制备感受态细胞
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法2、感受态细胞不好用的原因3、影响转化效率的原因4、为何要低温环境制备1. 感受态定义：细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态(compete nee)。
作用：如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一一种短暂的感受态以摄取外源DNA感受态的目的是增加细胞的通透性，以便外源基因进入宿主细胞，实现转化的目的。
优点是细胞膜通透性增大，方便大分子的进入。
意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞，完成实验。
常用制备方法：细菌感受态少量制备法(CaCb法)、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等详见《基因工程实验指导》p153-157.2. 感受态细胞做得不好的原因一.菌液0D直偏大或偏小二.原始菌株不好三.试剂超纯程度不够四．操作时对菌体伤害过大3. 影响转化效率的原因1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度, 尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600 来控制.DH5 a菌株OD600为时细胞密度是5X 107/ml ）;2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经CaCl2 处理的细胞, 在低温条件下, 一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24 小时达到最高, 之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4. 化合物及无机离子的影响：在Ca2啲基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000 倍）；5. 所使用的器皿必须干净. 迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6. 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；7. 一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；4.为何要低温环境制备在制备过程中, 细胞膜通透性增大而变得脆弱, 低温能提高感受态细胞存活率. 所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡.如果放于-20 C保存，时间长了细胞内部液化度较高的情况下，细胞会由于流动性的原因造成不可逆损伤，甚至死亡。
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理是通过采用特定的培养条件和处理方法，使细胞转变为感受态细胞。
感受态细胞与其它类型的细胞相比，具有更特殊的功能和形态。
首先，制备感受态细胞通常需要选择合适的细胞系或细胞株作为起始材料。
这些细胞通常具有一定的可塑性和多能性，可以通过适当的诱导和处理转变为感受态细胞。
其次，制备感受态细胞需要提供一系列的培养条件，以满足细胞生长和分化的需要。
这包括提供适当的培养基组成、生长因子、细胞外基质支持等。
适当的培养条件可以促进细胞内信号传导途径的激活，从而触发感受态细胞的形成。
另外，制备感受态细胞的过程中还需要使用一些特定的诱导因子或化合物。
这些诱导因子可以通过激活或抑制特定的信号通路，调节细胞的基因表达和功能，从而诱导细胞转变为感受态细胞。
最后，制备感受态细胞还需要进行一系列的分析和鉴定，以确定细胞是否成功转化为目标细胞。
这包括检测特定标志物的表达、观察细胞形态学的改变、进行功能性实验等。
总之，制备感受态细胞的原理是通过选择合适的起始材料、提供适宜的培养条件、使用特定的诱导因子以及进行分析鉴定等步骤，将细胞转变为目标的感受态细胞。
这个过程涉及到多个层面的调控和影响，需要综合考虑细胞的内外环境因素。
wb800n感受态制备方法
制备感受态细胞的方法制备感受态细胞是分子生物学实验中常见的一项技术，用于将外源 DNA 导入细胞中，并在细胞内表达。
制备感受态细胞的方法有很多种，其中最常用的是氯化钙法和电转化法。
1. 氯化钙法氯化钙法是制备感受态细胞的常用方法之一。
该方法的原理是利用氯化钙处理细胞，使细胞膜通透性增加，从而使外源 DNA 能够进入细胞内。
操作步骤如下：1) 将细胞菌落挑取到含有氯化钙的缓冲液中，并在室温下处理10-20 分钟。
2) 将处理后的细胞放入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。
3) 将培养后的细胞收集到离心管中，并离心沉淀。
4) 去除上清液，将沉淀物加入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。
