 实验用水为自制双蒸水;二、仪器:721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)操作方法2.2 方法2.2.1 邻苯三酚自氧化速率的测定在试管中按表1加入缓冲液和双蒸水，于25℃恒温20min后加入25℃预热过的邻苯三酚(对照管用10mmol/L盐酸代替)，迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在波长325nm 处每30s 测定一次吸光值A02.2.2 SOD 活力的测定SOD 活性测定法按上述表1 操作，加入邻苯三酚前，先加入一定量SOD，并减少同体积双蒸水，其它操作均与上述2.2.1 相同，所测吸光度为方法2：一、试剂及其配制:1.pH8.2，100mM三羟甲基氨基甲烷一二甲胂酸钠缓冲液(内含2mM二乙基三氮基五乙酸)。
邻苯三酚自氧化法适于测定SOD活性吗_
中图分类号: O613. 5
文献标识码: A
根据活性部位金属离子不同, 天然存在的超氧 化物歧化酶有五种: Cu-ZnSOD、FeSOD、MnSOD、 NiSOD 和 Fe-ZnSOD, 后两种是从 链霉属菌 中发 现 的, 活 性部 位 结 构 尚未 完 全 弄 清[ 1, 2] . 前 三 种 SOD 活性部位结构已经报道[ 3～5] , Cu-ZnSO D 活性 部 位是以组氨酸( Hist idine, His) 咪唑基( Im) 为桥 的 Cu-Zn 杂双核配合物, 活性中心 Cu( Ⅱ) 由 4 个 组氨酸咪唑氮( H is-ImN ) 和 1 个 H2O 呈四方锥配 位; Zn( Ⅱ) 离子由 3 个 His-Im N 和 1 个天门冬氨 酸 ( Aspar tic acid, Asp) 羧 基 构 成 四 面 体 配 位, Zn( Ⅱ) 被认为是稳定酶结构的作用. 而 FeSOD 和 M nSOD 活性 部位 均是 由 3 个 His-ImN 、和 1 个 H2O 组成的三角双锥配位. 我们根据“结构相似, 性质相同”的原理, 设计和合成了一系列富含苯并 咪唑的配体及其配合物, 用核黄素-硝基四氮唑蓝 ( nit roblue t etr azolium, N BT ) 光照还原法[ 6] 、采样 极 谱法[ 7] 、ESR -自 旋 追踪 法 和邻 苯 三 酚自 氧 化 法[ 8] 等测定了它们的 SO D 活性. 近年, 我们用核黄 素-NBT 光照还原法测定 Cu-ZnSOD 及其模型化 合 物 活 性, Cu-ZnSOD 催 化 歧 化 速 率 常 数 为 1. 50×109 mol - 1·dm3 ·s- 1, 在文献报道值 1. 3～ 2. 0 ×109 m ol- 1 ·dm 3 · s- 1 范围内. 同 法测得 的 SOD 模 型化合物的歧化 反应速率 常数如表 1 所
SOD酶活性测定
SOD酶活测定方法（一）氮蓝四唑法1. 方法提要在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。
在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生，将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭，SOD 通过催化歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。
按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。
酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。
2. 仪器荧光灯管。
离心机。
分光光度计。
pH计。
3. 试剂（1）磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA），以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。
（2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。
4. 测定步骤（1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。
（2）酶反应酬体系液的制备：取上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液30ml，依次溶入Met，NBT，核黄素与EDTA，使它们的浓度分别为 1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L与1×10-4mol/L，放冰箱中避光保存。
（3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。
向每支试管加入25~30μL酶液。
在25~30℃下用光强4000lx的荧光灯管（可用15W荧光灯）进行光照，15~20min后，出现颜色变化。
停止光照。
在560nm波长下比色测量透光度。
SOD活性测定
SOD活性测定：SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。
阻止中间物的积累而测定其酶活性。
1、试剂及仪器(1)邻苯三酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。
(2)UV－754紫外分光光度计。
2、测定方法：(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。
在25度、45ml`50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。
