电镜生物样品制备技术
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第五章 扫描电镜生物样 品制备技术
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1
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2
第一节 常规生物样品SEM 制备技术
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3
Features of SEM
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高分辨率
4
Features of SEM
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强立体感 5
Features of SEM
广泛的放大倍率
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6
Features of SEM
优点：不存在气相与液相间的表面张力问题， 故对样品损伤较小。
缺点：需特殊的低温条件，易出现冰晶损伤， 费时。
适用范围：含水量较多的生物样品
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20
叔丁醇干燥法
（1）乙醇梯度脱水至100﹪/ 2次 （2） 叔丁醇与乙醇混合液置换至100%叔丁醇
70﹪、 80﹪、 90﹪ 、95﹪和 100﹪/ 2次 5 - 10min/次 （3）在样品表面滴上 100%叔丁醇 （4）将标本置于4℃以下使样品快速固化 （5）移入镀膜仪中让样品在真空下升华干燥。
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30
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31
离子溅射的优点：
要求的真空低 工作温度低 金属粒子无方向 连续的、厚度均匀
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32
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33
甲 虫 3kV
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34
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35
大肠杆菌
耳蜗
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36
尿酸钠结晶 巨噬细胞吞噬
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胞红 细
37
上左：兔肾小体细胞
上右：血细胞发生
下图：十二指肠绒毛
选用去垢剂Triton X-100）
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15
三、 固定
目的：
保存样品表面的真实结构； 硬化组织，减少脱水干燥时水的表面张力对样品 的损伤； 提高样品的二次电子发射率； 提高样品的耐热性和导电性。
常用的固定剂： 2.5%戊二醛 （1～3h)
1.0%四氧化锇(30’~1h)
固定温度： 室 温，一般以4℃为宜。
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21
临界点干燥法
原理：利用物质在临界状态时，气相与液相
的界面消失，样品在没有表面张力的
情况下进行干燥。
步骤：脱水 置换（醋酸异戊酯）
预冷 放入样品
注入液态CO2 CO2加温气化 温度：31.4度
CO2置换 排除CO2
压力：73个大气压
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22
临界点干燥法 空气干燥法
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23
应用范围广
生物、医学、动物、材料、 化学、
物理、地质、冶金、矿物、污泥
(杆菌)、机械、电机及导电性样品
如半导体电子材料等
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7
泥材 料 学 土 聚 水
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8
制备扫描电镜样品的总要求
在不损伤样品原始结构状态 的情况下，保证样品的体积和表 面积不发生改变，充分暴露样品 表面的微细结构 。
Comparison between critical point drying and air drying
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24
六、粘托
SEM样品在干燥处理 或金属镀膜之前，需用特 制导电胶或双面胶将样品 粘贴在金属样品台上。
导电胶一般具有黏着 力较强、容易挥发固化、 干燥后表面电阻率低、导 电性能好等特点。
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28
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29
离子溅射法
原理：
利用气体在低真空中的辉光放电所产生的 高能离子，对靶极产生撞击，从靶极上打出金 属粒子，金属粒子在电场的作用下飞向样品。 在到达样品前，金属粒子之间以及金属粒子与 气体分子之间要发生相互撞击，改变了金属粒 子飞向样品的方向，具有“绕射”效应，所以在 样品表面能形成一层连续的、厚度均匀的金属 膜。
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9
生物样品的特性
含水量高 质地柔软 导电性差 二次电子产率低 对热、电子束等敏感
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10
扫描电镜生物样品要求：
不含水份 具有较高的二次电子发射率 良好的导电性 耐热性 最大限度的保持样品的形貌
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11
