肺泡灌洗液细胞计数

肺泡灌洗液细胞计数

1、开胸，游离出气管，，靠喉部结扎剪断气管。

2、向下贴着胸后壁分离出整个心肺。

3、留置针插入气管，350umL冰冻生理盐水灌洗，共3次，每次反复灌吸3个回合。

4、灌洗液1200g，4℃离心10分钟。

5、取上清保存-20℃冰箱用于蛋白检测，重悬浮下部细胞用于细胞计数。

1.小鼠肺泡灌洗时总量为350uL×3次，估计收集的好的话，有1mL回收。立即放入ice中。

2.离心，弃上清，在沉淀中加入200uL 红细胞裂解液（Red Blood Cell Lysis Buffer），1分钟后加入1mL NS或者PBS，离心，

3，弃上清，如果沉淀的红色还是很厉害，可以再做一次第二步。

4，沉淀用NS或者PBS 100mL 重悬，取10mL在计数板计数。

整个过程应该都在on ice的状态下进行，以防细胞死亡。

- Centrifuge 2000rpm 4°C 5min BAL

- preparing CASY: empty measurement: if count >50 units, cleaning program, repeat empty measurement

- fill tube with 10ml CASY fluid

- SN of BAL to new Eppendorf tube, put in freezer

- Pellet resuspend with 200µl cold PBS, shake it —> 10µl in CASY tube with 10ml CASY fluid - measure tube with CASY machine

- after measurement, hit CLEAN, put a CASY tube under the probe, CYSA should never stay without tube covering the probe