(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。
0.0700－A325mm/min----------------------------------------＊100％度0.70样液稀释倍数样液稀释倍数酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------50％样液体积3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。
蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。
4、比活(u/mg蛋白)的计算：单位活力(u/ml) 总活力比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
SOD活性测定
SOD活性测定SOD活性测定：SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。
阻止中间物的积累而测定其酶活性。
1、试剂及仪器(1)邻苯三酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。
(2)UV－754紫外分光光度计。
2、测定方法：(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。
在25度、45ml`50mmol/L、PH值、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在mm 左右。
(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。
－A325mm/min----------------------------------------＊100％度样液稀释倍数样液稀释倍数酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------50％样液体积3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。
蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。
4、比活(u/mg蛋白)的计算：单位活力(u/ml) 总活力比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
连苯三酚-邻苯三酚SOD 超氧自由基清除-过氧自由基清除-过氧阴离子自由基清除-超氧阴离子自由基清除
改进的连苯三酚法：一种适用于所有抗氧化剂超氧自由基（•O2-）清除试验（适用于SOD）【名词辨析】•O2-：该微粒既含有一个成单的电子，所以，可以属于自由基，又带一个单位负电荷，也属于阴离子。
所以，可以称为“超氧自由基”、“过氧自由基”、“过氧阴离子自由基”、“过氧阴离子”、“超氧阴离子自由基”、“超氧阴离子”。
SOD：过氧化物歧化酶，使过氧自由基发生岐化反应，而清除之。
连苯三酚：有些文献也称为“邻苯三酚”。
但邻苯三酚是不准确的名称。
因为分子含有三个取代基，应当称为“连”。
【操作示意图】操作示意图[1]操作示意图的说明：最初的连苯三酚（1,2,3-三羟基苯）法是专门为超氧化物歧化酶开发的，现在广泛用于测量其他抗氧化剂的超氧化物清除。
然而，强烈的pH影响被忽略了。
在本研究中，首次系统地研究了影响因素，大量实验证明pH值至关重要。
由于主要抗氧化剂含有羧酸、酯或内酯基团，pH 8.2应改为生理pH 7.4。
改进的程序如下。
将连苯三酚溶液（在1 M HCl中）与pH 7.4的Tris-HCl溶液充分混合；在37°C下每隔30秒测量一次A325nm值，持续5分钟。
由于ΔA325nm，控制值反映基质•O2-的初始浓度−, 应妥善控制，以保证方法的准确性。
改进的连苯三酚法是一种可靠且廉价的超氧自由基清除试验，适用于所有类型的抗氧化剂。
用石英比色皿，不能用玻璃比色皿，因为玻璃比色皿在325nm处有吸收。
【详细介绍】[1]有几种方法可以测定食品的超氧阴离子交换活性，包括细胞色素还原、硝基四氮唑蓝（NBT）、电子自旋共振（ESR）、化学发光、荧光和高效液相色谱。
所有这些方法都需要特殊且昂贵的仪器或生物试剂。
连苯三酚（1,2,3-三羟基苯）自氧化法相对便宜。
它最初由Marklund 专门为超氧化物歧化酶（SOD）而设计，而不是为其他抗氧化剂而设计。
近几十年来，由于其方便性，它还被用于测定其他抗氧化剂，如多酚、酚酸、单宁、黄酮、花青素、蒽醌、多糖，甚至各种营养添加剂和提取物。
猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活力测定
实验三猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定生物化学与分子生物学刘志坚S2*******一、超氧化物歧化酶（SOD）概述SOD是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅基，因此它对热、PH以及某些理化性质表现出异常的稳定性。
SOD根据所含金属辅基不同可分为三种：第一种是铜（Cu）锌（Zn）金属辅基称（Cu/Zn-SOD）最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于肌体细胞浆中。
它为同源二聚体酶，其中一个亚基结合一个Cu原子，另一个亚基结合一个Zn原子，两个亚基间的相互作用提高了酶的催化活性和稳定性，金属原子的氧化还原完成了酶的催化功能。
第二种是含锰（Mn）金属辅基的称（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内。
