6发酵工业的种子制备(精)
发酵工艺 第2章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术
微生物菌种保藏机构名称和缩写
中国 缩写
ACCC
SH IA CCGMC AS-IV
CAF
IFFI
ID IV CIVBP
名称 中国农业微生物菌种保藏管理中 心 上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中 心 轻工业部食品发酵工业科学研究 所 中国医学科学院皮肤病研究所 中国医学科学院病毒研究所 中国兽医药品监察所
最常用的工业微生物
放线菌
– 链霉菌属 – 小单孢菌属 – 地中海诺卡氏菌 – 米苏里游动放线菌
藻类
藻类包括数种不同类以光 合作用产生能量的生物。 它们一般被认为是简单的 植物，并且一些藻类与比 较高等的植物有关。虽然 其它藻类看似从蓝绿藻得 到光合作用的能力，但是 在演化上有独立的分支。 所有藻类缺乏真的根、茎、 叶和其它可在高等植物上 发现的组织构造。藻类与 细菌和原生动物不同之处， 是藻类产生能量的方式为 光合自营性 ；琼脂（棕 藻）
国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心 2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部 3、CSH：美国冷泉港研究所 4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所 5、IFO：日本发酵研究所（大阪） 6、NCTC：英国国立标准菌种收藏所 7、CBS：荷兰真菌中心保藏所
三、生产中常用菌种的分离、选 育（screening ）
（一）微生物菌种的分离 四步骤： 样品采集 增值培养 纯种分离 生产性能的测定
1.施加选择压力分离法
施加选择性压力分离法
主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营 养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、 氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微 生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到 使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的。如 可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物 分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生 物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在 分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加 选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗 生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。
发酵工程第五章
发酵工程
3.一级种子培养 培养基：水解糖2.5%，尿素0.5%，玉米 浆 2.5%，K2HPO4 0.1%, ph7.0
培养条件：在种子罐中培养, 32℃培养7-10个小时
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
发酵工程
最终发酵 培养基成分：水解糖2.5%；尿素0.5%，玉米
对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶 段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌 体。
如： 谷氨酸的种子培养。
发酵工程
b.对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的孢子 在固体培养基上产生大量孢子
获得一定数量和质量的菌丝体 在液体培养基中生产大量菌丝
发酵工程
2.2培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对 孢子培养基应该是有利于孢子的生长。
发酵工程
根据文献记载，多数微生物，如病毒、 细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等 都能冻干保藏。许多菌种用此法可保 藏10年以上。
发酵工程
5. 液氮超低温保藏法
几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液 氮超低温保藏。只有少量对低温损伤敏感 的微生物例外。
发酵工程
液氮超低温保藏过程是将菌种悬浮液封存 于圆底安瓿管或塑料的液氮保藏管(材料应 能耐受较大温差骤然变化)内，放到-150～ -196℃的液氮罐或液氮冰箱内保藏。操作 过程中一大原则是“慢冻快融”。
发酵工程
为了减轻冷冻损伤程度，可采用保护剂。 如甘油和二甲亚砜。
发酵工程
注意：
液氮冷冻保藏管应严格密封。若有液氮渗 入管内，在从液氮容器中取出时，管中液 氮的体积将膨胀680倍，具很强的爆炸力， 必须特别小心。
工业发酵的工艺流程
菌种选育的必要性和重要性
必要性： • 1、经诱变剂处理的细胞中只有一部分是突变型菌
株，而有害突变往往占有很大比例； • 2、从自然界筛选得来的菌株，药物代谢合成能力
均很低，野生型菌株由于长时间生长在非最适条 件下，产物浓度很低，对于工业生产来说，如果 不进行菌种改良，势必造成生产成本过高。
重要性：
发酵方式
• 1、分批(间歇)发酵：物料一次投入反应器中，灭 菌、接种、发酵。 特点：一次性；发酵过程中，营养不断减少，微生 物不断增殖，环境非稳态；微生物生长的四个时 期明显； 应用广泛，改善（在线检测，计算机控制）。
• 2、补料分批发酵 ：补加新鲜培养基。 特点：可以解除底物抑制、产物抑制或克服微生物 过度生长；提高有用产物的转化率； 应用广泛，用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业；