5) 重复步骤 3 和 4，直至细胞达到适当的浓度。
2. 电转化法电转化法是另一种制备感受态细胞的方法，该方法的原理是利用电场将外源 DNA 导入细胞内。
操作步骤如下：1) 将细胞菌落挑取到含有适当抗生素的培养基中，并在37°C下培养 1-2 小时。
2) 将处理后的细胞放入电转化仪中，并施加适当的电场。
3) 将细胞暴露在外源 DNA 中，并在室温下处理 10-20 分钟。
4) 将处理后的细胞放入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。
5) 重复步骤 3 和 4，直至细胞达到适当的浓度。
在制备感受态细胞的过程中，需要注意以下几点：1) 氯化钙法和电转化法的操作步骤较为复杂，需要严格遵守操作规程。
2) 制备感受态细胞时，需要选择适当的抗生素，以避免细胞污染。
3) 在进行电转化时，需要选择适当的电场强度和处理时间，以避免细胞损伤。
4) 制备完成后，需要对感受态细胞进行鉴定，以确保其能够表达外源 DNA。
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理1. 什么是感受态细胞1.1 定义感受态细胞，听起来像是个高大上的名词，其实就是那些“准备好”接受外界信息和刺激的细胞。
想象一下，像个随时待命的服务员，时刻准备接待客人。
细胞的这种状态，通常是在特定的环境下，通过某些方法处理后形成的。
1.2 重要性为什么要制备感受态细胞呢？这可是生物实验中的关键一步！它们能帮助我们进行基因转化、疫苗研究，甚至是药物开发。
就像一个关键的道具，缺了它，很多实验都没法顺利进行。
2. 如何制备感受态细胞2.1 基本步骤制备感受态细胞的过程其实并不复杂，简单来说就是要让细胞放松心情，准备好接受外来的DNA。
首先，我们需要把细胞放在一个低温环境下，这就像给它们一个凉爽的SPA，让它们变得“懒洋洋”的。
接着，添加一些化学试剂，比如氯化钙，这些化学试剂可以帮助细胞的膜变得更容易接受外来的DNA，哇，真是神奇！2.2 处理时间然后，细胞要在这个特殊的环境中待一段时间，让它们完全“感受”这个过程。
通常，我们会让它们静置一小时左右，这段时间就像让一个小孩在游乐场里玩耍，兴奋而又期待。
当时间到了，嘿！细胞已经准备好迎接挑战了。
3. 实际应用3.1 科研领域在科研领域，感受态细胞的应用真是无处不在。
比如，科学家们可以将新的基因片段导入这些细胞中，看看它们会发生什么样的变化。
就像给一个平凡的角色增加超能力，结果往往出乎意料，有时候能发现新的疾病机制，有时候能找到新的治疗方法，简直就是科研的“黑科技”！3.2 工业应用当然，感受态细胞的应用不仅限于实验室，它们在工业上也大显身手。
比如，利用这些细胞生产蛋白质，甚至是药物，提升生产效率，降低成本，简直是企业的“秘密武器”。
有了它，企业就能在竞争中抢占先机，像个抢眼的明星一样脱颖而出。
总之，感受态细胞的制备虽然听起来复杂，但只要掌握了窍门，便能游刃有余。
它不仅是生物学研究的基础，更是现代科技进步的重要推动力。
就像一首动听的乐曲，细胞的“感受态”是其中不可或缺的音符。
感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞的制备是一项非常重要的实验技术，可应用于许多研究领域，如分子生物学、农药毒理学、农业植物保护等。
一般来说，将培养细胞转化为感受态细胞，可以有三种方法：
1、皮下注射引起的感受态细胞制备。
由于它是一种经典的制备方法，大多数细胞都可以使用。
其核心步骤是将小量液体注入传感源头(如病毒、菌株、多糖、细菌等)皮下。
这种技术可以帮助人们制备特定种类的感受态细胞，并且可以控制病毒的感染率。
2、利用细胞克隆引起的感受态细胞制备。
这种方法涉及到使用不同种类的细菌或病毒及其克隆进行感染。
一旦细胞受感染，感受态细胞就会形成。
此外，通过诱变基因表达等方式，也可以制备出不同感受源的感受态细胞。
3、利用小分子引起的感受态细胞制备。
小分子技术中的最新研究主要集中在核酸抑制剂、蛋白质结合蛋白、信号转导调节剂等。
这些小分子可以直接结合到感受细胞的特定分子，从而影响其功能，抑制或促进感受细胞的形成。
以上是三种感受态细胞制备的方法，它们均可用于解析某一特定基因或基因产物在细胞功能中的作用。
此外，这些技术还可用于识别及检测特定感受源，并评价其对细胞株功能的影响程度。
另外，它们还可用于发现新型抗病毒剂，以提高植物抗病能力。
因此，感受态细胞的制备实验在诸多方面都具有重要的意义，值得继续探索。
感受态细胞的制备
感受态细胞的制备（Hanahan法）什么是感受态细胞？野生型E.coli并不容易转化，这是由于细菌产生一种酶能迅速降解进入的外源DNA。
经过多年的努力，科学家们发现了一种方法可以增加细胞吸收外源DNA的效率。
那就是用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。
这种细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。