Mn—SOD是由203个氨基酸残基构成的四聚体，Mn3+处于三角双锥配位环境中，其中一轴向配位为水分子，另一轴向被蛋白质辅基的配位His-28占据，另3个配位His-83、His-170和Asp-166位于赤道平面。
第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（Fe—SOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。
其活性中心是3个His，1个Asp和1个H2O扭曲四面体配位而成。
其中，Mn—SOD 、Fe—SOD的结构特征是不含半胱氨酸，含有较多的色氨酸和酪氨酸，因此紫外吸收光谱类似一般蛋白质，在280nm附近有最大吸收峰，Mn—SOD的可见光谱在475nm处附近有最大吸收，Fe—SOD在350nm处有最大吸收，这都反映了所含金属离子的光学性质。
SOD为自由基清除剂，它广泛存在于生物体的各种组织中，能清除O2-（超氧阴离子）自由基，而超氧阴离子自由基具有细胞毒性，可使脂质过氧化，损伤细胞膜，引起炎症，肿瘤和自身免疫性疾病，并可能促使机体衰老。
它的功能为：（1）抑制心脑血管疾病：机体的衰老与体内氧自由基的产生与积累密切相关，SOD课清除人体内过多的有害的氧自由基，是对健康的有益的功效成分。
SOD测定方法
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD）的测定方法2009年12月08日 16:17法适用于以各类鲜活的动植物组织器官及初加工品（如生鱼片、动物血等初加工肉制品）、乳制品、各类水果蔬菜、果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的测定。
超氧化物歧化酶是催化以下反应的金属酶，测酶活方法很多，本文介绍氮蓝四唑法与连苯三酚自氧化法。
（一）氮蓝四唑法1. 方法提要在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。
在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生，将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭，SOD通过催化歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。
按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。
酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。
2. 仪器荧光灯管。
离心机。
分光光度计。
pH计。
3. 试剂（1）磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA），以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。
（2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。
4. 测定步骤（1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。
（2）酶反应酬体系液的制备：取上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液30ml，依次溶入Met，NBT，核黄素与EDTA，使它们的浓度分别为1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L与1×10-4mol/L，放冰箱中避光保存。
（3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。
NBT光还原法_邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性的比较_简报_
河北职业技术师范学院学报 第14卷第2期,2000年6月Journal of Hebei Vocation2Technical Teachers College Vol.14 No.2 J une2000NB T光还原法、邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性的比较(简报)张文军1,葛 超2(1河北职业技术师范学院教务处,昌黎,066600;2河北职业技术师范学院食品工程系)关键词:SOD;酶活性测定方法;NB T光还原法;邻苯三酚自氧化法中图分类号:Q554+16 文献标识码:A 文章编号:1008-9519(2000)02-0068-03超氧化物歧化酶(SOD)是催化O-2歧化反应的酶类,它催化的反应是O-2+O-2+2H+H2O+ O2。
由于O-2是一种极不稳定的氧自由基,因此,检验SOD活性一直采用间接的方法。
笔者针对目前较普遍采用的邻苯三酚自氧化法和NB T光还原法,从灵敏度、精确度、反应特异性三个方面对两方法进行比较,以确定提纯过程中非纯品SOD及纯品SOD两种材料酶活测定的适用方法。
1 材料与方法111 材料纯品牛红细胞SOD、玉米SOD粗提液(自制)、超滤液(超滤膜MW=4000)、透析液(体积分数为014～019的硫铵分步沉淀后)。
本实验所用药品牛红细胞SOD为电泳纯、核黄素(上海化学试剂采购站供应,进口分装),Met(甲硫氨酸)、邻苯三酚为国产分析纯。
112 方法11211 NB T光还原法 根据Stewart和Bewley报导[1],在3mL反应液中含有13×10-3mol甲硫氨酸;75×10-5mol NB T;2×10-6mol核黄素;100×10-9mol ED TA;50×10-3mol磷酸缓冲液(p H 718),在4000lx光下照射15min后,NB T光化还原产物蓝色甲月替在560nm有最大吸收,在此条件下,反应被抑制50%所需酶量为1个活力单位。
