新型结核分枝杆菌核酸检测试剂盒的临床应用初步评价

ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－４１３０．２０１３．１９．０５１
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１６７３－４１３０（２０１３）１９－２６０１－０２
结核分枝杆菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）简 称 为 结 核 杆 菌 （ｔｕｂｅｒｃｌｅ ｂａｃｉｌｌｉ，ＴＢ），是结核病的病原 菌［１］。世 界 上 有 １／３ 的 人 感 染 了 结核分枝杆菌，每 年 有 ８００ 万 新 患 者 出 现，３００ 万 人 死 于 结 核 病，且耐药率的不断上 升，给 结 核 病 的 治 疗 和 控 制 带 来 严 峻 的 挑战［２］。目前对 结 核 病 的 诊 断 需 要 综 合 临 床 表 现 、影 像 学 检 查、结核菌检查等资料。结核菌检查是确诊结核病最特异的 方 法。其中分离培养法 被 认 为 是 临 床 诊 断 结 核 病 的 “金 标 准 ”。 但该方法一般需２～８周方能获得结果，灵敏度较低，且易出 现 漏检，严重影响结核病的早期诊疗［３］。建立快速、准确、可靠 的 结 核 分 枝 杆 菌 的 检 测 方 法 成 为 研 究 热 点 。 ［４－５］ 其 中 实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ 技术以其高灵 敏 度、高 特 异 性 以 及 简 易 的 操 作 受 到 越 来越多的关注和应用［６］。最近，新出现 了 一 种 ＴＢ 核 酸 检 测 试 剂，灵敏度高。该试剂有预防假阴性的内标控制体系和抗污 染 系统，能有效避免同类产品存在的假阴性及气溶胶污染。本 研 究拟通过检测临床样本，将 其 与 分 离 培 养 法 进 行 比 对，来 评 估 这一新试剂的准确性及特异性。 １ 资 料 与 方 法 １．１ 一 般 资 料 本 次 研 究 共 检 测 痰 液 样 本 ２０２ 份，其 中 男 性 病例１０９例（５３．９％），女 性 病 例 ９３（４６．１％），－２０ ℃ 冰 箱 保 存。结核病的诊断标准 参 照 我 国 卫 生 部 发 布 《肺 结 核 诊 断 标 准 》２００８ 年 版 。 １．２ 仪器与试剂 结核分枝杆菌核酸检测试剂购自湖南圣 湘 生物科技有限公司，具 有 内 标 监 控 假 阴 性，最 低 检 测 限 为 每 毫 升１个菌；核 酸 扩 增 仪 采 用 美 国 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ公 司 的 Ｍｘ３０００Ｐ
参考文献
［１］ 赵笔辉．应用 ＥＰ７－Ａ２文件对无 机 磷 测 定 的 干 扰 评 价 ［Ｊ］．第 三 军 医 大 学 学 报 ，２０１０，３２（２２）：２４５５－２４５６．
·检验仪器与试剂评价·
［２］ Ｊｏｓｅｐｈ Ｂ，Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ｆ，Ｄａｖｅ Ａ．Ｒｅａｇｅｎｔ ｃａｒｒｙｏｖｅｒ ｓｔｕｄｉｅｓ：ｐｒｅｖｅｎ－ ｔｉｎｇ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｅｒｒｏｒ ｗｉｔｈ ｏｐｅｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ］．Ｌａｂ Ｍｅｄ，２００５，３６（１１）：７０５－７１０．
２．２ 新 型 试 剂 检 测 结 核 患 者 结 果 见 表 ２。 表 ２ 新 型 试 剂 检 测 结 核 患 者 结 果 （ｎ）
新型试剂检测结果
结核患者
菌培阳性
菌培阴性
合计
阳性
５８
２
６０
阴性
０
０
０
总数
５８
２
６０
阳 性 符 合 率 百 分 比 ＝ （５８＋２）／（５８＋２＋０＋０）×１００％ ＝１００％ （即 临 床 诊 断 为 结 核 感 染 的 样 本 中 待 考 评 试 剂 检 测 为 阳 性 的 比 例 ）。
７０
１４２
总数
７２
７０
１４２
阴性符合率百分比＝（７２＋７０）／（０＋０＋７２＋７０）×１００％ ＝１００％ （即 临 床 诊 断 为 非 结 核 感 染 的 样 本 中 待 考 评 试 剂 检 测 为 阴 性 的 比 例 ）。