• 效率低、进展缓慢。
• 2、诱变育种：是用不同的诱变剂（mutagen）处 理微生物的细胞群体，以诱发各种遗传突变，然后 采用简便、快速和高效的筛选方法，从中选出所需 要的突变株（mutant）。发酵工业中使用的高产 菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性 能的菌株，故至今仍是菌种改良的主要方法。
工业发酵的工艺流程
生物发酵工艺多种多样，但基本上包括菌种的选 育、菌种培养基的配制、扩大培养和接种、发酵 过程下游处理即分离提纯等几个过程。
一、菌种的选育
找到合适的菌种是发酵工程的前提。人们最初是从自然界寻 找所需要的菌种，如谷氨酸发酵时常用菌有谷氨酸棒状杆菌 等。但这种方法得到的菌种，产量一般都比较低。20世纪40 年代，微生物学家开始用紫外线、激光、化学诱变剂等处理 菌种，使菌种产生突变，以筛选出符合要求的优良菌种。随 着细胞工程、基因工程等技术的日益成熟，科学家开始构建 工程细胞或工程菌，用它们进行发酵，甚至能生产出一般微 生物所不能生产的产品。
生产工艺第二章 种子制备 第四节种子质量的控制
第四节 种子质量的控制
2．培养温度和湿度
微生物在一个较宽的温度范围内生长。但是，要获得 高质量的孢子，其最适温度区间很狭窄。一般来说，提高 培养温度，可使菌体代谢活动加快，缩短培养时间，但是， 菌体的糖代谢和氮代谢的各种酶类，对温度的敏感性是不 同的。因此，培养温度不同，菌的生理状态也不同，如果 不是用最适温度培养的孢子，其生产能力就会下降。不同 的菌株要求的最适温度不同，需经实践考察确定。例如， 龟裂链霉菌斜面最适温度为36.5～37℃，如果高于37℃， 则孢子成熟早，易老化，接入发酵罐后，就会出现菌丝对 糖、氮利用缓慢，氨基氮回升提前，发酵产量降低等现象。 培养温度控制低一些，则有利于孢子的形成。龟裂链霉菌 斜面先放在36.5℃培养3天，再放在28.5℃培养1天，所得 的孢子数量比在36.5℃培养4天所得的孢子数量增加3～7倍。
第四节 种子质量的控制
斜面孢子培养时，培养室的相对湿度对孢子形成的速 度、数量和质量有很大影响。空气中相对湿度高时，培养 基内的水分蒸发少；相对湿度低时，培养基内的水分蒸发 多。例如，在我国北方干燥地区，冬季由于气候干燥，空 气相对湿度偏低，斜面培养基内的水分蒸发的快，致使斜 面下部含有一定水分，而上部易干瘪，这时孢子长得快， 且从斜面下部向上长。夏季时空气相对湿度高，斜面内水 分蒸发得慢，这时斜面孢子从上部往下长，下部常因积存 冷凝水，致使孢子生长得慢或孢子不能生长。试验表明， 在一定条件下培养斜面孢子时，在北方相对湿度控制在 40%～45%，而在南方相对湿度控制在35%～42%，所得孢子 质量较好。一般来说，真菌对湿度要求偏高，而放线菌对 湿度要求偏低。
一、影响孢子质量的因素及其控制
孢子质量与培养基、培养温度、湿度、培养时间、 接种量等有关，这些因素相互联系、相互影响，因此必 须全面考虑各种因素，认真加以控制。
6 种子的扩大培养【发酵工程】
C、产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种：
可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡 培养，获得菌丝体，作为种子。
例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。
D、不产孢子的细菌： 生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。 斜面菌种于32C，培养18—24小时，即可移入250 mL
6 种子扩大培养
种子扩大培养概念：
指将保存在砂土管、冷凉干燥管中处休眠状态的生 产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子 耀逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种过程。
目前发酵灌容积已达几十或几百立方米。如按10 ％的种子计算，就要投入几或几十立方米的种子，要 从试管中的菌种逐级扩大为生产用种子，是一个由实 验室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不 同的生产品种和菌种种类而异。
MYPG培养基：3克麦芽浸出物，3克酵母浸出物，5克 蛋白胨、10克葡萄糖和20克琼脂于l升水中。
二、生产车间种子制备
种子罐培养原则： 采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐
等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体 在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。
接种方法：
孢子悬浮液：一般采用微孔接种法。 摇瓶菌丝体种子：可在火焰保护下接入种子罐或采用压 差法接入。 种子罐之间或发酵罐间的移种：主要采用压差法，由种 子接种管道进行移种，移种过程中要防止接受罐表压降 至零，否则会引起染菌。
1、生长快的细菌，种子用量少，种子罐相应也少。
例如：谷氨酸生产中，茄子瓶种子接入种子罐子 32C培养7一10小时，即可按入发酵罐作为种子，这称为 一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。
2、生长较慢的菌种，种子用量大，种子罐相应也多。
发酵工业种子的制备.ppt
孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月
（三）生产车间种子制备阶段
在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量 的菌丝体。
菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果
3、接种量的确定
移入种子的体积 接种量 ＝ —————————
接种后培养液的体积
❖ 接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细胞增加等， 发酵后劲不足