制备的关键因素：1.所用转化缓冲液的试剂纯度用高纯度的水和二甲亚砜（DMSO）制备感受态细胞是最重要的，包括细菌培养基在内的某些试剂会随着储存期的延长而降低效能。
无论何时，尽可能用新买的试剂和生长培养基。
2.细菌的生长状态由于未知的原因，最高的转化效率总是用从直接取自冻存于-70℃的储备菌中直接培养获得的，因此，不应该使用在实验室连续传代或存放于4℃或室温的培养物。
3.玻璃和塑料器皿的清洁微量的洗涤剂或其他化学物质会大幅的降低细胞转化效率，因此最好建立一批只用于制备感受态细胞而不用于其他目的玻璃容器，这些玻璃器皿应用手来刷洗，并且用纯水（Mini-Q 或相当的水）充满，再经高温高压消毒。
水在玻璃器皿使用前应倒掉。
注意：很多手工操作后用来消毒的塑料器皿和滤膜上是含有严重影响转化效率的洗涤剂的。
材料缓冲液和溶液二甲亚砜DMSODnD溶液（DMSO和DTT）DTT（二硫苏糖醇）1.53gDMSO 9ml1mol/L乙酸甲（PH7.5）100μl 加水补至10mlDnD溶液可用耐受有机溶剂的Millex SR膜（Millipore）过滤除菌，将DnD溶液分装成160μl小份放入0.5ml的无菌微量离心管中，密封管口，贮存于-20℃。
转化缓冲液标准的转化缓冲液（TFB）现用现配。
冻存的缓冲液（FSB）用来冻存（-70℃）感受态细胞培养基SOB琼脂板含20mmol/L（标准的含量为10)硫酸镁和适量的抗菌素SOB培养基含20mmol/L（标准的含量为10)硫酸镁SOC培养基每次转化反应需要1ml的SOC培养基核酸和寡核苷酸质粒DNA（重组质粒）离心机和转头Sorvall GSA转头或与之相当的转头专用设备液氮预冷的聚丙烯离心管（50ml）预冷的聚丙烯离心管（17*100mm；Falcom2059）预置的40℃水浴载体和菌种冻存的做转化用的大肠杆菌（该菌种需在-70℃下保存）方法和步骤（重要：本方案中的所有步骤均应在无菌条件下进行）细胞制备1.转化缓冲液的制备若制备立即使用的感受态细胞可用FTB。
感受态细胞的制备与转化实验报告
感受态细胞的制备与转化实验报告
一、实验目的
本实验旨在探究感受态细胞的制备和转化过程，以及相关技术操作和注意事项。
二、实验步骤
1. 制备感受态细胞
（1）取出培养皿内的细胞，用PBS洗涤3次；
（2）将洗涤后的细胞加入含有5μM Calcein-AM的PBS中，放置于37℃孵育箱内30分钟；
（3）取出孵育后的细胞，用PBS洗涤3次，即可得到感受态细胞。
2. 转化感受态细胞
（1）将制备好的感受态细胞加入含有荧光素酶底物的培养基中；
（2）放置于37℃孵育箱内15分钟左右；
（3）观察荧光素酶底物是否被转化为荧光素，并记录转化效率。
三、实验结果与分析
经过制备和转化处理后，观察到感受态细胞成功地被转化为荧光素，
并且转化效率较高。
这表明该方法可以有效地制备和转化感受态细胞，并且具有较高的可靠性和重复性。
四、实验注意事项
1. 实验过程中应注意无菌操作，避免细菌和其他杂质的污染；
2. 在制备感受态细胞时，应注意洗涤次数和荧光素酶底物的浓度，以
确保制备的感受态细胞质量和转化效率；
3. 在转化感受态细胞时，应注意荧光素酶底物的加入量和反应时间，
以确保转化效率和荧光素的稳定性。
五、实验结论
本实验通过制备和转化处理，成功地得到了荧光素转化后的感受态细
胞，并且转化效率较高。
这为进一步研究感受态细胞在生物学领域中的应用提供了可靠的技术支持。
感受态细胞的制备过程
感受态细胞的制备感受态细胞也叫敏感细胞，它的细胞壁通透性增大，外界物质容易感染进去细胞体里。
目前常用感受态细胞（大肠杆菌）转染质粒载体，而感受态细胞的制备通常是利用0.1M的CaCL来处理，从而让大肠杆菌的细胞壁的通透性增大。
以下为制备感受态细胞的过程：一、试剂：Bacto tryptone (SIGMA Lot. 10k0202)Bacto Yeast Extract (SIGMA Lot. 60k0044)KCL (SIGMA Lot. 129h0080)NaCL (GB 1266-86 AR 广东台山粤侨化工厂)NaOH (GB/T629-1997 AR 广州化学试剂厂)MgSO4.7H2O (GB/T671-1998 AR 广州化学试剂厂)CaCL2（HGB3208-60 AR 广东西陇化工厂）甘油 99+% （SIGMA Lot. 119h0206）二、玻璃器皿：2000ml烧杯（1个）、1000ml量筒（1个）、2.8L三角培养瓶（2个）2L三角培养瓶（3个）、250ml离心管（12个）、试剂瓶（3个）、100ml量筒（1个）、75%酒精棉球三、前处理：配制1N的NaOH与10%SDS（十二烷基苯磺酸钠），对于实验过程中所有用到的玻璃器皿都用1N的NaOH进行泡洗，然后用自来水清洗干净NaOH,再用10%SDS清洗，最后用自来水冲洗7-8遍，并用ddH2O清洗3遍。
四、SOB培养基配方及配制：在本实验中，对于NaCL与KCL、Mg2+等不用母液加，是因为考虑到母液是以前配制，瓶子以及水等都没处理好，故在此实验中是以固体状加进去。
用NaOH调PH7.0，然后定容至3000ml，取40ml培养基装到100ml小三角瓶里作种子液用，其它分装到大三角瓶里（750ml/瓶），称重量并标志。
于1210C灭菌40min。