２．４ 不符样本的复核结 果 及 其 分 析 根 据 对 比 结 果，有 ２ 例 样 本 新 型 试 剂 与 分 离 培 养 法 检 测 结 果 不 符 ，均 为 培 养 法 结 果 阴 性性，结核分枝杆菌核酸检测试剂检测结果为阳性。自行设 计 设计复核扩增引物对，对这２例样本进行 ＰＣＲ 扩 增，通 过 电 泳 和克隆测序进行复核。发现２例不符样本的扩增产物电泳结 果显示产物为 目 标 长 度，扩 增 产 物 的 克 隆 测 序 结 果 显 示 见 图 １、２。扩增片段 序 列 为 ＴＢ－ＤＮＡ 序 列。 证 明 ２ 例 不 符 合 样 本 中均包含 ＴＢ－ＤＮＡ 序列。两种方法结果 的 差 异 可 能 是 由 于 培 养法检测自身 的 局 限 性 所 导 致 ，由 于 这 些 样 本 的 病 菌 载 量 较 低，培养法在检测低浓度样本时，检测灵敏度限制，容易出现 的 假阴性结果。
［７］陈强．全自动生化分析 仪 试 剂 交 叉 污 染 及 清 洗 实 验 操 作 方 法 的 探 讨 ［Ｊ］．临 床 和 实 验 医 学 杂 志 ，２００９，８（７）：６０－６１．
（收 稿 日 期 ：２０１３－０３－１０）
新型结核分枝杆菌核酸检测试剂盒的临床应用初步评价
冯 庆 芳 ，何 小 宁 ，王 小 婷 ，周 翠 蕃 （甘肃省定西市岷县中医院检验科，甘肃定西 ７４８４００）
新型试剂检测结果
分离培养法
阳性
阴性
合计
阳性
５８
２
６０
阴性
０
１４２
１４２
总数
５８
１４４
２０２
阳性一致性百分比＝ ５８／（５８）×１００％ ＝１００％（即 分 离 培 养 法 检 测为阳性的样本中新型试剂检测为阳性的比例）；阴性一致性百分 比 ＝ １４２／（２＋１４２）×１００％＝９８．６１％（即 分 离 培 养 法 检 测 为 阴 性 的 样 本 中 新型试剂检测为 阴 性 的 比 例 ）；总 一 致 性 百 分 比 ＝ （５８＋１４２）／２０２× １００％＝９９．０１％（指新型试剂与分 离 培 养 法 检 测 结 果 一 致 的 样 本 数 占 总 样 本 数 的 比 例 ）。
实时荧光定量 ＰＣＲ 仪。分离培养法使用改良罗氏培 养 基（４～ ８周），灵敏度为每毫 升 １０１ ～１０３ 个 菌。 克 隆 测 序 于 ＡＢＩ３１３０ （ＡＢＩ公 司 ，美 国 ）基 因 分 析 仪 上 进 行 。
１．３ 方法 分别采 用 该 新 型 ＰＣＲ 检 测 试 剂 和 分 离 培 养 法 对 ２０２例临床样本（每例样本一分 为 三，保 留 一 份 样 本 作 为 复 检） 进行检测，方法如下：在 样 本 中 加 入 ２～３ 倍 体 积 的 ４％ＮａＯＨ 溶液，震荡混匀后，静置液化３０ｍｉｎ。取 液 化 后 的 样 本 ５００μＬ 于１．５ｍＬ 离 心 管（避 免 吸 出 明 显 的 固 体 杂 质），１２ ０００ｒ／ｍｉｎ， 离心 ３ ｍｉｎ，吸 除 上 清；加 入 １ ｍＬ 无 菌 生 理 盐 水 重 悬 沉 淀， １２ ０００ｒ／ｍｉｎ，离心３ｍｉｎ，吸除 上 清；加 入 ５０μＬ 核 酸 释 放 剂， １００ ℃处理１０ｍｉｎ，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ，离心３ｍｉｎ，上清作为待测样 本备用。取５μＬ 作 为 ＰＣＲ 反 应 的 模 板 加 入 ＰＣＲ－ｍｉｘ ４０μＬ 上机检测即可。参考 相 关 文 献 设 计 复 检 引 物，正 义 链：ＴＩＳ－Ｆ： ５′－ＡＣＧ ＧＡＴ ＡＧＧ ＧＧＡ ＴＣＴ ＣＡＧ ＴＡＣ ＡＣ－３′，反 义 链 ：ＴＩＳ－ Ｒ：５′－ＣＧＴ ＣＴＣ ＧＧＣ ＴＡＧ ＴＧＣ ＡＴＴ ＧＴＣ－３′。 将 不 符 合 样 本用复检试剂进行 ＰＣＲ 扩增，并将 ＰＣＲ 产 物 通 过 电 泳 和 克 隆 测序进行复 核。ＰＣＲ 反 应 体 系：总 体 积 ５０μＬ，包 括 ２０ｐｍｏｌ ＰＣＲ 引物，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２，２．５ｐｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ，２μＬ Ｔａｑ 酶及 ＰＣＲ 缓冲液。ＰＣＲ 反应条件：９５ ℃ １５ｍｉｎ；（９５ ℃ ２０ｓ， ６０ ℃ ４０ｓ，７２ ℃ ４０ｓ）３５循环；７２ ℃ ３０ｍｉｎ。 １．４ 统计学处理 数据进行阴阳性一致性分析，灵敏度、特 异 度分析和 ｋａｐｐａ检验一致性分析。 ２ 结 果 ２．１ 分离培养法与新型试剂检测结果 根据金标准分离培 养