邻苯三酚法测定3种食用菌超氧化物歧化酶_SOD_活性_张中林
185第11卷 第5期 2009 年 5 月辽宁中医药大学学报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 11 No. 5 May，2009邻苯三酚法测定3种食用菌超氧化物歧化酶（SOD）活性张中林1，孙宏伟2，郑剑玲1，李 岩1，王美惠1，段 薇1（1.辽宁中医药大学职业技术学院，辽宁 沈阳 110101；2.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032）摘 要：目的：比较3种食用菌中超氧化物歧化酶（SOD）活性。
方法：选取辽宁省农科院食用真菌研究所提供的3种鲜菌菇，采用邻苯三酚法对食用菌进行SOD 活性的测定。
结果：3种食用菌中SOD 酶活性均为阳性。
结论：3种食用菌SOD 酶活性依次递增顺序为鲜金针菇、滑子菇、草菇。
关键词：超氧化物歧化酶；邻苯三酚；食用菌中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1673-842X (2009)05- 0185- 02Determination of the Superoxide Dismutase in Three Typesof Edible Fungi by Hepatocyes Autoxidation ZHANG Zhong-lin 1, SUN Hong-wei 2，ZHENG Jian-ling 1, LI Yan 1，WANG Mei-hui 1，DUAN Wei 1（1.Vocational and Technical Education College of Liaoning University of TraditionalChinese Medicine ,Shenyang 110101, Liaoning,China；2. Liaoning University ofTraditional Chinese Medicine，Shenyang 110032, Liaoning, China）Abstract：Objective :To compare the superoxide dismutase （SOD ）activities of the three types of edible fungi. Methods : Fresh edible fungi were chosen from edible fungi institute liaoning academy of agricutural sciences. The SOD activities were determined by hepatocytes autoxidation. Results : It was showed that SOD activities were fond in three types of edible fungi. Conclusion : The SOD activities increases by a golden needle mushroom, pear mushroom, straw mushroom.Key words：SOD; Hepatocytes Autoxidation ; Edible Fungi 收稿日期：2008-12-02作者简介：张中林 (1963-) ，女，辽宁沈阳人，实验师，学士，主要从事免疫生化工作。
邻苯三酚自氧化法测定SOD活性中测定波长的选择
3经验交流3邻苯三酚自氧化法测定SOD活性中测定波长的选择孙雪奇,陈齐英,别小琳(四川省药品检验所,四川成都610034)提要:用岛津UV-240型、260型和T-1901紫外可见分光光度计进行实验,确定邻苯三酚自氧化法测定S OD活性的最适波长非文献使用的420nm和325nm,而应为320nm。
关键词:邻苯三酚自氧化法;S OD活性;波长中图分类号:R917文献标识码:B文章编号:1006-0103(2004)05-0404-02 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,S OD)为体内自由基的清除剂,在生物体的正常代谢中起重要作用,其活性测定常用邻苯三酚自氧化法[1]。
该方法主要是通过测定邻苯三酚自氧化前4min内, S OD对自氧化初始中间产物增加的抑制作用来测定S OD活性。
文献报道的测定波长主要有420nm[1]和325nm[2]。
为探讨初始中间产物的吸收峰位置,进而确定测定波长,特对此进行了研究。
1 实验部分111 仪器与试剂 UV-260和UV-240紫外可见分光光度计(日本岛津公司);T-1901紫外可见分光光度计(上海科学仪器厂)。
试剂均为国产分析纯。
112 方法 吸取4.5ml100mm ol・L-1的T ris-HCl缓冲液(pH812)和4146ml蒸馏水,混匀后置25℃水浴中20min,立即加入在25℃预热的30mm ol・L-1邻苯三酚40μl(10mm ol・L-1的HCl溶液配制),立即混匀,迅速倒入比色池中,以10mm ol・L-1的HCl溶液为空白,分别用上述3种型号的紫外可见分光光度计测定邻苯三酚自氧化中间产物的吸光度。
113 结果 UV-240紫外可见分光光度计测定可知,邻苯三酚自氧化初始中间产物的吸收峰在320～319nm 处。
T-1901和UV-260紫外可见分光光度计两种仪器测得的λmax均出现在320nm波长处,此时在420nm处吸光度还很小,到5min时吸光度<011,可见420nm处吸光度的变化不能反映中间产物的积累,因此,用420nm进行S OD酶活性测定是不正确的。
猪血中超氧化物歧化酶SOD分离纯化及活力测定