等温度冷却下来后，对试剂与培养基都进行称重，根据重量差进行补水（灭菌）。
21、1M CaCL2的配制（500ml）：称取CaCL255.49g，溶于ddH2O,定容至500ml，再于0.22μ滤膜上过滤除杂质。
感受态细胞的制备与连接产物转化克隆菌株
连接产物的转化效率
转化效率
指单位质量的感受态细胞转化后，能够成功克隆的重组子数量。
影响因素
转化效率受到多种因素的影响，如感受态细胞的制备方法、连接产物的质量和浓度、转化条件等。为了提高转化 效率，需要优化这些因素，并确保感受态细胞的质量和活性。
03 克隆菌株的转化与筛选
转化过程
01
02
03
准备感受态细胞
连接产物浓度
确保连接产物浓度适中，过高或过低都会影响转化效率。
连接产物纯度
去除连接产物中的杂质，如未连接的DNA片段和蛋白质等。
克隆菌株的稳定性与可重复性
克隆稳定性
克隆菌株应稳定，不易发生变异或丢失目的基 因。
可重复性
确保实验结果可重复，避免因菌株变异或其他 未知因素导致的结果不一致。
菌株筛选
对转化后的菌株进行筛选，选择阳性克隆进行后续实验。
优点
方法简单，不需要特殊试剂。
缺点
转化效率相对较低，且不同菌株的感受态制备效果不一致。
人工感受态细胞的制备
人工感受态细胞制备方法
通过化学或电穿孔法处理细菌，使其进入感受态。常用的化学试剂包括CaCl2、DMSO 等。
优点
转化效率高，适用于大多数细菌。
缺点
需要特殊试剂，操作相对复杂。
02 连接产物转化
感受态细胞的制备态细胞的制备 • 连接产物转化 • 克隆菌株的转化与筛选 • 实验注意事项与难点解析
01 感受态细胞的制备
自然感受态细胞的制备
自然感受态细胞制备方法
将细菌在冰冷的0.1M CaCl2溶液中洗涤并悬浮，然后在42℃下热 激处理，使细菌进入感受态。
将细菌培养至对数生长期， 离心收集并用冰冷的0.1M CaCl2洗涤。
感受态细胞制备的方法
感受态细胞制备的方法
感受态细胞的制备方法有多种，其中一种常用的方法是通过转染的方式将特定的基因（例如感受器基因）导入目标细胞中，从而使得这些细胞能够表达特定的感受器或相关蛋白。
这种方法可以使用病毒载体、质粒转染等多种技术实现。
感受态细胞的制备主要有以下步骤：
1. 获取目标细胞：从人体组织或动物模型中获取需要制备感受态细胞的细胞。
2. 选择合适的载体：根据研究需要选择适合的载体，如病毒载体或质粒。
3. 构建转染载体：将目标基因插入到载体中，构建转染载体。
4. 转染目标细胞：将转染载体导入目标细胞中，使其表达特定的感受器或相关蛋白。
5. 筛选稳定表达细胞：通过特定的筛选方法，筛选出稳定表达目标基因的细胞。
6. 验证感受态细胞的功能：通过功能实验等方法验证感受态细胞的功能。
感受态细胞制备的方法可以提供研究人员一个有效的工具，用于研究特定感受器或相关蛋白在生物体内的功能和调控机制。
这些细胞可以用于药物筛选、疾病研究和基因治疗等领域，有助于深入了解感受机制，并为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和途径。
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理
感受态细胞的制备原理是通过刺激细胞或组织，使其产生特定的感受态反应。
下面将介绍两种常见的制备感受态细胞的方法：
1. 免疫刺激法：免疫刺激是一种常见的制备感受态细胞的方法。
它通过注射外源性抗原或感兴趣的抗原到实验动物体内，刺激其免疫系统产生针对该抗原的免疫应答。
随后，从动物体内获得淋巴细胞或单个免疫细胞，并进行分离和培养。
在适当的刺激条件下，这些细胞会分化为感受态细胞，表达特定的受体和效应分子。
2. 细胞诱导法：细胞诱导法是一种将一种细胞类型转化为另一种感受态细胞的方法。
通过适当的生理或外部信号，诱导细胞发生转变，从而获得感受态细胞。
例如，通过改变细胞培养基的成分和配比，或添加特定的生长因子和信号分子，可以使一些细胞从一种特定状态转变为特定的感受态细胞。
而在实现这些方法时，需要注意实验条件的细节，确保刺激物的浓度和持续时间、培养基的组分和条件等都符合特定的要求。
此外，在实验过程中需要使用适当的实验技术和方法对细胞进行监测和鉴定，确保制备得到的是目标感受态细胞。
CaCl2法制备感受态细胞
Ⅰ、CaCl2法制备感受态细胞
1、挑取37℃培养16—20h的单菌落（直径2—3mm）于含有100mlLB或SOB 的500或1000ml的三角瓶中，剧烈振荡培养3h至OD值为0.2—0.4（据文献大肠杆菌DH5α菌株培养物OD值为0.2—0.4时，约含109个菌/ml；
2、转移菌体至无菌、一次性冰冷的50ml聚丙烯离心管内。
将离心管内培养物放置于冰上10min，以使其冷却至0℃；
3、将离心管内培养物4℃，4000rmp，10min以收集菌体；
4、弃去上清培养基，并颠转离心管放于一叠吸水纸上1min，吸取多余培养基；
5、用30ml冰冷MgCl
2—CaCl
2
溶液（80mMMgCl
2
和20mMCaCl
2
）漩涡振荡重悬
菌体沉淀，置于冰上10min；
6、将离心管内培养物4℃，4000rmp，10min以收集菌体；
7、弃去上清培养基，并颠转离心管放于一叠吸水纸上1min，吸取多余培养基；
