琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳三

34~43 修饰的低熔点/ 25~35 凝点琼脂糖 35 8~15 超低熔点 25~30 低黏性低熔点琼 38 脂糖 30
85~95 63~65 65 40~45 70 85 75
不同厂家 生产的不 同商品其 凝结温度 和熔化温 度有一定 差异
不同类型琼脂糖分离DNA片段ห้องสมุดไป่ตู้范围
浓度 （%）
0.3 0.5 0.8 1.0 1.2 1.5 2.0 3.0 4.0 6.0
第四节 核酸的凝胶电泳 Nucleic Acid Gel Electrophoresis
Content of Table
前 言 一、 琼脂糖凝胶电泳 二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳 三、 脉冲场凝胶电泳
前 言
核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，
用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段；
优点：（1）便于分离;（2）便于检测; （3）便于回收：
7
电泳缓冲液
常用的有TAE、TPE及TBE
TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较
都是常用电泳缓冲液。三者相比： 1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝 胶的阳极一侧将发生酸性化； 2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；
3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；
标 准 (kb)
1~50 0.7~25 0.5~15 0.25~12 0.15~6 0.08~4
高强度 (kb)
低熔点 (kb)
低黏度低 溶点(kb)
0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3
0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3 0.05~1 0.5~1 0.1~0.5 0.01~0.1
2 非变性聚丙烯酰胺凝胶
用于双链DNA片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。
用途：制备高纯度的DNA片段。
（三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围
丙烯酰胺浓度 有效分离范围 （%） （bp） 二甲苯氰FF 溴酚蓝
溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其 负电荷减少、刚性和长度增加。
5
所用的电压
低电压时DNA片段迁移率与所用 的电压成正比。
6
琼脂糖种类
常见的有两种：标准琼脂糖和低 熔点琼脂糖；
不同类型琼脂糖的性质
琼脂糖类型 凝结温度/℃ 35~38 40~42 熔化温度/ ℃ 90~95 85~90
标准琼脂糖 高强度琼脂糖
4℃
IV
4℃
（三）琼脂糖凝胶中DNA的检测
通过染色, 紫外灯下检测。 主要有溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色法和SYBR Gold染色法。
1 凝胶的EB染色
使用EB染色注意事项
（1）EB被认为是一种强致癌物质
（2）EB可用来检测单链或双链核酸
（3）EB使用时的配制、贮存及使用
4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE， 对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE 中的电泳分辨率要好于TBE。
（二） 凝胶载样缓冲液
载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待 电泳的样品相混合的一种缓冲液。 载样缓冲液有三个作用：
1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内； 2）使样品带有颜色便于简化上样过程； 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速 率向阳极迁移。
EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，
于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶 中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。
（4）当要知道DNA片段准确大小时，
凝胶应在无EB情况下电泳，电泳 结束后再用EB染色。
2 凝胶SYBR Gold的染色
SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商
品名称。其与DNA结合的亲和力高，并
核酸凝胶电泳的基本原理
1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状 态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正 电极方向迁移；
2）由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质， 电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。 而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数；
因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下、可在凝胶 上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的 核酸分子。
PAGE
（一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质
在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原 产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯 基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。
在双功能交联剂如N，N`-亚甲双丙烯酰胺的 参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成 三维带状网格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功 能交联剂的浓度。
6×凝胶载样缓冲液
类型 I 6 ×缓冲液 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰FF 4℃ 贮存温度
40% (m/V)蔗糖水溶液
0.25%溴酚蓝 II 0.25%二甲苯氰FF 15% Ficoll(Type400)水溶液 0.25%溴酚蓝 室温
III
0.25%二甲苯氰FF
30%甘油水溶液 0.25%溴酚蓝 40% (m/V)蔗糖水溶液
且结合后，能够极大增强荧光信号。
（四） 凝胶中DNA的成像
可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成
像，图像可以直接输出到计算机观察。
（五） 凝胶中DNA的回收
现一般采用试剂盒回收：
存在的主要问题：
1 2 不能有效的回收大片段DNA 不能有效回收少量DNA
Home
二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳
polyacrylamide gel electrophoresis
Home
一、 琼脂糖凝胶电泳
Agarose gel electrophoresis
（一）凝胶的制备及电泳
（二）DNA的迁移速率决定因素
1
DNA分子的大小
双链DNA分子迁移的速率与其碱基 对数的常用对数近似成反比； 2 琼脂糖浓度
浓度越低，相同核酸分子迁移越快；
3
DNA的构象
一般同一分子：超螺旋环状＞线状 ＞切口环状。 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭
CH2=CH-C(O)-NH2
(丙烯酰胺）
CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N`-亚甲双丙烯酰胺）
（二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类
1 变性聚丙烯酰胺凝胶
用于单链DNA片段的分离或纯化。
变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其 碱基组成及序列完全无关。 用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。