❖ 种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而且易造成染菌 ❖ 以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据 ❖ 接种量的大小直接影响发酵周期
4、种龄
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子 罐或发酵罐时的培养时间。
三、种子质量的判断方法
❖ 通常检测的培养液中参数
➢ pH是否在种子要求的范围之内 ➢ 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 ➢ 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 ➢ 有无杂菌污染
❖ 其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾 气等
四、种子制备技术概要
❖ 步骤：
➢ 斜面培养基中活化； ➢ 扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完成实
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
一级种子接入发酵罐发酵称为二级发酵 二级种子接入发酵罐发酵称为三级发酵
。。。。。。。
依次类推 可知发酵的级数=种子级数+1
• 种子罐级数的意义： 种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，
并可减少移种带来染菌机会。 但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，
缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间， 以提高发酵罐的生产率。因此，种子罐级数不宜 过少。
发酵工程 第五章 种子制备
第二节 工业发酵种子的制备
一、实验室种子制备 二、生产车间种子制备
一、实验室种子制备阶段
1. 培养物选择的原则 目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特 点最终的培养物可分为两类：
1.不产孢子和芽孢的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体
2.产孢子的 ——获得一定数量和质量的孢子 ——获得一定数量和质量的菌体
双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。
如卡那霉素发酵，双种比单种的产量提高8%。
倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。
如链霉素发酵，倒种法比单种法的产量提高12%。
5、种龄（Cell age）
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级 种子罐或发酵罐时的培养时间。 种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。 原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相 对较大，但是最终由实验结果定。
三、种子扩大培养的工艺流程
沙土孢子或冷冻干燥孢子→斜面孢子→摇瓶液体培பைடு நூலகம்（茄子瓶斜面培养或固体 培养基培养）→种子罐培养→发酵罐发酵
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见
设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此形象地将这 些培养过程称为实验室阶段的种子培养。
生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车
间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
四、种子扩大培养的方法
1.孢子进罐法：
以孢子形式的种子直接进罐的方法 – 先在固体培养基（固化培养基）上生长繁殖成
大量孢子，将孢子直接接入种子罐扩大培养。 – 优点：一次可以制备较大量的孢子，易于保存。
既可以节省大量的人力、物力和时间，又可减 少杂菌污染的机会。 – 缺点：砂土管或冷冻管的用量大。
发酵工程第五章发酵工业种子制备-文档资料
种子制备原理与技术 影响种子质量的因素
种子质量的控制措施
种子制备的放大原理与技术
种子制备原理与技术
优良种子应具备的条件
生长活力强，延迟期短；
生理状态稳定；
浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求； 无杂菌污染，保证纯种发酵； 适应性强，生产能力稳定
种子罐级数的确定
酵母发酵时的种子扩大培养
酿酒酵母的扩大培养
最初采用纯种进行酵母发酵并设计出 酵母繁殖流程，他将每一步的接种量 规定为10％，并控制繁殖条件与酿造 时一致
种子制备过程
实验室种子制备阶段：琼脂斜面至 固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜 面培养等或液体摇瓶培养
生产车间种子制备阶段：种子罐扩 大培养
实验室种子制备
无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成 熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶。 菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅 速，可用固体培养基培养孢子
种子液生化分析项目主要有：营养基质的消 耗速度、pH变化、溶氧变化、色泽和气味等
种子制备的放大原理与技术 ຫໍສະໝຸດ 细菌发酵时的种子扩大培养；
细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目的是 为了获得大量的活力强的种子 ；
种龄对于生芽孢的种子尤其重要。若接种物 含大量芽孢，将给后续发酵带来较长迟滞期
举 例：