8、用2ml冰冷0.1MCaCl
2溶液（2ml冰冷0.1MCaCl
2
/50ml原初培养物）漩涡
振荡重悬菌体沉淀；
9、放于4℃冰箱14-20h。
获得的感受态细胞即可直接用于转化或添加甘油至终浓度10%，分装离心管内（150-200μl），存于-70℃。
感受态细胞制备流程
感受态细胞制备流程感受态细胞制备流程，这是一个非常复杂和精确的过程，涉及到许多实验室技术和设备。
感受态细胞是指在特定的刺激下，可以触发细胞产生反应的细胞状态。
感受态细胞的制备可以用于研究许多生物学过程，如细胞信号传导、疾病机制等。
下面是一个常见的感受态细胞制备的流程：1.细胞培养首先，需要准备细胞培养基和细胞培养器皿。
细胞培养基是提供营养物质和条件来维持细胞生长和增殖的液体。
培养器皿选择取决于所使用的细胞类型和实验的要求。
然后，将细胞接种到培养器皿中，并在恒定的温度和湿度下进行培养。
2.细胞处理一旦细胞生长到足够数量，可以开始进行细胞处理。
这可以包括刺激细胞，例如添加化学物质、压力或温度变化。
刺激过程需要精确控制，以确保得到一致的结果。
3.细胞取样在细胞处理后，需要进行细胞取样。
这可以通过用吸管或毛细管吸取细胞悬浮液来实现。
取样过程需要快速和准确，以确保细胞状态的准确性。
4.细胞固定取样后，细胞需要固定以保持其形态和结构。
常用的细胞固定方法包括用甲醛或乙醛等化合物进行固定。
细胞固定可以帮助保留细胞结构和细胞内分子，以便后续的染色或分析。
5.染色和标记对固定的细胞进行染色或标记是感受态细胞制备的关键步骤。
染色和标记可以使用各种荧光染料或抗体来实现。
这可以通过将染料或抗体直接添加到细胞上，或使用转染技术将其引入细胞内。
6.显微镜观察完成染色和标记后，可以使用显微镜来观察细胞。
显微镜观察可以提供关于细胞形态和结构的信息，并且可以检测到染色或标记物的荧光。
这可以帮助研究人员获得有关感受态细胞的更多信息。
7.数据分析和解读最后，需要对得到的数据进行分析和解读。
这可能涉及到图像处理、统计学方法和生物学解释等。
数据分析和解读的目的是从实验结果中提取有意义的信息，并为后续的研究和应用做出贡献。
感受态细胞制备的流程是一个需要仔细和精确操作的过程。
任何一个步骤的错误或偏差都可能导致不准确的结果。
因此，研究人员需要具备高度的实验技能和实验室安全意识。
1.CaCl2法制备感受态细胞(分子克隆)
2007-4-19 健康科学研究所 B细胞与自身抗体研究组 刘占杰CaCl2法制备感受态细胞1、划线（无选择性LB-Agar平板），37℃培养16-20h；2、挑单菌落到2ml LB培养液中，37℃,300rpm摇菌过夜；；3、取1ml过夜菌液到100ml LB培养液中，37℃,300rpm摇菌约3hr，检测OD600nm about 0.44、将菌液转移到50ml BD管中，冰上放置10min；5、4℃，4000rpm，10min，倒出培养液，倒置1min；6、用0.1M CaCl2-MgCl2（80mmol/l MgCl2,20mmol/l CaCl2）溶液30ml重悬细胞沉淀,冰上30min；7、4℃，4000rpm，5min，到出培养液，倒置1min；8、用2ml预冷0.1M CaCl2-15％甘油重悬细胞沉淀，将其200μl／管分装到灭菌EP管中，冻存于-80℃。
附：0.1mol/l CaCl2： 100ml(1.1g 无水CaCl2＋100mlddH2O)高压除菌；0.1mol/l CaCl2-MgCl2: 150ml(2.439g MgCl2·6H2O, 0.333g 无水CaCl2＋150mlddH2O) 高压除菌；转 化1、-80℃ 取出感受态细胞，冰上融化，加入1μl（50ng）待转化质粒；2、冰上，30min（间隔震荡）；→42℃，90s（勿震荡）；→室温2min3、加入SOC或LB培养基800μl，37℃,50rpm(温柔摇菌)，50min；4、取200μl菌液涂板至液体完全被吸收，倒置平皿，37℃培养14-18h，观察菌落；质粒小抽(Beyotime)1、挑单菌落到3ml 选择性LB培养液中，37℃，225rpm，14-18h；2、收菌液到1.5ml EP管中，离心(RT 5000rpm 3min),弃上清，倒置于吸水纸上，使液体流尽；（重复一次，每管收集3ml菌液）3、用250ul溶液I预冷（保证P1已加RNase），Vortex重悬细胞；4、加溶液II 250ul，颠倒混匀4-6次，室温3min；5、加入350ul溶液Ⅲ，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生;6、最高速度离心(RT 14000rpm 10min)7、上清吸入到质粒纯化柱内,最高速离心60秒，倒弃收集管内液体；在质粒纯化柱内加入750ul溶液IV，最高速离心60秒，洗去杂质，倒弃收集管内液体；再最高速离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发;8、将质粒纯化柱置于1.5ml离心管上，加入50ul溶液V至管内柱面上(中央)，放置1min; 最高速离心1min，所得液体即为高纯度质粒。
感受态细胞制备
