发酵工业种子的制备.ppt
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第五章 发酵工业的种子制备 2
第五章发酵工业的种子制备内容提要•种子制备原理和技术•影响种子质量的因素•种子质量的控制措施•工业微生物培养的类型一、种子扩大培养1、种子扩大培养的任务工业生产规模的增大需要种子就增多种子的扩大培养种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的培养物，还要获得活力旺盛的、性能稳定、接种数量足够的、纯的培养物。
2、菌种扩大培养的目的为发酵罐的投料提供足够数量的代谢旺盛的种子。
因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。
将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机会。
对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢及生产的规模决定种子扩大培养的级数。
对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢来决定种子扩大培养级数。
抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖速度较慢，常常用三级种子扩大培养，即将种子罐中之菌丝移植到较大的种子罐中扩大培养后，再移入发酵罐中，这种流程称为三级种子四级发酵一般50t发酵罐多采用三级发酵，有的甚至采用四级发酵，如链霉素生产。
有些酶制剂发酵生产也采用三级发酵。
而谷氨酸及其他氨基酸发酵所用的菌种是细菌，生长繁殖速方式很快，所以采用二级发酵。
一级种子二级发酵的流程如下：斜面菌种→一级种子摇床培养→二级种子罐培养→发酵罐二、种子制备原理与技术种子培养：指冷冻干燥管、沙土管中处于休眠状态的工业菌种，接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养，而获得一定数量和质量的纯种的过程。
其中的纯培养物就称为种子。
不同的发酵产品和菌种，种子制备的方法与条件不同。
要根据目的菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得优良的种子。
1、优良种子应具备的条件①、菌种细胞的生长活力强，转移至发酵罐后能迅速生长，延迟期短；②、菌种生理状态稳定（如菌丝生长速率、种子培养液的特性等）；③、菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求；④、无杂菌污染，保证纯种发酵；⑤、菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。
发酵工程 第五章 种子制备
第二节 工业发酵种子的制备
一、实验室种子制备 二、生产车间种子制备
一、实验室种子制备阶段
1. 培养物选择的原则 目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特 点最终的培养物可分为两类：
1.不产孢子和芽孢的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体
2.产孢子的 ——获得一定数量和质量的孢子 ——获得一定数量和质量的菌体
双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。
如卡那霉素发酵，双种比单种的产量提高8%。
倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。
如链霉素发酵，倒种法比单种法的产量提高12%。
5、种龄（Cell age）
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级 种子罐或发酵罐时的培养时间。 种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。 原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相 对较大，但是最终由实验结果定。
三、种子扩大培养的工艺流程
沙土孢子或冷冻干燥孢子→斜面孢子→摇瓶液体培பைடு நூலகம்（茄子瓶斜面培养或固体 培养基培养）→种子罐培养→发酵罐发酵
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见
设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此形象地将这 些培养过程称为实验室阶段的种子培养。
生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车
间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
四、种子扩大培养的方法
1.孢子进罐法：
以孢子形式的种子直接进罐的方法 – 先在固体培养基（固化培养基）上生长繁殖成
大量孢子，将孢子直接接入种子罐扩大培养。 – 优点：一次可以制备较大量的孢子，易于保存。
既可以节省大量的人力、物力和时间，又可减 少杂菌污染的机会。 – 缺点：砂土管或冷冻管的用量大。
发酵工程与设备第五章、发酵工业种子制备
/jpkc/fjgc
3. 二级种子(种子罐) 培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 浓度为2.5%
培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%(10%)）， 32℃培养7-10个小时 培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
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pH
选择最适种子培养pH的原则是获得最大 比生长速率和适当的菌量
培养最后一级种子的培养基的pH应接近 于发酵培养基的pH，以便种子能尽快适 应新的环境
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丝状微生物不宜剧烈搅拌。
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斜面冷藏时间
对孢子的生产能力有较大影响 冷藏时间越长，生产能力下降越多