梭状芽孢杆菌发酵丁醇－丙酮时种子扩大培养的程序
种子扩大的级数：制备种子需逐级扩 大培养的次数 级数愈少，愈利于简化工艺及控制， 并可减少种子罐污染杂菌的机会，减 少消毒及值班工作量，减少因种子罐 生长异常而造成的发酵波动。
确定方法
菌种的性质(如菌种传代后的稳定性)
发酵工程第一章 种子扩大培养
培养温度
❖ 温度过低，菌种生长发育缓慢 ❖ 温度过高会使菌丝过早自溶
在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时， 孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨
基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。
❖ 但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的 种子以满足发酵的需求
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时， 工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂 或菌丝快速生长。
种子培养基特点
❖ 有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足 氮源和生长因子，无机氮源比例大； ➢ 各种营养物质的浓度不必太高； ➢ 供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利 用的碳源和氮源；
➢ 应考虑与发酵培养基的主要成分相近。
pH
❖ 选择最适种子培养pH的原则是获得 最大比生长速率和适当的菌量
❖ 丝状微生物不宜剧烈搅拌。
斜面冷藏时间
❖ 对孢子的生产能力有较大影响 ❖ 冷藏时间越长，生产能力下降越多
链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两 个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％， 比冷藏3个月的降低35％。
培养基
❖ 培养种子的目的：
➢ 扩大培养，增加细胞数量； ➢ 同时也必须培养出强壮、健康、活性
种子质量的判断方法
❖ 通常检测的培养液中参数 ➢ pH是否在种子要求的范围之内 ➢ 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 ➢ 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 ➢ 有无杂菌污染
课程教学大纲-发酵工程原理网络课程-安阳工学院
《发酵工程原理》课程教学大纲（Principle and technology of fermentation process）课程编号：学分：2.0学时：44 （其中：讲课学时：36 实验学时：8 上机学时：0）先修课程：食品生物技术食品微生物学后续课程：适用专业：食品科学与工程（专升本）开课部门：生物与食品工程学院一、课程的性质与目标发酵工程原理是食品科学与工程（专升本）专业一门较重要的专业选修课。
本课程主要讲授了发酵工业菌种、工业培养基设计、发酵工艺的无菌技术、发酵动力学、发酵中氧的供需、发酵的过程控制等内容。
学习本课程的目的在于夯实学生的基础理论知识、增强学生的工程意识、提高学生的科学素养，培养适合社会发展需要的具有创新能力、创业能力的高层次人才。
本课程以生物技术产业化过程涉及的工程知识为教学内容，融合生物化学和微生物学的基础理论，培养学生掌握自主学习和主动实践的方法，使学生具备解决食品加工中遇到的生物技术关键问题的能力。
二、课程的主要内容及基本要求第一章绪论（2学时）[知识点]1.发酵工程的定义及与其它相关学科的关系；2.发酵工程的发展史；3.发酵工业的特点及其范围；4.工业发酵的类型与流程；5.发酵工程展望及应用前景。
[重点]1.发酵及发酵工程的概念；2.工业发酵的类型和流程；3.发酵工业的应用范围及发展前景。
[难点]工业发酵的类型和流程。
[基本要求]1.掌握发酵及发酵工程的概念，了解发酵工程的地位和发酵工程发展史；2.掌握发酵工业的特点及其范围、工业发酵的类型与流程；3.了解发酵工程展望及应用前景。
[实践与练习]发酵工业的特点有哪些？第二章发酵工业菌种（4学时）[知识点]1.常用的工业微生物；2.发酵工业菌种筛选的原则与基本技术；3.发酵工业菌种改良；4.发酵工业菌种保藏。
[重点]菌种改良的技术原理和方法。
[难点]菌种改良的方法。
[基本要求]1.了解微生物分离筛选的基本概念、基本原理；2.掌握菌种改良的基本原理、基本技术和方法。
2发酵工业菌种制备原理和技术(2)(精)
作为种子扩大培养的方法： ① 表面培养法 ② 固体培养法 ③液体培养法（三角瓶摇床震荡或转式培养）； ④载体培养法
24
固体培养法（曲法培养）
浅盘固体培养 深层固体培养
25
优点：
（1）酶活力高。 （2）生产过程中无菌程度要求不很严格。 （3）对于固体发酵，由于产物浓度大，易于分离，可以 有效的降低产品分离成本。
NICPB 卫生部药品生物制品监察所
IV
CIVBP
中国医学科学院病毒研究所
中国兽医药品监察所
CVCC
YM
兽医微生物菌种保藏管理中心
云南省微生物研究所
10
国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心
2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部
3、CSH：美国冷泉港研究所
4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所
9
微生物菌种保藏机构名称和缩写
中 国 缩写 ACCC SH IA CCGMC AS-IV CAF IFFI ID 名称 中国农业微生物菌种保藏管理中心 上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中心 轻工业部食品发酵工业科学研究所 中国医学科学院皮肤病研究所 缩写 ISF CACC SIA AS CFCC CICC CMCC 名称 中国农业科学院土壤肥料研究 所 抗菌素菌种保藏管理中心 四川抗菌素工业研究所 中国科学院微生物研究所 林业微生物菌种保藏管理中心 工业微生物菌种保藏管理中心 医学微生物菌种保藏管理中心