感受态细胞制备感受态细胞是一种在生物学研究中经常使用的用来感知外部信号的细胞类型。
这种细胞通过表达一系列感受态受体来响应外界刺激，从而产生不同的生物学效应。
因此，在研究细胞信号传导、生长因子作用机制、药理学等方面，感受态细胞被广泛应用。
本文将介绍感受态细胞的制备方法及其相关应用。
感受态细胞制备的方法有很多，其中最常见的包括转染法和稳定转染法。
转染法是将外源性DNA片段通过离子凝胶、酸化凝聚物、脂质体、电渗法、基因枪等方式导入到细胞中，使其表达目的基因。
而稳定转染法则是在转染的基础上添加反义RNA或抗性基因，以提高细胞对外源DNA的稳定性和表达强度。
在转染前，需要量化选择适当的转染试剂和细胞培养试剂，并根据具体的研究要求选用合适的转染工具。
除了转染外，还有一种较为实用的方法是利用CRISPR-Cas9基因编辑技术。
该技术可以精确的修改DNA序列，从而实现对细胞内基因的编辑和调控。
可以利用该技术直接构建感受态细胞或是对已有的细胞进行改造。
因此，该技术在制备感受态细胞中被广泛应用。
制备好的感受态细胞可以应用于多种研究领域。
其中，最常见的应用是通过感受态受体识别特定的分子信号。
在药理学中，感受态细胞经常被用来筛选新型药物，具有广泛的应用前景。
此外，通过对感受态细胞的研究，可以深入了解不同受体的结构、功能和信号传导途径，可以为开发治疗不同疾病的新药物提供基础。
总之，感受态细胞作为能够感应外界信号的特殊细胞类型，其在生物学研究中扮演着至关重要的角色。
制备和应用感受态细胞的方法及应用也在不断地发展和完善。
未来，随着人们对该领域的深入研究，感受态细胞的研究应用也将不断拓展。
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法
感受态细胞是一种特殊的细胞状态，可以用于研究细胞对外界刺激的感知和响应。
以下是一种常见的制备感受态细胞的方法：
1. 培养细胞：选择需要研究的感受态细胞类型，如神经元、免疫细胞等，在细胞培养基中培养细胞至合适的生长状态。
2. 刺激处理：给予细胞一定的外界刺激，如药物、光刺激、温度变化等。
刺激的剂量和时间可以根据具体研究目的进行调整。
3. 收集细胞：在刺激处理后，收集细胞，可以通过离心等方法使细胞沉积在培养皿底部或离心管中。
4. 提取RNA或蛋白质：利用相应的方法提取细胞中的RNA或蛋白质，用于后续分析。
5. 分析感受态：通过各种分析方法，如实时定量PCR、Western blot、流式细胞术等，检测特定的感受态标记物的表达水平或蛋白质修饰情况。
感受态细胞的制备方法可以根据具体研究目的和细胞类型的不同而有所差异，因此在实际操作过程中需要根据具体情况进行调整和优化。
（写作参考：）。
CaCl2法制备感受态细胞
E.coli感受态细胞的制备（CaCl2法）一、准备工作1．高压灭菌50毫升，15毫升离心管；180℃高温灭菌100毫升血清瓶7个，25毫升血清瓶1个，100毫升、20毫升量筒或容量瓶各1个，150毫升、50毫升烧杯各1个，摇菌用150毫升锥形瓶1个。
甘油灭菌。
10ml移液管3支。
高温灭菌1.5毫升离心管若干个，-80℃冰箱预冷。
2．制备不含氨苄的LB液体培养基500ml；制备不含氨苄的LB培养基平板1-3块。
3．配置1M KOH 和0.2 M醋酸以调节pH用。
4．制备针式过滤器2个，50ml、20ml 一次性注射器各一个。
5．冷冻离心机换50ml转子。
6．按下表配置TFB1、TFB2溶液。
严格按照下表配制TFB1和TFB2工作液，化学药品现称量，再调pH值，过滤除菌，放在冰上或冷后4℃储存。
当天现配现用。
100 ml菌液用30 ml TFB1工作液和4 ml TFB2工作液，按此比例类推。
二、操作步骤：全过程冰上操作，4℃离心，无菌操作。
第一天：划板。
挑取宿主菌，在AMP-的LB琼脂糖培养基平板上划线，37℃培养16h。
第二天：1、从过夜培养的不含氨苄的LB平板上挑单个大菌落，接种到5毫升LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养过夜。
第三天：2、按1：100将1ml培养物接种到100毫升不含氨苄、预热的LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养至OD600=0.45～0.5（约需2～2.5小时）。
3、0℃（冰上）预冷15分钟。
4、4000rpm，5分钟，4℃离心收集菌体。
弃上清，用15ml TFB1悬浮菌体（涡旋振荡）。
冰上放置90分钟。
准备高温灭菌过的1.5毫升离心管若干个，-80℃冰箱预冷。
(先用3ml的F1振荡悬浮再加入剩下的12ml)5、4000rpm，5分钟，4℃离心收集菌体。
弃上清，用2ml TFB2悬浮菌体（涡旋振荡）。
冰上放置15分钟。
6、按50ul/管，将细菌在冰上分装到预冷的离心管（1.5ml）中，扔入液氮速冻再拿出来转入-80℃冰箱储存。
感受态细胞的制备
感受态细胞的制备1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10mllb液体培养基的50ml离心管中。
（同时做培养基和枪头的空白对照）2.37℃，220rpm，培养14-16小时。