国际检验医学杂志２０１３年１０月第３４卷第１９期 Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１３，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．１９
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特 点 ［４］，但 是 高 速 运 行 的 试 剂 针 往 往 因 为 只 进 行 一 遍 短 暂 水 洗 而难以清洗干净，容易 造 成 分 析 项 目 之 间 的 携 带 污 染 ，影 响 检 验 结 果 的 准 确 性 。 ［５－７］ 通 常 情 况 下 ，可 以 通 过 以 下 方 法 避 免 项 目间的交叉污染：（１）在设定各个项目之间的分析顺序时，要 尽 量 将 产 生 干 扰 的 项 目 分 开 ，或 是 将 被 干 扰 的 项 目 放 置 于 干 扰 项 目之前；（２）合理利用仪器智能清洗程序及不同成分的清洗 液， 对生化分析仪的试剂 探 针 进 行 清 洗，避 免 试 剂 间 干 扰 的 产 生。 要避免交叉污染，不但需要熟练掌握仪器的操作、性能及原 理， 更 应 该 了 解 各 试 剂 反 应 原 理 及 成 分 ，设 定 合 理 的 分 析 顺 序 及 清 洗 程 序 ，从 而 保 证 检 测 结 果 的 准 确 性 。
摘 要：目的 通过对比实验，对结核分枝杆菌（ＴＢ）核酸 检 测 试 剂 的 临 床 使 用 效 果 进 行 评 价。 方 法 用 分 离 培 养 法 与 圣 湘
生物结核分枝杆菌（ＴＢ）核酸检测试剂分别对２０２例临床收集的 样 本 进 行 结 核 分 枝 杆 菌 的 检 测 并 对 比 其 结 果，同 时，将 两 种 检 测
［５］ 于雷．生化自动分析仪项目间试剂 的 交 叉 污 染 及 其 避 免 方 法 ［Ｊ］． 临 床 检 验 杂 志 ，２００３，２１（３）：１６８．
［６］ 顾光煜，张葵．临床 化 学 自 动 分 析 的 携 带 污 染 与 解 除 ［Ｊ］．临 床 检 验 杂 志 ，２００７，２５（６）：４０１－４０３．
［３］ 尤昕，任淑子，李玉 花，等．交 叉 污 染 对 血 清 无 机 磷 测 定 结 果 的 影 响 ［Ｊ］．延 边 大 学 医 学 学 报 ，２００４，２７（２）：１３１－１３３．
［４］ 汝香，林珊．雅培 Ｃ８０００ 全 自 动 生 化 分 析 仪Байду номын сангаас的 使 用 体 会 ［Ｊ］．实 验 与 检 验 医 学 ，２０１０，２８（２），１８２－１８３．
２．３ 新型试剂检测非结患者结果 非结核病患者，包括与 ＴＢ 症状相似的患者（如肺癌、肺 炎 等 ）、其 他 患 者 （如 哮 喘、气 管 炎 等 ），见 表 ３。
表 ３ 新 型 试 剂 检 测 非 结 核 患 者 结 果 （ｎ）
实验
非结核患者
ＴＢ 症状相似
其他患者
合计
阳性
０
０
６０
阴性
７２
准确性。结论 结核分枝杆菌核酸检测试剂与分离培养法的结果具有很好的一致性，且阳性率较分离培养法更高，所需检测时 间
大 为 缩 短 ，具 有 内 标 控 制 假 阴 性 ，结 果 准 确 ，符 合 临 床 检 测 要 求 ，具 有 较 高 的 临 床 应 用 价 值 。
关 键 词 ：结 核 分 枝 杆 菌 ； ＴＢ ＤＮＡ； 聚 合 酶 链 反 应 ； 培 养 法
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国际检验医学杂志２０１３年１０月第３４卷第１９期 Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１３，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．１９
法 检 测 结 果 将 临 床 样 本 分 为 阳 性 组 和 阴 性 组 ，见 表 １。 表 １ 分 离 培 养 法 与 新 型 试 剂 检 测 结 果 （ｎ）
方 法的检测结果分别与测序法结果进行对比。结果 结核分枝杆菌核酸检测试剂与培养法的阳性一致性百分比为１００％，阴性一
致性百分比为９８．６１％，总一致性百分比为９９．０１％；对２例不符样本进行测序复核，并对复核后的结果进行 Ｋａｐｐａ检验一致性分
析，结果 Ｋａｐｐａ值为１．０００，表明结核分枝杆菌核酸检测试剂结果与 金 标 准 分 离 培 养 法 的 结 果 具 有 很 好 的 一 致 性，表 现 出 较 好 的