22
（5）接种量
移入种子的体积 接种量＝ ————————— 接种后培养液的体积
5.发酵工业的种子制备
发酵工业种子制备
一 一 种子制备原理与技术
种 优良种子应具备的条件
子
制 ①迟滞期短；②生理状态稳定；③能满足接
备 原 理
种量的要求；④无杂菌污染；⑤生产性能稳 定；
与 技
判断种子质量的指标
术 ①pH值；②种子液的糖、氨基氮、磷酸盐水
平；③种子液形态；④无杂检查；⑤溶氧、
酶活等其他指标；
技 ⑤种子罐与发酵罐的容积比
术
种子罐级数越少，越有利于简化工艺，便于 控制，减少染菌；
发酵工业种子制备
一
种 子
在生产中应注意种龄与接种量
制
备 种龄：过老过嫩都不好，细菌以对数生长期
原 理 与
为宜（霉菌也是），酵母以二倍体细胞为好。 接种量：依据具体的发酵类型和工艺条件而
技 定，过多过少都不好。
术
发酵工业种子制备
子
质 量
②pH值：对微生物有明显的影响。培养基
的 pH调节方法：用酸碱溶液中和法；使用缓
因 素
冲溶液法；使用生理缓冲剂；
发酵工业种子制备
二 ③通气搅拌
影 响
溶解氧的作用：参与菌体呼吸作用;
种 搅拌：促进氧的溶解与营养物质及代谢产物
子 质 量
的扩散。 通气量的多少以溶解氧的多少来衡定。
的 通气过程中，影响溶解氧的因素：
发酵工业种子制备
二 影
3.染菌的控制
响 种
染菌原因：设备、管道、阀门漏损、发酵罐
子 结构“死角”、灭菌不彻底、空气净化不好、
质 量
无菌操作不严、菌种不纯；
的
因
素
发酵工业种子制备 作业题
分析影响种子质量的主要因素。
6发酵工业的种子制备精
❖ 种子罐级数越少，越有利于简化工艺 和控制，并减少由于多次转种而带来 的染菌机会以及减少因种子罐生长异 常而造成的发酵波动。
❖ 但考虑能否在一定时间内获得优质、 足量的种子以满足发酵的需求。
12.01.2021
14
15L种子发酵罐
12.01.2021
15
实验室准备阶段
生
产
车
间
阶
放罐，后处理
段
12.01.2021
5
3、种子质量的判断方法
❖ 通常检测的培养液中参数 ➢pH是否在种子要求的范围之内 ➢糖、氨基氮、磷酸盐的含量 ➢菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 ➢有无杂菌污染
❖ 其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾 气等
12.01.2021
6
4、种子制备
❖ 步骤： ➢斜面培养基中活化； ➢扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培 养，完成实验室种子制备 ➢一级种子罐，制备生产用种子；视情况 确定扩大级数，完成生产车间种子制备； ➢种子转种至发酵罐
12.01.2021
29
5、斜面冷藏时间
❖对孢子的生产能力有较大影响 ❖冷藏时间越长，生产能力下降越多
链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两 个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％， 冷藏3个月的降低35％。
12.01.2021
30
6、培养基
❖培养种子的目的：
➢扩大培养，增加细胞数量； ➢同时也必须培养出强壮、健康、活性高
12.01.2021
44
谢谢！
技术
12.01.2021
22
二、影响种子质量的因素
❖ 原材料质量 ❖ 培养温度 ❖ 湿度 ❖ 通气与搅拌
❖ 斜面冷藏时间 ❖ 培养基 ❖ pH
发酵生产的过程及控制
死亡期
2、补料分批培养
在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致 的发酵过早结束的缺点。 在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束 时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中 采用这种方法很多。
简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出， 除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓 度和产物浓度等参数都随时间变化。
优点： 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量 容易掌握 缺点： 产率低，不适于测定动力学数据
分批培养中微生物的生长
迟滞期 对数生长期
稳 定期
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。
在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面。
3、接种量的确定
移入种子的体积 接种量＝ —————————
接种后培养液的体积
过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。 但是一般认为大一点好。
7 种子的质量标准
• 菌丝形态、菌体浓度和培养基外观（色素、颗粒等）； • pH； • 糖氮代谢速度； • 其它参数,如接种前的抗生素含量、某种酶活等。
8 影响种子质量的因素：
1）原材料的质量:
一般选择一些有利于孢子发芽和菌丝生长的培养基，在营养 上容易被菌体直接吸收利用，营养成分要适当地丰富和完全， 氮源和维生素含量较高，这样可以使菌丝粗壮，并且具有较 强的活力。
另一方面，种子培养基中的营养成分要尽可能和发酵培养基 接近以适合发酵的需要，这样的种子移入发酵罐后能比较容 易适应发酵罐的培养条件如微量元素Mg、Ca、Ba能刺激孢子 的生长。 2）、培养温度：过低？过高？
(精选)发酵工业的种子制备
❖ 生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在
工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为 生产车间阶段。
10
11
（二）实验室种子制备阶段
目的：将种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的 培养物可分为两类：
