视觉通路-分子

简要介绍
本实验采用神经标记和免疫组化技术相结 合的方法,对不同光照对母鸡离顶盖通路c-f os 基因表达的影响进行了观察研究。
将120 日龄母鸡右眼遮光5 d 后向丘脑圆核 引入微量30%H RP, 48 h 后解除遮光并给予不 同强度的光照刺激1~ 1.5 h, 暗适应1.5 h 后灌流 固定,取脑制作连续冰冻切片, 用TMB 法检测离 顶盖通路H RP 逆行标记神经细胞, 通过Fos 蛋 白免疫组化方法检测c- f os 基因在这些部位的 表达。
视网膜中视神经细胞 研究的概述
摘选论文： 1.不同强度光照对母鸡离顶盖通路c-fos基 因表达的影响 2.c-fos基因表达的相关机制和意义 3.视网膜中的自主感光神经节细胞
主要内容
前人研究
关于c-fos基因
关于视网膜感 光细胞综述
离顶盖 通路
一、前人研究
参考文献： 胥佳利师姐 等人的关于 不同光照条 件对母鸡离 顶盖通路cfos基因表达 的影响
视顶盖分层构造
禽类的视觉系统主要分为2 个平行通路: 离顶盖通路和离丘脑通路, 对于包含鸡在 内的眼球侧置的单眼视觉的大多数鸟类 来说, 视顶盖接受90% 对侧神经的投射, 是非常重要的视觉中枢 。视顶盖具有明 显的由细胞和纤维相间排列构成的分层 构造。
从其浅表到深部可区分为分为5 层，分别 为：视神经层( Stratum opt icum, SO) 、 表面灰质纤维层( St ratum griseum et f ibrosum superf iciale, SGFS, 又分为A - J 层10 个亚层) 、中央灰质层( St ratumg riseum centrale, SGC) 、中央白质层( St ratum albumcentrale, SAC ) 和室周灰质层( St ratum griseumperiventriculare, SGP)。
SGC：中 央灰质层
光照对母鸡产蛋性能有 较显著影响,探讨光信息 对鸡生产性能的影响及 作用机理,对养鸡业科学 利用光照提高鸡的生产 性能有重要意义。
本研究利用神经通路追踪法的HRP逆行 标记技术,由丘脑圆核注入微量30%HRP 标记离顶盖通路,用c-fos法检测该通路对 不同光照刺激的反应,为进一步探究光照
前人研究
目的及意义
简要介绍
视顶盖分层分层
实验过程
结果分析
我的总结
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1.目的及意义
c-fos基因是即早基因家族最重要成员之一,普遍 存在于中枢神经细胞,正常情况下表达水平很低 且难以检测,但在多种刺激因素下可诱导该基因 迅速的一过性表达。因此,c-fos基因的表达产物 可作为中枢神经系统活动的标志物,并可据此描 绘出一个参与该信息传递过程的中枢通路,获得 脑部相应部位功能活动数据。
2. 光照刺激 试验组：右眼眼罩移至左眼, 右下眼睑保 持睁开状态, 光照刺激1~ 1.5 h。 对照组： 维持右眼遮光。
3. 取材 麻醉，灌流，取左脑
4. 切片 冰冻切片
5. HRP 组织化学显色 TMB 呈色显示 HRP 标记神经细胞, 部分中性红轻度复染 以显示脑部组织构造。
6. FOS 蛋白免疫组化检测 兔抗鼠C-FOS 为第一抗体进行孵育, 采用链霉卵白素-过 氧化物酶连接法(SP法）进行免疫组化染 色, DAB显色, 部分用Unna 氏多色性美兰 染液轻度复染。
有研究证明, 视顶盖的视觉传出神经主要 从SGC 层投到同侧和对侧丘脑的圆核 ( Nucleusrotundus, Rt) , 且SGC 不同亚层 的细胞投射向圆核的不同部位, 圆核投射 到同侧的外纹体( Ectost riatum)。
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ECT：外 纹体
RT：圆核 SP：顶盖 前下核
IPS：顶盖 前间下核
注：即早基因家族为细胞受刺激或激活后立即 转录的基因，一般15-30min，如T细胞激活中 参与信号转导的原癌基因c-fos和转录因子基因 NF-AT等。
鸟类的90%视网膜节细胞的投射由中脑视 顶盖接受,是非常重要的视觉中枢;从视顶 盖中央灰质层经丘脑圆核到大脑外纹体
组成的离顶盖通路是鸟类最重要的视觉 通路,但目前未见有关家禽脑部重要视觉 通路对不同光照刺激引起的c-fos基因表 达的报道,鸡脑离顶盖视觉通路对不同强 度光刺激的反应有待于进一步研究。
光照对母鸡产蛋性能有较显著影响,进一
步探讨光信息对鸡生产性能的影响及作 用机理,对养鸡业科学利用光照提高鸡的
生产性能有重要意义。本研究利用神经 通路追踪法的HRP逆行标记技术,由丘脑 圆核注入微量30%HRP标记离顶盖通路, 用c-fos法检测该通路对不同光照刺激的 反应,为进一步探究光照对母鸡生产性能 影响的神经调节机制打下基础。
结果显示, 母鸡离顶盖通路各核团对不同 强度的光刺激有不同的反应, SGC 层和 ROT 核对30 lx 光照最为敏感, 而SP/ IPS 核对40 lx 光照反应较为明显。
注：1.HRP，辣根过氧化物酶 (horse radish peroxidase，简称HRP)
2.TMB, 3,3',5,5'-四甲基联苯胺,为一 种色原试剂
阴性对照: 用0 01 mo l/ L PBS ( pH 7 3) 替 代一抗, 进行上述试验。
7. 结果分析 略
结果与分析
2. 1 TMB 法显示的HRP 逆行标记神经细 胞从ROT 注入HRP 后, 经T MB 呈色反应 法显示的HRP 逆行标记神经细胞呈圆形 、椭圆形或多角形, 其阳性细胞主要分布 在左侧中脑视顶盖SGC 层。其中注射部 位与标记细胞的出现位置有一定对应关 系。
对母鸡生产性能影响的神经调节机制打 下基础。
实验过程
材料与方法 1材料 1.1 动物 120日龄健康雌性白来航鸡 1.2 主要试剂 HRP，TMB，兔抗鼠C-FOS，
SP免疫组化试剂盒
1.2方法
HRP的引入
光照刺激
图像分析
结果观察
取材
FOS蛋白 检测
冰冻切片 的制作
显色
1. HRP的引入 用速眠新将动物麻醉后固定于脑立体定 位仪上,向母鸡左侧丘脑圆核缓慢注入0.5 µL30%HRP,维持右眼遮光状态48h。