实验二猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定一、原理超氧化物岐化酶SOD广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。
????? SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。
根据金属辅基的不同，它可以分为四类，分别为Mn-SOD、Cu-Zn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD，其中最常见CuZn-SOD，主要存在于真核细胞的细胞质中。
CuZn-S0D 酶蛋白的分子量约为3.2×104，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体，每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。
SOD作为机体内最重要的抗氧化酶体之一，可以直接清除过量的超氧自由基，阻止机体的过氧化，对机体有较高的防护作用及保健价值。
?本实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定。
酶活性单位定义为:在1ml 的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个活力单位。
二、试剂与器材1、试剂：ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐溶液、3mmol/L 邻苯三酚溶液等。
2、器材：752分光光度计、分析天平、具塞试管、刻度吸管、离心机、烧杯、电泳装置、微量进样器、注射器等。
三、操作步骤1.SOD提取?取新鲜猪血20ml，加入到檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为0.15：1，轻轻搅拌均匀，4000r/min离心10min，收集红血球。
然后用2倍体积生理盐水洗涤，4000r/min离心10min，弃上清液；重复2次，得洗净的血红球浓稠液。
?然后向洗净的红血球加入等倍体积去蒸馏水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，4000r/min离心10min，除去变性蛋白沉淀，取清液0.5mL。
抗氧化性的测定‘
1.邻苯三酚自氧化法参考张强和汪建斌例发表的文献。
其主要原理是：邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化释放出02-，生成带色的中间产物。
反应开始后，反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿色，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。
邻苯三酚自氧化过程的初始阶段，中间物的积累在滞留30s-55s后，与时间成线性关系，一般线性关系维持在4min的范围内。
经实验证明，中间物在320nm波长处有强烈光吸收。
当有类似超氧化物歧化酶的抗氧化活性物质存在时，能催化02-与H+结合生成02和H202，从而阻止了中间产物的积累。
因此，通过计算就可求出抗氧化活性。
试剂的配制(1)Tris-HCl-EDTA缓冲液：Tris 1.2114g，EDTA 116.9mg，加80mL双蒸水，用0．2mol／L HCl调pH=8．2士O．1，最后用双蒸水定容到100mL。
(2)lOmmol／L的HCl：用0．1mol／L的标准HCl配制成lOmmol／L的HCl。
(3)10mmol／L的邻苯三酚(PR)：取31．5275mgPR用10mmol／L的HCl溶解定容到25mL。
测定方法：按表2．2所示在试管中加入Tris-HCl缓冲液和超纯水，并将邻苯三酚一起在25℃下水浴孵育10min后，将邻苯三酚加入试管迅速摇匀并倾入比色杯中，0.5min后在320nm波长扫描4min，求出邻苯三酚自氧化速率(0.6A／min)，用抗氧化肽替换超纯水测定抗氧化肽的超氧阴离子淬灭能力。
2 油脂POV值的测定采用传统的碘量法。
具体做法是：吸取2．5 ml油脂(精确称其质量)于碘瓶中，加30 ml氯仿一冰乙酸(2：3)混合液溶解样品，加1．00 ml饱和KI溶液，立即加塞摇匀，放置暗处5min，然后取出样品，加水100 ml，加1％淀粉指示剂1 ml(后期可增至1．5 rnl)，以0．002 mol／L硫代硫酸钠标准溶液滴定，至无色为终点。
以试剂空白消耗的硫代硫酸钠为参比，按下式计算POV值：POV(%)=126.9*C*(V1-V2)*100/(1000*m)式中：V1一样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积(m1)；V2一试剂空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积(m1)，实际测得为0.00mLC一硫代硫酸钠标准溶液的浓度(mol／L)，实际为0．002 mol／L；m一样品质量(g)；126．9一碘的摩尔质量(g/mo1)。
实验二 超氧化物歧化酶的活性测定
方法和步骤
试剂 空白管（mL） 2.98 0.02 样品管（mL） 2.98 0.01 0.01
pH8.2、50mmol/L Tris-HCl
10mmol/L HCl SOD样液 50 mmol/L邻苯三酚
方法和步骤
（3）计算
0.070 样液速率 100 % 样液稀释倍数 0.070 酶活性（ U / mL ） 反应液总体积 50% 样液体积
（2）10mmol/L HCl （3）50 mmol/L邻苯三酚
称取邻苯三酚0.063g，用10mmolOD样液
试剂和器材
1、试剂 （1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl
称取Tris 0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用双蒸水溶解至80mL左右， 用HCl调节pH =8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。
酶工程实验二
超氧化物歧化酶的活性测定
实验背景
按金属辅基成分的不同可分成3种类型 ：
铜锌金属辅基(CuZn-SOD) 蓝绿色
存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内 以及线粒体膜间隙
锰离子(Mn-SOD)
粉红色
存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，以及植物的叶绿体基质和 类囊体膜上
Fe-S0D
（2）10mmol/L HCl （3）50 mmol/L邻苯三酚
称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL， 避光保存。
（4）SOD样液
试剂和器材
2、器材 （1）恒温水浴槽 （2）紫外分光光度计 （3）试管、刻度吸管、微量注射器
方法和步骤
1、邻苯三酚自氧化速率的测定 取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加 入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯 三酚 ），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波 长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分 钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光 吸收值为0.07（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收 值）。
改良后的邻苯三酚自氧化法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性
改良后的邻苯三酚自氧化法A.1试剂的制配A.1.1A液：pH8.200.1mol/l三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲溶液（内含1mmol/L EDTA·2Na）。
称取1.2114g Tris和37.2mg EDTA·2Na溶于62.4ml0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100ml。
A.1.2B液：4.5mmol/l邻苯三酚盐酸溶液。
称取邻苯三酚（A.R）56.7mg溶于少量10mmol/L盐酸溶液，待邻苯三酚完全溶解后，用10mmol/L盐酸溶液定容至100ml。
A.1.310mmol/l盐酸溶液。
A.1.4供试品溶液：取1ml于500ml容量瓶中，用蒸馏水定容到500ml。
即得供试液。
A.1.5蒸馏水：双重石英蒸馏水。
A.2仪器紫外-可见分光光度仪，精密酸度计（精密度0.01pH），试管数支，100μl移液枪，1000μl移液枪，10ml移液枪。
A.3方法A.3.1调零在25℃左右，取2支试管，分别依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.15ml；在325nm波长条件下，调零。
A.3.2邻苯三酚自氧化速率测定△A325在25℃，取2支试管（A管和B管），A 管中依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.00ml；B管中分别加入B液0.15ml，把A管倒入B管中，迅速摇匀，倾入比色皿，以A液2.35ml+蒸馏水2.15ml作为空白对照，在325nm波长下每隔30s记录一次A值，共测6次，要求自氧化速率控制在0.060（±0.003）OD/min。
A.3.3酶活测定在25℃，在试管中加入A液2.35ml，蒸馏水1.8ml，在25℃的水浴中预热5min,然后加入Vml的样液，再加入0.15mlB液，迅速摇匀，倾入比色皿，以A液2.35ml+蒸馏水2.15ml作为空白对照，在325nm波长下每隔30s 记录一次A值，共测6次。
在此条件下，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率50%的酶量定为1个活力单位，即△A′325=1/2△A325。
邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的电化学研究
和一 ．４ （Ｃ １４ Ｖ Ｓ Ｅ）有 两 个 还 原 波 ，本 文建 立 邻 苯 三
酚 自氧化法测定 Ｓ Ｄ活性 的 电化 学方 法 ，并 研究 黄 Ｏ
０９ Ｖ 一１４ Ｖ处 极 谱 峰 高 随 时 间 的 变 化 ，即 ．６ 和 ．４
酮类化合物对邻苯三酚 自氧化产生的 Ｏ 的清除作
用 。此 方法 所 用 仪 器 便 宜 ，操 作 简 便 ，试 剂 易 得 ， 对 于抗 氧化剂 的筛选 具有一定 的应 用价值 。
和一．４ １４ Ｖ处 极谱 峰 高 随 时 间 的变 化 ，即每 隔 １ ｉ ｍｎ
读取 峰 电流一 次 。
１２ ２ Ｓ Ｄ活 性 测定 ． ． Ｏ
采 用 １２ １的方 法 ，在 加 ．．
人邻 苯三 酚 之 前 ，先 加 人 一 定 量 的 Ｓ Ｄ，使 总 体 Ｏ
积 为 １ ｍＬ ０ ，迅 速 混 匀 后 ，倒 人 电 解 池 中 ，记 录
１ ２ １ 邻苯 三 酚 的 自氧化 ．．
取 ５ ０ １０ ｏ Ｌ ．ｍＬ０ ｍｍ ｌ ／