链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两 个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％， 比冷藏3个月的降低35％。
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种子制备原理与技术
优良种子应具备的条件 生长活力强，延迟期短； 生理状态稳定； 浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求； 无杂菌污染，保证纯种发酵；
适应性强，生产能力稳定
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种子制备
步骤： 斜面培养基中活化； 扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培 养，完成实验室种子制备 一级种子罐，制备生产用种子；视情况
发酵级数的确定 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时， 工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数 谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵 青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
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发酵级数确定的依据
发酵
/jpkc/fjgc
三级种子的特点： ① 种量更大，生长速度快：
种子制备PPT课件
标是否合格。 3.菌丝形态，菌丝浓度，培养液外观（色泽、
气味、浑浊度、 颗粒等）。 4.产物指标，酶活等。
三、种子扩大培养的工艺流程
沙土孢子（冷冻干燥孢子）→斜面孢子→摇瓶液体培养（茄子瓶斜面培养或固 体培养基培养）→种子罐培养→发酵罐发酵
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见
1.不产孢子和芽胞的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体
2.产孢子的 ——获得一定数量和质量的孢子 ——获得一定数量和质量的菌体
放线菌孢子的制备
1.培养基与培养条件
（1）琼脂，和其他营养成分如麸皮、豌豆浸汁、蛋 白胨、牛肉膏和一些无机盐等，碳源和氮源不要 太丰富，碳氮比例大一些为好，干燥和限制营养 可直接或间接诱导孢子的形成。
③ 缺点：菌丝不易保存，批次更换频繁，批与批 之间的种子质量有差异，容易造成生产上的波 动；由于菌丝制备工艺时间长，增加了杂菌污 染的机会。
第二节 工业发酵种子的制备
一、实验室种子制备 二、生产车间种子制备
一、实验室种子制备
1. 培养物选择的原则 目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特 点最终的培养物可分为两类：
二、优质种子必须具备的条件
①菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速 生长，迟缓期短；
②生理性状稳定，以得到稳定的菌体生长过程； ③具有适宜的菌体总量及浓度，满足大容量发酵的
要求； ④无杂菌污染， ⑤保持稳定的生产能力，使最终产物的生物合成量
持续、稳定、高产。
生产菌种质量的检测标准
1.无菌试验及显微镜镜检观察有无杂菌 2.生化测定。糖、氮、pH、菌体浓度等代谢指
子直接接入种子罐扩大培养。 – 优点：一次可以制备较大量的孢子，易于保存。
气味、浑浊度、 颗粒等）。 4.产物指标，酶活等。
三、种子扩大培养的工艺流程
沙土孢子（冷冻干燥孢子）→斜面孢子→摇瓶液体培养（茄子瓶斜面培养或固 体培养基培养）→种子罐培养→发酵罐发酵
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见
1.不产孢子和芽胞的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体
2.产孢子的 ——获得一定数量和质量的孢子 ——获得一定数量和质量的菌体
放线菌孢子的制备
1.培养基与培养条件
（1）琼脂，和其他营养成分如麸皮、豌豆浸汁、蛋 白胨、牛肉膏和一些无机盐等，碳源和氮源不要 太丰富，碳氮比例大一些为好，干燥和限制营养 可直接或间接诱导孢子的形成。
③ 缺点：菌丝不易保存，批次更换频繁，批与批 之间的种子质量有差异，容易造成生产上的波 动；由于菌丝制备工艺时间长，增加了杂菌污 染的机会。
第二节 工业发酵种子的制备
一、实验室种子制备 二、生产车间种子制备
一、实验室种子制备
1. 培养物选择的原则 目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特 点最终的培养物可分为两类：
二、优质种子必须具备的条件
①菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速 生长，迟缓期短；
②生理性状稳定，以得到稳定的菌体生长过程； ③具有适宜的菌体总量及浓度，满足大容量发酵的
要求； ④无杂菌污染， ⑤保持稳定的生产能力，使最终产物的生物合成量
持续、稳定、高产。
生产菌种质量的检测标准
1.无菌试验及显微镜镜检观察有无杂菌 2.生化测定。糖、氮、pH、菌体浓度等代谢指
子直接接入种子罐扩大培养。 – 优点：一次可以制备较大量的孢子，易于保存。
5.发酵工业的种子制备
五 发酵工业种子制备
发酵工业种子制备
一 一 种子制备原理与技术
种 优良种子应具备的条件
子
制 ①迟滞期短；②生理状态稳定；③能满足接
备 原 理
种量的要求；④无杂菌污染；⑤生产性能稳 定；
与 技
判断种子质量的指标
术 ①pH值；②种子液的糖、氨基氮、磷酸盐水
平；③种子液形态；④无杂检查；⑤溶氧、
酶活等其他指标；
技 ⑤种子罐与发酵罐的容积比
术
种子罐级数越少，越有利于简化工艺，便于 控制，减少染菌；
发酵工业种子制备
一
种 子
在生产中应注意种龄与接种量
制
备 种龄：过老过嫩都不好，细菌以对数生长期
原 理 与
为宜（霉菌也是），酵母以二倍体细胞为好。 接种量：依据具体的发酵类型和工艺条件而
技 定，过多过少都不好。
术
发酵工业种子制备
子
质 量
②pH值：对微生物有明显的影响。培养基