22
大量地接入培养成熟的菌种的优点：
➢ 缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期， 提高了设备利用率
➢节约发酵培养的动力消耗 ➢有利于减少染菌机会
23
在放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响
24
放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响
❖ 其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾 气等
8
四、种子制备技术概要
❖ 步骤：
➢ 斜面培养基中活化； ➢ 扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完成实
验室种子制备 ➢ 一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩大级
数，完成生产车间种子制备； ➢ 种子转种至发酵罐
9
（一）种子制备过程
❖ 实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇
14
2、起始接种物的传代问题
细菌
保藏斜面 → 活化斜面
产孢子
保藏 → 母斜面 → 子斜面
目的：使菌种的传代次数尽可能的少。
15
孢子培养
母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。 所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。
子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子。 接种：①从母斜面上点接种，选取生长好的单 菌落 ②接种时密一点，得到大量的孢子。
发酵工程复习题
发酵工程复习题第一章绪论发酵工程:利用微生物特定性状和功能，通过现代化工程技术生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系,是将传统发酵于现代的DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术集合并发展起来的发酵技术。
二简答题1. 简述发酵工业的特点2。
简述发酵的一般工艺流程(菌种制备、培养基的制备、灭菌、接种、控制发酵条件、产物的提取与精制、回收处理三废物质）。
3．上游技术：优良种株的选育和保藏（包括菌种筛选、改造，菌种代谢路径改造等）.基因工程和细胞工程（上游生物技术）中游技术:发酵过程控制，主要包括发酵条件的调控，无菌环境的控制，过程分析和控制等下游技术:分离和纯化产品。
包括固液分离技术、细胞破壁技术、产物纯化技术,以及产品检验和包装技术等4．发酵工程的发展1) 1900年前，自然发酵阶段。
2）1900-1940年，纯培养技术的建立—第一转折点3) 1940年后，深层液体通气搅拌纯种培养—第二转折点4）代谢控制发酵工程技术的建立—第三转折点5）开拓发酵原料，发展发酵放大技术6) 采用基因工程菌生产新产物5．发酵工业的研究范畴：发酵食品，微生物菌体，酶制剂,微生物特殊机能利用，代谢产物，生物转化.6．工业发酵的类型对氧的需求:需氧发酵，厌氧发酵，兼性厌氧发酵培养基物理性状:液体发酵，固体发酵（浅盘固体发酵和深层固体发酵）发酵的工艺流程:分批发酵，连续发酵，补料分批连续发酵第二章发酵工业菌种要求一名词解释菌落，芽孢，荚膜,鞭毛，富集培养，比生长速率，连续培养，诱变育种，菌种退化，菌种的复壮.二简答题1。
简述酵母菌的形态结构及繁殖方式;2。
菌种分离筛选步骤。
一名词解释菌落芽孢荚膜鞭毛富集培养比生长速率：单位菌体在单位时间内生长所增加的菌体量。
连续培养诱变育种菌种退化菌种的复壮：在菌种的生产性能未衰退前，有意识的进行纯种的分离和性能的测定，以期菌种的性能逐步提高;方法：1、纯种分离；2、在宿主体内生长进行复壮；3、淘汰衰退的个体。
发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术
发酵工程 工业生产水平的
生产菌种的性能 发酵和提取工艺条件
三个决定要素
生产设备
获得优良的生产菌种是实现高水平发酵工程工 业生产的第一环节。
本章内容
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
第二节 自然界中微生物菌种的选择性分离
第三节 微生物菌种的选育
第四节 微生物菌种的退化、复壮和保藏 第五节 工业微生物菌种的扩大培养 第六节 种子培养基及其制备
集的培养物到固体培养基，分离优势微生物的单
菌落。
移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。
连续富集培养（恒化式富集培养）
改变限制性基质浓度来控制两种菌的比生长速率。 用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。
固体培养基的使用
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
常用于分离酶产生菌，选择培养基中常含有所
需的基质，以便促使酶产生菌的生长，并在菌落
使目的微生物在种群中占优势，使筛选 1. 目的：
变得可能。
2. 两种方案：
（1）施加选择性压力分离法：采用特定的有利于 目的微生物富集的条件进行培养，使目的微生物 占优势，以实现快速分离纯化的目的。 （2）随机分离法：不能提供任何有助于筛选产生 菌的信息时，只能通过随机分离法进行分离。
（1）施加选择性压力分离法
酵母(既是微生物又是真核细胞)
生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
发酵工业生产的一般过程
发酵工业生产的一般过程微生物发酵常因菌种和产品不同而有所不同，但一般过程都基本相同，通常包括菌种制备、原料处理、接种培养、发酵控制和产品提取等环节。
1、菌种制备菌种是发酵工业之母，没有菌种，就谈不上微生物发酵。
菌种一般分保藏菌种、摇瓶（茄子瓶等）菌种和种子罐菌种。
保藏菌种是发酵生产的备用菌种，一般放在低温干燥状态下保存。