Ｔｉ Ｈ Ｉ 冲溶 液 ，０４ ．５ ｏ Ｌ的 Ｅ Ｔ ｒ— Ｃ 缓 ｓ ． Ｌ０ ０ ｍ ｌ ／ Ｄ Ａ，加 人一 定 量 的二 次 蒸 馏 水 ，在 ２ ℃ 恒 温 槽 中 恒 温 ５ ２ ｍｉ，加 人 一 定 体 积 的 邻 苯 三 酚 ，使 总 体 积 为 ５ ｎ
一
黄酮类 化合 物均 购 自北 京 生化 试剂 公 司 ；黄酮类 化
合物 在 测 定 前 用 ０ １ ｌＬ Ｎ Ｈ Ｏ ． ｍｏ ａ Ｃ 溶 解 ，其 他 试 ／ 剂 均为 分析纯 ，试 验用 水 为二次 亚沸 石英 蒸馏 水 。
１ ２ 实验 方法 ．
１ ４ Ｖ处 的 峰与溶 液 中 的溶 解 氧有关 。 ．４
植物sod测定方法
植物sod测定方法一、植物SOD测定的重要性。
1.1 植物的健康指标。
植物SOD（超氧化物歧化酶）就像是植物体内的小卫士。
它的含量和活性对植物健康有着至关重要的意义。
如果把植物比作一个小王国，那SOD就是守护这个王国免受自由基侵害的英勇战士。
自由基就像一群小坏蛋，到处搞破坏，而SOD能把这些自由基转化为无害的物质，让植物茁壮成长。
1.2 研究植物生理的关键。
在植物生理学的研究领域里，SOD测定那可是相当重要的一环。
就好比我们要了解一个人的身体状况，得先看看他身体里的免疫系统强不强一样。
对于植物来说，SOD 的情况就是了解其生理状态的一个关键窗口。
通过测定SOD，我们可以知道植物在不同环境下的适应能力，是被干旱折磨得奄奄一息，还是在肥沃土壤里生机勃勃。
二、常见的植物SOD测定方法。
2.1 邻苯三酚自氧化法。
这种方法有点像一场化学魔术。
邻苯三酚在一定条件下会自氧化，产生超氧阴离子自由基，这就像是魔法里召唤出了小恶魔。
而SOD呢，它能抑制这个自氧化的过程，就像正义的魔法师出手阻止恶魔作恶。
我们通过测量不同反应体系中邻苯三酚自氧化的速率，就能算出SOD的活性。
这就好比看魔法师出手的速度和力度，来判断他的魔法能力有多强。
不过呢，这个方法也有点小脾气，对实验条件要求比较严格，就像娇贵的大小姐，稍有不慎就可能得出不准确的结果。
2.2 氮蓝四唑法。
氮蓝四唑法也是个挺常用的办法。
在这个方法里，SOD就像是个神秘的画家。
在有光的情况下，植物的叶绿体或者其他相关物质会产生超氧阴离子自由基，这个自由基会和氮蓝四唑发生反应，让溶液变色，就像画布被涂上了颜色。
而SOD会阻止这个变色的过程，我们根据溶液颜色变化的程度就能确定SOD的活性。
这就好比看画家阻止画布被乱涂乱画的能力，来判断他的绘画功力。
这个方法相对来说比较稳定，就像老实可靠的老黄牛，虽然可能没有那么多花哨的地方，但能稳稳地给出结果。
2.3 化学发光法。
化学发光法那可有点高大上了。
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连苯三酚自氧化法测定·O2-自由基的清除能力简介（适用于：SOD及各种抗氧化剂）
文献来源
[1] Xican Li. Improved Pyrogallol Autoxidation Method: A Reliable and Cheap Superoxide-scavenging Assay Suitable for All Antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60:6418-6424.
操作图解
具体方法
1 溶液配制
1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。
1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。
1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）
40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。
用pH
计测量，pH应为7.4。
用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。
（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。
1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）
取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。
再往里加连苯三酚14.6 mg (M。
W.126.1 )，即得。
（当天有效,以上为1个样品的用量）。
2 测试液
2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。
（空白参比：Tris-HCl缓冲液）
ΔA＝A325nm,300s- A325nm,30s。
由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。
此时的ΔA为ΔA0。
3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。
（空白参比：Tris-HCl缓冲液）
ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。
此时的ΔA为ΔA样。
3 计算公式
清除率＝(ΔA0-ΔA样)/ΔA0 *100
4 注意事项
由于连苯三酚自氧化反应对温度和pH值很敏感，而pH值又受温度的波动而变化。
因此，实验过程中，要严格控制温度。
缓冲液宜多，比色皿用3.5mL规格。
这样数据才比较稳定。
5 实验结果（以原儿茶酸为例）
采用文献[1]的改进方法，测原儿茶酸的·O2-自由基的清除能力，结果如图2（pH7.4）。
用旧方法，在pH8.2时测量，结果有很大误差，是不可取的。
图2 原儿茶酸的·O2-自由基的清除能力的对比（pH7.4 vs pH8.2）
致谢：本文由广州中医药大学李熙灿教授依据其发表的论文[1]，整理而成。