的 pH调节方法：用酸碱溶液中和法；使用缓
因 素
冲溶液法；使用生理缓冲剂；
发酵工业种子制备
二 ③通气搅拌
影 响
溶解氧的作用：参与菌体呼吸作用;
种 搅拌：促进氧的溶解与营养物质及代谢产物
子 质 量
的扩散。 通气量的多少以溶解氧的多少来衡定。
的 通气过程中，影响溶解氧的因素：
发酵工业种子制备
二 影
3.染菌的控制
响 种
染菌原因：设备、管道、阀门漏损、发酵罐
子 结构“死角”、灭菌不彻底、空气净化不好、
质 量
无菌操作不严、菌种不纯；
的
因
素
发酵工业种子制备 作业题
分析影响种子质量的主要因素。
发酵工业种子制备
一 一 种子制备原理与技术
种 优良种子应具备的条件
子
制 ①迟滞期短；②生理状态稳定；③能满足接
备 原 理
种量的要求；④无杂菌污染；⑤生产性能稳 定；
与 技
判断种子质量的指标
术 ①pH值；②种子液的糖、氨基氮、磷酸盐水
平；③种子液形态；④无杂检查；⑤溶氧、
酶活等其他指标；
技 ⑤种子罐与发酵罐的容积比
术
种子罐级数越少，越有利于简化工艺，便于 控制，减少染菌；
发酵工业种子制备
一
种 子
在生产中应注意种龄与接种量
制
备 种龄：过老过嫩都不好，细菌以对数生长期
原 理 与
为宜（霉菌也是），酵母以二倍体细胞为好。 接种量：依据具体的发酵类型和工艺条件而
技 定，过多过少都不好。
术
发酵工业种子制备
子
质 量
②pH值：对微生物有明显的影响。培养基
的 pH调节方法：用酸碱溶液中和法；使用缓
因 素
冲溶液法；使用生理缓冲剂；
发酵工业种子制备
二 ③通气搅拌
影 响
溶解氧的作用：参与菌体呼吸作用;
种 搅拌：促进氧的溶解与营养物质及代谢产物
子 质 量
的扩散。 通气量的多少以溶解氧的多少来衡定。
的 通气过程中，影响溶解氧的因素：
发酵工业种子制备
二 影
3.染菌的控制
响 种
染菌原因：设备、管道、阀门漏损、发酵罐
子 结构“死角”、灭菌不彻底、空气净化不好、
质 量
无菌操作不严、菌种不纯；
的
因
素
发酵工业种子制备 作业题
分析影响种子质量的主要因素。
发酵工业的种子制备精PPT课件
种子转种至发酵罐
2019年4月23日星期二
7
种子制备过程
实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固 体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培 养等或液体摇瓶培养
生产车间种子制备阶段：种子罐扩大 培养
2019年4月23日星期二
8
2019年4月23日星期二
9
2019年4月23日星期二
10
实验室种子制备
无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成 熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶。 菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅 速，可用固体培养基培养孢子。 菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用摇 瓶液体培养法。 不产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度 下活化即可。
糖、氨基氮、磷酸盐的含量 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 有无杂菌污染 其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾 气等
2019年4月23日星期二
6
4、种子制备
步骤：
斜面培养基中活化；
扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培 养，完成实验室种子制备 一级种子罐，制备生产用种子；视情况 确定扩大级数，完成生产车间种子制备；
2019年4月23日星期二 11
种子扩大培养阶段
液体培养法：液体试管、三角瓶摇床 振荡或回旋式培养。 表面培养法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盘 培养。
固体培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏 瓶、培养皿等麸皮培养。
12
2019年4月23日星期二
生产车间种子制备
实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到 种子罐进行扩大培养。 种子罐培养一获得足够的菌种数量，二 种子罐的培养基接近发酵罐培养的醪液成 分和培养条件，使菌体适应发酵环境。
2019年4月23日星期二
发酵工程第五章发酵工业种子制备共38页文档
通气与搅拌
❖ 足够的通气量，以保证菌种代谢正 常，提高种子的质量
❖ 搅拌可提高通气效果，促进生长繁 殖，过度搅拌导致培养液大量涌泡， 液膜表面的酶易氧化变性，泡沫过 多增加染菌机会，增加能耗。
❖ 丝状微生物不宜剧烈搅拌。
斜面冷藏时间
❖ 对孢子的生产能力有较大影响 ❖ 冷藏时间越长，生产能力下降越多
含大量芽孢，将给后续发酵带来较长迟滞期
举 例：
梭状芽孢杆菌发酵丁醇－丙酮时种子扩大培养的程序
酵母发酵时的种子扩大培养
放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响
接种种龄和接种量
❖ 接种量：移入的种子液体积和接种后培养液 体的体积的比例
❖ 接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰 老细胞增加等，发酵后劲不足
❖ 种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而 且易造成染菌。
❖ 以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据 ❖ 接种量的大小直接影响发酵周期。
本章内容：
种子制备原理与技术 影响种子质量的因素 种子质量的控制措施 种子制备的放大原理与技术
种子制备原理与技术
优良种子应具备的条件 ➢ 生长活力强，延迟期短； ➢ 生理状态稳定； ➢ 浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求； ➢ 无杂菌污染，保证纯种发酵； ➢ 适应性强，生产能力稳定
种子罐级数的确定