扫描电镜样品常规制备的操作程序
1. 取 材
2. 清 洗 3. 固 定 4. 脱 水 5. 干 燥（置换） 6. 粘 托 7. 镀 膜（导电处理）
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38
A B
SEM觀察苗木下表皮氣孔分 佈及葉部組織之微細構造 A：氣孔密度(橫線=120mm) B：氣孔形態(橫線=12mm) C：葉組織(橫線=120mm)
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16
四、脱水
要求：不改变样品的体积和表面积的情况 下，去除样品中的水份。
常用的脱水剂：乙醇、丙酮 方法：梯度脱水 时间：视样品大小而定 注意事项：避免裸露，夹伤
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17
五、干燥
目的：去除样品中的脱水剂
方法：空气干燥法、冷冻干燥法、 叔丁醇干燥法、临界点干燥法等
常用干燥法：叔丁醇干燥法、临界点干燥法
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18
源自文库
空气干燥法
方法：脱水至无水状态，为减缓其挥发速度， 退回至85%脱水剂，取出，空气中自然干 燥。
优点：脱水剂为低表面张力物质，挥发过程 中减少了样品的收缩及损伤
缺点：常常使样品发生变形收缩
适用范围：铸型或体表比较坚硬的甲壳昆虫 等含水量较少的样品
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19
冷冻干燥法
方法：将含大量水分的生物样品迅速投入液 氮中，使样品冷冻固化，而后将样品移入真 空镀膜仪内，在高真空状态下升华，脱水剂 直接由固态转为气态，样品随之得到干燥。
要点：稳，钝角
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25
样品粘托
Fixing the specimen
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26
七、镀膜（样品的导电处理）
目的：使样品导电，增加二次电子的发射率 金属镀膜技术：包括真空喷镀法和离子溅射法
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27
真空喷镀法
方法：在高真空中使金属加热蒸发，在 样品表面沉积形成一层金属膜。
缺点：金属损耗大，容易产生污染和热 损伤，容易形成“死角”。
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12
一、 取 材
要 点： 确定观察样品的目标
要求及注意事项：
做好充分准备（试剂、仪器、器械等）
保护观察面，作好标记
速度要快 ，每次取材数量不宜过多 大小要合适 10 × 10 × 5毫米 避免拉割、挤压
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13
二、清洗
目的：去除观察面的杂质，充分暴露观察面
方法：物理方法: 漂洗、换洗、加压冲洗、振荡超声。 化学方法: 用酶消化法
注意事项： 在保证不破坏观察面的条件下，充分暴露观察面 不要损伤观察面或者使样品膨胀、收缩等 不要将样品裸露在空间，防止样品皱缩变型
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14
清洗液的选择
一般组织：等渗生理盐水 游离组织细胞：缓冲液、等张液 表面覆有大量黏液的组织（如胃肠粘膜）：
低浓度蛋白水解酶 组织培养细胞：组织培养液 特殊样品：特殊洗液（如生药表面的蜡质，
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2
第一节 常规生物样品SEM 制备技术
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Features of SEM
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高分辨率
4
Features of SEM
教学ppt
强立体感 5
Features of SEM
广泛的放大倍率
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6
Features of SEM
优点：不存在气相与液相间的表面张力问题， 故对样品损伤较小。
缺点：需特殊的低温条件，易出现冰晶损伤， 费时。
适用范围：含水量较多的生物样品
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20
叔丁醇干燥法
（1）乙醇梯度脱水至100﹪/ 2次 （2） 叔丁醇与乙醇混合液置换至100%叔丁醇
70﹪、 80﹪、 90﹪ 、95﹪和 100﹪/ 2次 5 - 10min/次 （3）在样品表面滴上 100%叔丁醇 （4）将标本置于4℃以下使样品快速固化 （5）移入镀膜仪中让样品在真空下升华干燥。
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30
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31
离子溅射的优点：
要求的真空低 工作温度低 金属粒子无方向 连续的、厚度均匀
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32
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33
甲 虫 3kV
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34
教学ppt
35
大肠杆菌
耳蜗
教学ppt
36
尿酸钠结晶 巨噬细胞吞噬
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胞红 细
37
上左：兔肾小体细胞
上右：血细胞发生
下图：十二指肠绒毛
选用去垢剂Triton X-100）
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三、 固定
目的：