3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000mllb液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次od，当od值达到0.3-0.4时，停止培养。
4.将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。
离心5分钟后，向杯中加入少量H2O，然后以4000转/分的转速悬浮。
6.弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。
7.弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油,4℃,4000rpm,离心10min。
8.丢弃上清液，向每个离心杯中加入5毫升10%甘油，以暂停沉淀，然后将细菌溶液分装在1.5毫升离心管中，每管300微升，并储存在-80℃的冰箱中。
同时取100μL主管态加0.01ngpuc18直接电穿孔转化检测转化效率。
9.次日观察转化子生长情况，并记录。
二、连接产物纯化1.将连接产品转移至1.5毫米彭多夫管中，并添加以下试剂：10μlofddh2o2μlof3mnaac（ph5.2）50μl无水乙醇轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上；2.4℃，topspeed离心30分钟；3.小心清除上清液，避免接触管道底部的沉淀物；4.加入500μl70%的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）；5.4℃，topspeed离心5分钟；6.小心地去除上清液，并将Eppendorf管置于空气中，直到没有乙醇气味；7.将10μLddh2o重新溶解和沉淀，并在4℃下短期储存，在-20℃下长期储存；3、电转化1.从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；2.取1μL纯化质粒置于1.5ml离心管中，用0.1cm电极杯冰上预冷。
感受态细胞的制备
感受态细胞的制备一、准备工作所有试剂、容器均需提早预冷。
1、实验器械4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，超净台（使用前需要紫外消毒15min 至少）；0.22μm的滤器2个（过滤灭菌TfB2种溶液），10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管1盒，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml 锥形瓶2个，高压灭菌的100ml玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头与200μl枪头各一盒。
2、试剂配制（甘油特别难吸，用蓝枪头慢慢吸吧）① LB平板：单纯LB平板，加有amp或者有kana的（制板时需标注好类型，时间）。
② SOB培养基（Super Optimal Broth）③ TfBⅠ：（100ml制备量）分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl20.111g，置于200ml烧杯中，加入15ml甘油与85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃储存，使用前务必预冷。
（装在50ml离心管，封口4度储存）④ TfBⅡ（20ml制备量，每次现用现配，装在50ml离心管）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl20.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油与17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，使用前务必预冷。
配制量 1 L配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。
（50ml离心管分装）在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后，定容至100 ml。
2.配制2 M MgCl2溶液。
（50ml离心管分装）在90 ml去离子水中溶解4.06g MgCl2 6H2O后，定容至100 ml，高温高压灭菌。
5.量取10 m1 250 mM KCl溶液，加入到烧杯中。
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用Hanahan方法制备感受态细胞——高效转化
DMSO
DnD 溶液
转化缓冲液：
标准转化缓冲液：用于制备现用的感受态细胞
1M MES(pH6.3):将19.52过MES溶于80mL超纯水中，用KOH调节pH至6.3,用超纯水定容至100mL, 0.45um 孔径的滤膜过滤除菌，分成小份-20℃保存;