种子扩大的级数：制备种子需逐级扩 大培养的次数 级数愈少，愈利于简化工艺及控制， 并可减少种子罐污染杂菌的机会，减 少消毒及值班工作量，减少因种子罐 生长异常而造成的发酵波动。
确定方法
菌种的性质(如菌种传代后的稳定性) 瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度 发酵罐中种子培养液的最低接种量 种子罐与发酵罐的容积比 生产规模 随工艺条件的改变作适当的调整
第五章 发酵工业的种子制备
种子罐级数的确定方法
菌种的性质(如菌种传代后的稳定性) 菌种的性质(如菌种传代后的稳定性) 瓶中的孢子数， 瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度 发酵罐中种子培养液的最低接种量 种子罐与发酵罐的容积比 生产规模 随工艺条件的改变作适当的调整
总结： 总结：种子扩培 ——实验室种子制备 ——实验室种子制备
例：青霉素生产菌种
孢子悬浮液
（4-14h） 14h）
一级种子罐
（27℃，40h） ）
二级种子罐
（27℃， 10-24h） ）
发酵罐
实验室种子 制备
孢子进罐法
★ 不产孢子的细菌：获得一定数量和质量的菌体 菌体
保藏斜面
活化斜面
摇瓶培养
种子罐
如生产谷氨酸的棒状杆菌属、短杆菌属
例：谷氨酸棒杆菌
斜面菌种于32℃，培养18~24h 斜面菌种 茄子瓶斜面培养基/1000mL 250mL茄子瓶斜面培养基 茄子瓶斜面培养基 摇瓶液体培养基，32℃培养12h 摇瓶液体培养基 种子罐
种子罐级数：
制备种子需逐级扩大培养的次数。 制备种子需逐级扩大培养的次数。
一级种子罐扩大培养 一级 二级发酵 三级发酵 四级发酵
二级种子罐扩大培养（发芽罐、繁殖罐） 二级 三级种子罐扩大培养：生长更慢的菌种 三级
一级发酵：在小型发酵罐(5~30L)中进行试验时，直接采 一级 用孢子或菌丝体接入罐中发酵
放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响
种龄和接种量
接种量： 接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体的体 积的比例
大多数抗生素发酵：7~15% ，有时可达20~25% 有机酸发酵：10% 谷氨酸发酵（棒状杆菌）：1% 肌苷酸发酵1.5~2% 制霉菌素发酵0.1~1%
5.发酵工业的种子制备
子 质 量 的 因 素
消泡方法： 消泡剂：动植物油、石油化工矿物油；改性 油，表面活性剂（有机硅聚合物）；
机械消泡：
改变培养基成分：
发பைடு நூலகம்工业种子制备
二 影 响 种 子 质 量 的 因 素
3.染菌的控制
染菌原因：设备、管道、阀门漏损、发酵罐 结构“死角”、灭菌不彻底、空气净化不好、 无菌操作不严、菌种不纯；
五 发酵工业种子制备
发酵工业种子制备
一 种子制备原理与技术
一 种 子 制 备 原 理 与 技 术
优良种子应具备的条件 ①迟滞期短；②生理状态稳定；③能满足接 种量的要求；④无杂菌污染；⑤生产性能稳 定； 判断种子质量的指标 ①pH值；②种子液的糖、氨基氮、磷酸盐水 平；③种子液形态；④无杂检查；⑤溶氧、 酶活等其他指标；
1.培养基：
选用原则：组分简单，来源丰富，价格便宜， 取材方便等。种子培养基以菌体增殖为目的， 应该糖份少而氮源多些。 种子罐与发酵罐培养基成分趋于一致时，可 缩短发酵生产的周期。
发酵工业种子制备
二 影 响 种 子 质 量 的 因 素
2.培养条件
①温度：温度直接影响生长和酶的合成； ②pH值：对微生物有明显的影响。培养基 pH调节方法：用酸碱溶液中和法；使用缓 冲溶液法；使用生理缓冲剂；
发酵工业种子制备 ③通气搅拌
二 影 响 种 子 质 量 的 因 素
溶解氧的作用：参与菌体呼吸作用; 搅拌：促进氧的溶解与营养物质及代谢产物 的扩散。 通气量的多少以溶解氧的多少来衡定。 通气过程中，影响溶解氧的因素： 菌种； 培养基性质； 培养阶段； 发酵罐的结构；
发酵工业种子制备 ④泡沫：
二
危害：影响微生物对氧的吸收；妨碍CO2的 影 排除；减少设备利用率（有效容积减少）； 响 种 造成跑料，导致染菌；
消泡方法： 消泡剂：动植物油、石油化工矿物油；改性 油，表面活性剂（有机硅聚合物）；
机械消泡：
改变培养基成分：
发பைடு நூலகம்工业种子制备
二 影 响 种 子 质 量 的 因 素
3.染菌的控制
染菌原因：设备、管道、阀门漏损、发酵罐 结构“死角”、灭菌不彻底、空气净化不好、 无菌操作不严、菌种不纯；
五 发酵工业种子制备
发酵工业种子制备
一 种子制备原理与技术
一 种 子 制 备 原 理 与 技 术
优良种子应具备的条件 ①迟滞期短；②生理状态稳定；③能满足接 种量的要求；④无杂菌污染；⑤生产性能稳 定； 判断种子质量的指标 ①pH值；②种子液的糖、氨基氮、磷酸盐水 平；③种子液形态；④无杂检查；⑤溶氧、 酶活等其他指标；
1.培养基：
选用原则：组分简单，来源丰富，价格便宜， 取材方便等。种子培养基以菌体增殖为目的， 应该糖份少而氮源多些。 种子罐与发酵罐培养基成分趋于一致时，可 缩短发酵生产的周期。
发酵工业种子制备
二 影 响 种 子 质 量 的 因 素
2.培养条件
①温度：温度直接影响生长和酶的合成； ②pH值：对微生物有明显的影响。培养基 pH调节方法：用酸碱溶液中和法；使用缓 冲溶液法；使用生理缓冲剂；
发酵工业种子制备 ③通气搅拌
二 影 响 种 子 质 量 的 因 素
溶解氧的作用：参与菌体呼吸作用; 搅拌：促进氧的溶解与营养物质及代谢产物 的扩散。 通气量的多少以溶解氧的多少来衡定。 通气过程中，影响溶解氧的因素： 菌种； 培养基性质； 培养阶段； 发酵罐的结构；
发酵工业种子制备 ④泡沫：
二
危害：影响微生物对氧的吸收；妨碍CO2的 影 排除；减少设备利用率（有效容积减少）； 响 种 造成跑料，导致染菌；
5发酵种子制备与发酵机制知识课件
❖ 大量地接入培养成熟的菌种的优点：
➢ 缩短生长过程的延缓期，因而缩短了 发酵周期，提高了设备利用率
➢ 节约发酵培养的动力消耗 ➢ 有利于减少染菌机会
放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的种龄对多糖产量的影响
（舒琴）
镜检：24小时多个杆菌首位相连成线形，处于繁殖旺盛期 30小时开始出现芽孢
➢ 固体培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏 瓶、培养皿等麸皮培养。
实验室阶段种子培养物选择的原则
A. 目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最 终的培养物可分为两类：