保存样品表面的真实结构； 硬化组织，减少脱水干燥时水的表面张力对样品 的损伤； 提高样品的二次电子发射率； 提高样品的耐热性和导电性。
常用的固定剂： 2.5%戊二醛 （1～3h)
1.0%四氧化锇(30’~1h)
固定温度： 室 温，一般以4℃为宜。
教学ppt
21
临界点干燥法
原理：利用物质在临界状态时，气相与液相
的界面消失，样品在没有表面张力的
情况下进行干燥。
步骤：脱水 置换（醋酸异戊酯）
预冷 放入样品
注入液态CO2 CO2加温气化 温度：31.4度
CO2置换 排除CO2
压力：73个大气压
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22
临界点干燥法 空气干燥法
教学ppt
23
应用范围广
生物、医学、动物、材料、 化学、
物理、地质、冶金、矿物、污泥
(杆菌)、机械、电机及导电性样品
如半导体电子材料等
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7
泥材 料 学 土 聚 水
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制备扫描电镜样品的总要求
在不损伤样品原始结构状态 的情况下，保证样品的体积和表 面积不发生改变，充分暴露样品 表面的微细结构 。
Comparison between critical point drying and air drying
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六、粘托
SEM样品在干燥处理 或金属镀膜之前，需用特 制导电胶或双面胶将样品 粘贴在金属样品台上。
导电胶一般具有黏着 力较强、容易挥发固化、 干燥后表面电阻率低、导 电性能好等特点。
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离子溅射法
原理：
利用气体在低真空中的辉光放电所产生的 高能离子，对靶极产生撞击，从靶极上打出金 属粒子，金属粒子在电场的作用下飞向样品。 在到达样品前，金属粒子之间以及金属粒子与 气体分子之间要发生相互撞击，改变了金属粒 子飞向样品的方向，具有“绕射”效应，所以在 样品表面能形成一层连续的、厚度均匀的金属 膜。
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生物样品的特性
含水量高 质地柔软 导电性差 二次电子产率低 对热、电子束等敏感
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10
扫描电镜生物样品要求：
不含水份 具有较高的二次电子发射率 良好的导电性 耐热性 最大限度的保持样品的形貌
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扫描电镜样品常规制备的操作程序
1. 取 材
2. 清 洗 3. 固 定 4. 脱 水 5. 干 燥（置换） 6. 粘 托 7. 镀 膜（导电处理）
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38
A B
SEM觀察苗木下表皮氣孔分 佈及葉部組織之微細構造 A：氣孔密度(橫線=120mm) B：氣孔形態(橫線=12mm) C：葉組織(橫線=120mm)
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四、脱水
要求：不改变样品的体积和表面积的情况 下，去除样品中的水份。
常用的脱水剂：乙醇、丙酮 方法：梯度脱水 时间：视样品大小而定 注意事项：避免裸露，夹伤
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五、干燥
目的：去除样品中的脱水剂
方法：空气干燥法、冷冻干燥法、 叔丁醇干燥法、临界点干燥法等
常用干燥法：叔丁醇干燥法、临界点干燥法
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源自文库
空气干燥法
方法：脱水至无水状态，为减缓其挥发速度， 退回至85%脱水剂，取出，空气中自然干 燥。
优点：脱水剂为低表面张力物质，挥发过程 中减少了样品的收缩及损伤
缺点：常常使样品发生变形收缩
适用范围：铸型或体表比较坚硬的甲壳昆虫 等含水量较少的样品
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冷冻干燥法
方法：将含大量水分的生物样品迅速投入液 氮中，使样品冷冻固化，而后将样品移入真 空镀膜仪内，在高真空状态下升华，脱水剂 直接由固态转为气态，样品随之得到干燥。
要点：稳，钝角
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25
样品粘托
Fixing the specimen
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七、镀膜（样品的导电处理）
目的：使样品导电，增加二次电子的发射率 金属镀膜技术：包括真空喷镀法和离子溅射法
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真空喷镀法
方法：在高真空中使金属加热蒸发，在 样品表面沉积形成一层金属膜。
缺点：金属损耗大，容易产生污染和热 损伤，容易形成“死角”。
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一、 取 材
要 点： 确定观察样品的目标
要求及注意事项：
做好充分准备（试剂、仪器、器械等）
保护观察面，作好标记
速度要快 ，每次取材数量不宜过多 大小要合适 10 × 10 × 5毫米 避免拉割、挤压
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二、清洗
目的：去除观察面的杂质，充分暴露观察面
方法：物理方法: 漂洗、换洗、加压冲洗、振荡超声。 化学方法: 用酶消化法
注意事项： 在保证不破坏观察面的条件下，充分暴露观察面 不要损伤观察面或者使样品膨胀、收缩等 不要将样品裸露在空间，防止样品皱缩变型
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清洗液的选择
一般组织：等渗生理盐水 游离组织细胞：缓冲液、等张液 表面覆有大量黏液的组织（如胃肠粘膜）：
低浓度蛋白水解酶 组织培养细胞：组织培养液 特殊样品：特殊洗液（如生药表面的蜡质，