0.45um孔径的滤膜过滤除菌，分装后4℃保存。
冻存缓冲液（FSB）
1M KAc:将9.82g KAc90mL的超纯水中，用2M的醋酸将pH调至7.5，并用超纯水定容至100mL,分装成小份保存于-20℃;
0.4um 滤膜过滤，分装并保存于4℃（在保存过程中，pH会降低至6.1-6.2，之后就稳定在这个水平）
LB培养基
1．LB无抗培养基倒平板，划线培养大肠杆菌过夜;
2．挑取单菌落，接种至3mL的LB培养基中，37℃、250～300rpm/min培养6-8h；
3．将上述培养物接种至250mLLB培养基的1L三角瓶中，37℃振荡培养3h左右；
4．将培养物转移至无菌、预冷的离心管内，冰浴10min；
5．4℃2700g离心10min收集菌体；
6．弃去培养液，将离心管倒扣在吸水纸上吸干剩余液体；
7．每50mL培养物加20mL预冷的TFB或FSB重悬菌体（轻轻旋转，不要用振荡器或吹吸混匀）,冰浴10min；8．4℃2700g离心10min收集菌体；
9．弃去培养液，将离心管倒扣在吸水纸上吸干剩余液体；
10．每50mL培养物加4mL预冷的TFB或FSB重悬菌体；
11．现用：每4mL悬浮液加入140uL DnD溶液于细胞悬浮液中央，迅速轻轻混匀，冰浴15min;
再加入140uL DnD溶液于细胞悬浮液中央，迅速轻轻混匀，冰浴15min;
分装成小份至冰上保存；
-70℃冻存：每4mL悬浮液加入140uL DMSO溶液于细胞悬浮液中央，迅速轻轻混匀，冰浴15min;
再加入140uL DnD溶液于细胞悬浮液中央，迅速轻轻混匀，冰浴;
迅速将悬液分装到冷却的无菌微量离心管中，封紧管口，没入液氮中快速冰冻感受态细胞，贮存于-70℃备用。
制备感受态大肠杆菌的Inoue方法
——制备超级感受态细胞
采用Inoue方法制备的大肠杆菌感受态细胞在效果很好时可以达到Hanahan法的转化效率，而在标准的实验室条件下，一般可达到1*108~3*108个转化子/ug质粒DNA。
其优点在于不过分讲究细节，重复性更好，更有预见性。
缓冲液和溶液
DMSO(DMSO的氧化产物为二甲硫醚，是转化的抑制物，为避免这个问题，应使用高质量的DMAO)
Inoue转化缓冲液（水的有机污染会降低转化效率，使用前预冷至0摄氏度）
0.5M的PIPES(pH6.7):15.1g PIPES溶于80mL水中，KOH调节pH至6.7后定容至100mL，0.45um孔径的滤膜过滤除菌，分成小份-20℃保存;
Inoue转化缓冲液的配制：
0．45um孔径的滤膜过滤除菌，分装成小份-20℃保存
LB培养基
1．LB无抗培养基倒平板，划线培养大肠杆菌过夜;
2．挑取单菌落，接种至3mL的LB培养基中，37℃、250～300rpm/min培养6-8h；
3．将上述培养物接种至250mLLB培养基的1L三角瓶中，每瓶接种2~10mL，18℃中速摇床培养过夜；4．待其OD600达到0.55时，将培养物冰上预冷10min，同时离心机预冷至4℃；
5．4℃2500g离心10min收集菌体；
6．弃去培养液，将离心管倒扣在吸水纸上吸干剩余液体；
7．加80mL预冷的Inoue转化液重悬菌体（轻轻旋转，不要用振荡器或吹吸混匀）
8．4℃2500g离心10min收集菌体；
9．弃去上层培养液，将离心管倒扣在吸水纸上吸干剩余液体；
10．20mL预冷的Inoue转化缓冲液轻轻重悬菌体；
11．加入1.5mL DMSO，轻轻混匀，冰浴10min；
12．迅速将悬液分装到冷却的无菌微量离心管中，封紧管口，没入液氮中快速冰冻感受态细胞，贮存于-70℃备用。
（液氮速冻可提高转化效率约5倍左右）
用氯化钙制备感受态大肠杆菌细胞
本方法可用于批量制备感受态细胞，转化效率可达5*106-2*107个转化子/ug超螺旋质粒DNA。
此方法制备的感受态可以在-70℃冻存，但随着冻存期的延长，转化效率会有所降低。
CaCl2 2H2O(1M):使用时用水稀释10倍，并用0.45um孔径的滤膜过滤除菌，冰浴；
标准转化缓冲液（TFB）:用标准转化缓冲液可获得与CaCl2一致或更好的效果；
CaCl2-MgCl2溶液，冰上预冷；
LB培养基
1．LB无抗培养基倒平板，划线培养大肠杆菌过夜;
2．挑取单菌落，接种至3mL的LB培养基中，37℃、250～300rpm/min培养6-8h；
3．将上述培养物接种于200mLLB培养基的1L三角瓶中，37℃剧烈振荡培养3h左右至OD600=0.4；
4．将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管内，冰浴10min；
5．4℃4100rpm/min离心10min，回收细胞；
6．弃去上层培养液，将离心管倒扣在吸水纸上吸干剩余液体；
7．每50mL初始培养液用30mL预冷的0.1M的CaCl2-MgCl2(或TFB)重悬细胞沉淀；
8．分装，直接做转化实验或冻存于-70℃。
（细胞可在4℃在CaCl2中保存24-48h，在最初的12-24h内，转化率增加4-6倍，之后降低至初始水平）
感受态制备：12mM HEPES(pH6.2-6.8)+66mM MnCl2+18mM CaCl2+317mM
收获前20-30min加入20mMMgCl2效率会提高。