对于不产孢子和芽胞的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体
对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培 最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培 养。
在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面
发酵级数确定方法
菌种的性质(如菌种传代后的稳定性) 瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度 发酵罐中种子培养液的最低接种量 种子罐与发酵罐的容积比 生产规模 随工艺条件的改变作适当的调整
二.种子质量的判断方法
❖ 通常检测的培养液中参数 ➢ pH是否在种子要求的范围之内 ➢ 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 ➢ 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 ➢ 有无杂菌污染
0.025% 0.015%
薯干粉
成分
麦芽汁 薯干粉 (NH4)2SO4 琼脂
斜面 麦汁
2%
种子罐 发酵
10% 22-28% 0.5%
种子制备过程举例
一、谷氨酸生产的种子制备 制备过程 斜面菌种 →一级种子培养 →二级种子培养
→发酵
1、斜面
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2
发酵工程-种子制备38页
种子制备过程
实验室种子制备阶段：琼脂斜面至 固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜 面培养等或液体摇瓶培养
生产车间种子制备阶段：种子罐扩 大培养
实验室种子制备
无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成 熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶。
菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅 速，可用固体培养基培养孢子
种子罐级数的确定
种子扩大的级数：制备种子需逐级扩 大培养的次数 级数愈少，愈利于简化工艺及控制， 并可减少种子罐污染杂菌的机会，减 少消毒及值班工作量，减少因种子罐 生长异常而造成的发酵波动。
确定方法
菌种的性质(如菌种传代后的稳定性) 瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度 发酵罐中种子培养液的最低接种量 种子罐与发酵罐的容积比 生产规模 随工艺条件的改变作适当的调整
本章内容：
种子制备原理与技术 影响种子质量的因素 种子质量的控制措施 种子制备的放大原理与技术
ห้องสมุดไป่ตู้
种子制备原理与技术
优良种子应具备的条件 生长活力强，延迟期短； 生理状态稳定； 浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求； 无杂菌污染，保证纯种发酵； 适应性强，生产能力稳定
培养温度
温度过低，菌种生长发育缓慢 温度过高会使菌丝过早自溶
在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时， 孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨
基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。
湿度
湿度低，孢子生长快； 湿度大，孢子生长慢
制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时 发现，在含有少量水分的试管斜面培养基下 部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速 蒸发呈干瘪状，孢子稀少
种子质量的判断方法
通常检测的培养液中参数 pH是否在种子要求的范围之内 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 有无杂菌污染
发酵工程种子制备
酵母发酵时的种子扩大培养
酿酒酵母的扩大培养
最初采用纯种进行酵母发酵并设计出 酵母繁殖流程，他将每一步的接种量 规定为10％，并控制繁殖条件与酿造 时一致
现代的流程中，接种量为1%或更低， 控制的条件也与酿造时不同。
面包酵母时的种子扩大培养的程序
丝状真菌发酵的种子扩大培养
丝状真菌既可以利用孢子，也可以
菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用摇 瓶液体培养法
不产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度 下活化即可
种子扩大培养阶段
液体培养法：液体试管、三角瓶摇床 振荡或回旋式培养。 表面培养法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盘 培养。 固体培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏 瓶、培养皿等麸皮培养。
生产车间种子制备
丝状真菌的菌丝体作为接种物
不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作 为接种物，如生产赤霉素的菌种—— 藤仓赤霉
问题：难以获得均一的接种物
接种前将菌丝打成碎片，形成大量的 菌丝段，它具有大量的生长点
放线菌发酵时的种子扩大培养
斜面培养，制备孢子悬浮液作初级 种子 可用培养摇瓶菌丝体作为初级种子
种子制备过程
实验室种子制备阶段：琼脂斜面至 固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜 面培养等或液体摇瓶培养
生产车间种子制备阶段：种子罐扩 大培养
实验室种子制备
无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成 熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶。 菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅 速，可用固体培养基培养孢子