保藏菌种进入生产接种之前，首先接入斜面进行活化，使菌种从休眠状态转为正常代谢状态。
用于活化的培养基一般营养丰富、易于吸收，有利于菌种的生长繁殖。
活化后的菌种再进行扩大，将其接人摇瓶（茄子瓶等）中进行培养，此时所用的培养基比保藏菌种用培养基更粗放，更经济。
摇瓶种子进一步扩大，接人种子罐进行培养。
种子罐培养基比较接近发酵罐所用培养基成分，目的是让菌种进一步适应发酵培养基的环境。
种子罐种子培养好以后可适时进行大罐（通风曲室）接种。
2、原料处理发酵原料来源丰富，成分粗放，状态不一，通常不能直接为微生物所利用，因而要进行预处理，才能作为微生物发酵用的培养基的成分。
发酵原料一般要经过筛选、粉碎、蒸煮或水解后，再加上其他有关物质配制成发酵培养基。
3、接种培养发酵培养基配制好以后，进行灭菌。
待其冷却后，适时进行接种。
接种要保证在无菌条件下进行，以防污染。
无菌接种是发酵成败的关键。
4、发酵控制菌种接好后，提供必要的生长条件，菌体开始生长繁殖，进行新陈代谢，发酵累积代谢产物。
必要的生产条件包括培养温度、氧气需求、pH指标、营养成分补充和泡沫消除等。
所有这些条件要经常观察、记录、分析、改进，以保证发酵生产正常进行。
在发酵过程中，还要经常观察菌体的形态变化，测定代谢产物的积累情况，以决定放罐的最佳时间，进行收获。
5、产品提取发酵过程一旦完成，及时进行产品提取。
根据不同的产品，采取不同的方法进行分离纯化，以求获得最高的产量和最好的质量。
提取的方法一般有物理法（如过滤、离心、干燥等）、化学法（吸附、蒸馏、层析、离子交换等）和生物法等。
第一节 种子制备
•第四章种子制备与菌种保藏•第一节种子制备（Inoculum development）定义：由保藏的菌种开始，经过逐级扩大培养，最后获得供生产车间发酵罐接种的的足够数量和优质质量的种子。
生产菌种的必备条件：1 生长快：2 对环境条件要有比较大的承受能力3 遗传表现型要稳定，不易退化4 菌种要纯几个概念种子罐级数：种子在种子罐中需扩大培养的次数。
发酵级数：种子罐的级数加一。
接种量：放罐的种子罐的培养液体积除以接种后培养液的体积的百分数。
种龄：生产种子的培养时间。
一斜面种子的制备1.斜面种子：在试管或扁瓶内，以琼脂固化的培养基表面上生长的菌种培养物。
2. 制备流程：3. 制备过程注意事项(1) 琼脂要完全浸没在营养液内,用量1.0%-2.5% ( 2) 营养液中最好不含易沉淀的固形物；(3) 装量掌握在斜面顶端不超过试管或扁平长度的2/3；(4) 灭菌后垂直放置至稍冷后再斜放，以减少冷凝水(5) 微量元素先配制成一定的溶液，用移液管定量加入3. 质量检查(1) 外观检查( 2) 无菌检查( 3)摇瓶生产能力检查4.影响斜面种子质量的因素(1)原材料质量，水质，培养基pH，(2)灭菌条件，(3)接种量，(4)培养室温度、湿度、通风、(5)培养时间，(6)有害气体或挥发物（培养室内不要安紫外灯）(7) 冷藏条件•二、米粒种子（米孢子）• 1. 米孢子：将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小米颗粒上，恒温培养一段时间后产生的分生孢子。
• 2 . 米孢子制备工艺流程• 3. 制备过程注意事项（1）浸泡时间及加营养液量应掌握在灭菌后米粒熟透但不粘连；（2）分装量应掌握在平铺后有2-3粒米的厚度（3）米粒不要碰到瓶塞；（4）培养前期应经常摇动米粒，使微生物在米粒表面生长均匀，气生菌丝及孢子长成后不再摇动。
（5）保存：冰箱保存；真空干燥保存；10%-20%甘油浸泡保存• 4. 质量标准（1）无杂菌污染（2）孢子数足够，发芽率高（3）生产能力高(4) 真空干燥后含水量小于8% 5. 影响质量的因素及控制（同前）•三、种曲（培养材料用麸皮、米糠等，其余同米粒种子）四、摇瓶种子 1.摇瓶种子:将斜面种子或米孢子接种于锥形摇瓶内的液体培养基中，在摇床上振荡培养得到的液体种子。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2018年9月21日星期五
24
例1：四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的 麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子 质量的影响也不同。
例2：制备霉菌用的大(小 )米，其产地、颗粒大小、均匀程 度不同，孢子质量也不同。
例3：蛋白胨加工原料不同，对孢子影响也不同。 例4：琼脂的牌号不同，其中含无机离子的差别而引起孢子 质量的变化。 例5：水质的硬度、污染程度对生产均有影响。
2018年9月21日星期 五 11
种子扩大培养阶段
液体培养法：液体试管、三角瓶摇床 振荡或回旋式培养。 表面培养法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盘 培养。
固体培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏 瓶、培养皿等麸皮培养。
12
2018年9月21日星期 五
生产车间种子制备
实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到 种子罐进行扩大培养。 种子罐培养一获得足够的菌种数量，二 种子罐的培养基接近发酵罐培养的醪液成 分和培养条件，使菌体适应发酵环境。
第六章 发酵工业的种子制备
2018年9月21日星期五
1
本章内容：
• 一、种子制备原理与技术 • 二、影响种子质量的因素 • 三、种子质量的控制措施
• 四、种子制备的放大原理与
技术
2018年9月21日星期五 2
一、种子制备原理与技术
1、优良种子应具备的条件
生长活力强，延迟期短；
生理状态稳定；
糖、氨基氮、磷酸盐的含量 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 有无杂菌污染 其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾 气等
2018年9月21日星期五
6
4、种子制备
步骤：
斜面培养基中活化；
扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培 养，完成实验室种子制备 一级种子罐，制备生产用种子；视情况 确定扩大级数，完成生产车间种子制备；