种子液生化分析项目主要有：营养基质的消 耗速度、pH变化、溶氧变化、色泽和气味等
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子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子。 接种：①从母斜面上点接种，选取生长好的单 菌落 ②接种时密一点，得到大量的孢子。
孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月
（三）生产车间种子制备阶段
在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量 的菌丝体。
菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果
3、接种量的确定
移入种子的体积 接种量 ＝ —————————
接种后培养液的体积
❖ 接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细胞增加等， 发酵后劲不足
❖ 种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而且易造成染菌 ❖ 以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据 ❖ 接种量的大小直接影响发酵周期
4、种龄
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子 罐或发酵罐时的培养时间。
三、种子质量的判断方法
❖ 通常检测的培养液中参数
➢ pH是否在种子要求的范围之内 ➢ 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 ➢ 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 ➢ 有无杂菌污染
❖ 其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾 气等
四、种子制备技术概要
❖ 步骤：
➢ 斜面培养基中活化； ➢ 扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完成实
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
一级种子接入发酵罐发酵称为二级发酵 二级种子接入发酵罐发酵称为三级发酵
。。。。。。。
依次类推 可知发酵的级数=种子级数+1
• 种子罐级数的意义： 种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，
并可减少移种带来染菌机会。 但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，
缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间， 以提高发酵罐的生产率。因此，种子罐级数不宜 过少。
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。
在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面
发酵工业的种子制备
种子制备原理与技术 影响种子质量的因素 种子质量的控制措施 种子制备放大技术实例
种子制备原理与技术
一、概述 二、种子罐级数的确定 三、种子质量的判断方法 四、种子制备技术概要
一、概述
种子培养的概念
➢ 是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态 的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶或 扁瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量 和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。
（二）实验室种子制备阶段
目的：将种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的 培养物可分为两类：
对于不产孢子和芽孢的微生物
——获得一定数量和质量的菌体
对于产孢子的微生物 ➢ 获得一定数量和质量的孢子
——菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定 的种子，但操作繁琐。
➢ 获得一定数量和质量的菌丝体
培养基选择的原则
在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般 比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原 料一般都比较精细。
2、起始接种物的传代问题
细菌
保藏斜面 → 活化斜面
产孢子
保藏 → 母斜面 → 子斜面
目的：使菌种的传代次数尽可能的少。
孢子培养
母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。 所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。
种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大培养的次数 级数愈少，愈利于简化工艺及控制，并可减少种子 罐污染杂菌的机会，减少消毒及值班工作量，减少 因种子罐生长异常而造成的发酵波动 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级
确定方法
菌种的性质(如菌种传代后的稳定性) 瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度 发酵罐中种子培养液的最低接种量 种子罐与发酵罐的容积比 随产物的品种及生产规模而定 随着工艺条件的改变作适当的调整
验室种子制备 ➢ 一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩大级
数，完成生产车间种子制备； ➢ 种子转种至发酵罐
（一）种子制备过程
❖ 实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇
床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌 种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段 的种子培养。
❖ 生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在
工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为 生产车间阶段。
实验室准备阶段
生
产
车
间
阶
放罐，后处理
段
产品
种子扩大培养的原因 工业生产规模的增大 种子的扩大培养
需要种子就增多
种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的 培养物，还要获得活力旺盛的、性能稳定、接种 数量足够的、纯的培养物。
菌种的活化与种子的扩大培养的区别？
——便于操作，但需要更仔细的控制。
1、培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培 养基应该是有利于孢子的生长。
❖ 菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅速，可用固体 培养基培养孢子
❖ 菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用摇瓶液体培养法 ❖ 不产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度下活化即可
种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。
原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对 较大，但是最终由实验结果定。
大量地接入培养成熟的菌种的优点：
➢ 缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期， 提高了设备利用率
➢节约发酵培养的动力消耗 ➢有利于减少染菌机会
在放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响
15L种子发酵罐
300L啤酒发酵罐
种子扩大培养的目的
➢接种量的需要 ➢菌种的驯化； ➢缩短发酵时间、保证生产水平
优良种子应具备的条件
➢生长活力强，延迟期短； ➢生理状态稳定； ➢浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求； ➢无杂菌污染，保证纯种发酵； ➢适应性强，生产能力稳定
二、种子罐级数的确定
1、培养基选择的原则
培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌 体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。
在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接 近于发酵培养基，这有两个方面的原因:
一是成本
二是驯化
2、发酵级数的确定
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时， 工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。
孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月
（三）生产车间种子制备阶段
在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量 的菌丝体。
菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果
3、接种量的确定
移入种子的体积 接种量 ＝ —————————
接种后培养液的体积
❖ 接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细胞增加等， 发酵后劲不足
❖ 种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而且易造成染菌 ❖ 以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据 ❖ 接种量的大小直接影响发酵周期
4、种龄
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子 罐或发酵罐时的培养时间。
三、种子质量的判断方法
❖ 通常检测的培养液中参数
➢ pH是否在种子要求的范围之内 ➢ 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 ➢ 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 ➢ 有无杂菌污染
❖ 其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾 气等
四、种子制备技术概要
❖ 步骤：
➢ 斜面培养基中活化； ➢ 扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完成实
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
一级种子接入发酵罐发酵称为二级发酵 二级种子接入发酵罐发酵称为三级发酵
。。。。。。。
依次类推 可知发酵的级数=种子级数+1
• 种子罐级数的意义： 种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，
并可减少移种带来染菌机会。 但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，
缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间， 以提高发酵罐的生产率。因此，种子罐级数不宜 过少。
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。
在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面
发酵工业的种子制备
种子制备原理与技术 影响种子质量的因素 种子质量的控制措施 种子制备放大技术实例
种子制备原理与技术
一、概述 二、种子罐级数的确定 三、种子质量的判断方法 四、种子制备技术概要
一、概述
种子培养的概念
➢ 是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态 的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶或 扁瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量 和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。
（二）实验室种子制备阶段
目的：将种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的 培养物可分为两类：
对于不产孢子和芽孢的微生物
——获得一定数量和质量的菌体
对于产孢子的微生物 ➢ 获得一定数量和质量的孢子
——菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定 的种子，但操作繁琐。
➢ 获得一定数量和质量的菌丝体
培养基选择的原则
在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般 比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原 料一般都比较精细。
2、起始接种物的传代问题
细菌
保藏斜面 → 活化斜面
产孢子
保藏 → 母斜面 → 子斜面
目的：使菌种的传代次数尽可能的少。
孢子培养
母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。 所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。
种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大培养的次数 级数愈少，愈利于简化工艺及控制，并可减少种子 罐污染杂菌的机会，减少消毒及值班工作量，减少 因种子罐生长异常而造成的发酵波动 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级
确定方法
菌种的性质(如菌种传代后的稳定性) 瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度 发酵罐中种子培养液的最低接种量 种子罐与发酵罐的容积比 随产物的品种及生产规模而定 随着工艺条件的改变作适当的调整
验室种子制备 ➢ 一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩大级
数，完成生产车间种子制备； ➢ 种子转种至发酵罐
（一）种子制备过程
❖ 实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇
床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌 种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段 的种子培养。
❖ 生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在
工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为 生产车间阶段。
实验室准备阶段
生
产
车
间
阶
放罐，后处理
段
产品
种子扩大培养的原因 工业生产规模的增大 种子的扩大培养
需要种子就增多
种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的 培养物，还要获得活力旺盛的、性能稳定、接种 数量足够的、纯的培养物。
菌种的活化与种子的扩大培养的区别？
——便于操作，但需要更仔细的控制。
1、培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培 养基应该是有利于孢子的生长。
❖ 菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅速，可用固体 培养基培养孢子
❖ 菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用摇瓶液体培养法 ❖ 不产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度下活化即可
种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。
原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对 较大，但是最终由实验结果定。
大量地接入培养成熟的菌种的优点：
➢ 缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期， 提高了设备利用率
➢节约发酵培养的动力消耗 ➢有利于减少染菌机会
在放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响
15L种子发酵罐
300L啤酒发酵罐
种子扩大培养的目的
➢接种量的需要 ➢菌种的驯化； ➢缩短发酵时间、保证生产水平
优良种子应具备的条件
➢生长活力强，延迟期短； ➢生理状态稳定； ➢浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求； ➢无杂菌污染，保证纯种发酵； ➢适应性强，生产能力稳定
二、种子罐级数的确定
1、培养基选择的原则
培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌 体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。
在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接 近于发酵培养基，这有两个方面的原因:
一是成本
二是驯化
2、发酵级数的确定
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时， 工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。