17
放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响
2018年9月21日星期五 18
大量地接入培养成熟的菌种的优点：
缩短生长过程的延缓期，因而缩短了
发酵周期，提高了设备利用率
节约发酵培养的动力消耗
有利于减少染菌机会
2018年9月21日星期五
19
接种量
接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体 的体积的比例 接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老 细胞增加等，发酵后劲不足
2018年9月21日星期五
25
2、培养温度
温度过低，菌种生长发育缓慢
温度过高会使菌丝过早自溶
在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时， 孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨 基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。
2018年9月21日星期五
26
3、湿度
湿度低，孢子生长快； 湿度大，孢子生长慢
2018年9月21日星期 五
13
种子罐级数越少，越有利于简化工艺 和控制，并减少由于多次转种而带来 的染菌机会以及减少因种子罐生长异 常而造成的发酵波动。 但考虑能否在一定时间内获得优质、 足量的种子以满足发酵的需求。
14
2018年9月21日星期 五
15L种子发酵罐
2018年9月21日星期五 15
• 四、种子制备的放大原理与
技术
2018年9月21日星期五 22
二、影响种子质量的因素
原材料质量
培养温度
斜面冷藏时间 培养基 pH
湿度
通气与搅拌
2018年9月21日星期 五
23
1
原材料质量波动的主要原因：无机离子 含量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、 Ba2+能刺激孢子的形成，磷含量太多或 太少也会影响孢子的质量）。
浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求；
无杂菌污染，保证纯种发酵；
适应性强，生产能力稳定。
2018年9月21日星期 五
3
2、种子罐级数的确定
种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大 培养的次数 级数愈少，愈利于简化工艺及控制，并 可减少种子罐污染杂菌的机会，减少消 毒及值班工作量，减少因种子罐生长异 常而造成的发酵波动。
制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时发现， 在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得 较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干瘪状， 孢子稀少。 在气温高湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主 要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子形成。
2018年9月21日星期五 27
实验室准备阶段
放罐，后处理
生 产 车 间 阶 段
产品
2018年9月21日星期五
16
5、种龄与接种量
接种龄
种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种 子罐或发酵罐时的培养时间 种子培养期应取菌种的对数生长期为宜， 菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而 且会降低产量。
2018年9月21日星期五
2018年9月21日星期五
4
确定方法
菌种的性质(如菌种传代后的稳定性)
瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速 度 发酵罐中种子培养液的最低接种量 种子罐与发酵罐的容积比 生产规模 随工艺条件的改变作适当的调整
2018年9月21日星期五 5
3、种子质量的判断方法
通常检测的培养液中参数
pH是否在种子要求的范围之内
接种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而 且易造成染菌。
以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据。 接种量的大小直接影响发酵周期。
2018年9月21日星期五
20
在放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响
2018年9月21日星期五 21
本章内容：
• 一、种子制备原理与技术 • 二、影响种子质量的因素 • 三、种子质量的控制措施
种子转种至发酵罐
2018年9月21日星期五
7
种子制备过程
实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固 体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培 养等或液体摇瓶培养
生产车间种子制备阶段：种子罐扩大 培养
2018年9月21日星期五
8
2018年9月21日星期五
9
2018年9月21日星期五
10
实验室种子制备
无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成 熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶。 菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅 速，可用固体培养基培养孢子。 菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用摇 瓶液体培养法。 不产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度 下活化即可。