雷帕霉素或二甲双胍联合PD-1单抗在三阴性乳腺癌中的抗肿瘤作用

雷帕霉素或二甲双胍联合PD-1单抗在三阴性乳腺癌中的抗肿瘤

作用

研究背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,也是女性癌症死亡的主要原因之一,严重威胁着女性的生命健康。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌中恶性程度最高的亚型,由于缺乏有效化疗方案及靶向药物,治疗手段比较单一,因此寻找新的有效治疗方法对TNBC患者至关重要。

近年来,针对PD-Ll/PD-1(programmed death-ligand 1/programmed death-1)的免疫检查点阻断疗法取得巨大成功,截至目前,部分PD-1或PD-L1阻断药物已经被FDA批准用于部分恶性肿瘤患者的治疗。乳腺癌患者中开展的PD-L1或PD-1单克隆抗体治疗研究表明,TNBC患者可于PD-1/PD-L1阻断疗法中获益。

但由于患者之间的个体差异以及肿瘤免疫逃逸机制不同等原因,PD1/PD-L1阻断疗法的有效率较低,因此,提高癌症患者对于PD-1/PD-L1阻断疗法的反应性引起越来越多的关注。最新的研究表明,部分靶向治疗除了具备直接杀伤肿瘤细胞的作用,还可以使患者对免疫治疗敏感化。

因此,靶向治疗和免疫治疗的联合应用不仅能达到两种治疗的相加效果,更能发挥协同效应。PI3K/AKT/mTOR通路可以调控肿瘤表面PD-L1的表达,同时有研究表明mTOR抑制剂雷帕霉素以及靶向AMPK/mTOR的二甲双胍可以通过调节免疫系统发挥抗癌作用。

因此,我们认为PD-1抗体联合雷帕霉素或者二甲双胍是值得探讨的联合治疗方式,本研究将验证其在TNBC中的治疗效果,并探讨协同作用的机制,为新的TNBC治疗方式提供理论基础。研究目的1.评估mTOR抑制剂雷帕霉素及二甲双胍对乳腺癌细胞PD-L1表达的影响。

2.建立TNBC小鼠模型,评估PD-1抗体与雷帕霉素或者二甲双胍联合治疗TNBC的效果,并初步探究其作用机制。实验方法1.通过分析TCGA数据库数据,

比较PD-L1 mRNA在TNBC组织与Non-TNBC组织中的表达情况;分析CCLE数据库数据,比较TNBC与Non-TNBC细胞系中PD-L1 mRNA表达情况。

2.利用RT-qPCR及Western Blot(WB)检测乳腺癌细胞系中PD-L1的表达;WB 检测乳腺癌细胞系mTOR通路活化状态;筛选MDA-MB-231与4T1用于下一步实验,利用流式细胞术检测细胞膜表面PD-L1表达。

3.雷帕霉素处理MDA-MB-231与4T1细胞系不同时间,WB检测pS6、S6、PD-L1蛋白变化;二甲双胍处理MDA-MB-231

细胞系24h,检测pS6、S6、pAMPK、AMPK、PD-L1蛋白变化。

4.构建小鼠乳腺癌移植瘤模型,分为对照组、施用雷帕霉素组、施用二甲双胍组,用药三周,统计雷帕霉素或二甲双胍在小鼠体内对肿瘤增殖及转移的影响,评估雷帕霉素或二甲双胍的抗肿瘤效果。

5.构建小鼠移植瘤模型,分为对照组、雷帕霉素组、PD-1组、雷帕霉素联合PD-1组,用药三周,评估单药及联合用药对肿瘤生长的影响。

6.利用HE染色评估肿瘤细胞的形态学改变;免疫荧光及免疫组化检测小鼠

肿瘤组织的PD-L1、pS6、active casepase-3、CD3表达情况。7.构建小鼠移植瘤模型,分为对照组、二甲双胍组、PD-1组、二甲双胍联合PD-1组,评估单药及联合用药对肿瘤生长的影响。

8.利用免疫荧光及免疫组化检测小鼠肿瘤的PD-L1、pS6、activecasepase-3、CD3表达情况。实验结果1.TNBC组织PD-L1 mRNA水平显著高于Non-TNBC组织,差异有统计学意义。

虽然没有统计学意义,TNBC细胞系PD-L1 mRNA整体表达高于Non-TNBC。2.

体内外实验结果表明,雷帕霉素与二甲双胍无论在体外,还是体内,均能降低

PD-L1表达,这种作用与mTOR通路的抑制有关。

3.小鼠体内实验证明雷帕霉素与二甲双胍均能降低肿瘤瘤重,减少肺转移,差异有统计学意义。

4.小鼠体内实验显示,PD-1单抗、雷帕霉素、雷帕霉素联合PD-1单抗均能显著抑制肿瘤生长,降低瘤重,联合用药较单药效果更加显著,差

异具有统计学意义;PD-1单抗、二甲双胍、二甲双胍联合PD-1单抗均能显著抑制肿瘤的生长,降低瘤重,联合用药较单用二甲双胍的抗肿瘤作用更加显著,差异有统计学意义;虽然联合用药组瘤重低于PD-1单抗组,但差异没有统计学意义。

5.雷帕霉素与PD-1组联合用药HE染色显示雷帕霉素组肿瘤大片坏死,PD-1组肿瘤坏死较轻,但肿瘤细胞密度降低,并出现纤维组织增生,联合用药组兼具这两种表现且坏死面积更大。免疫荧光及免疫组化结果显示,联合用药增加了CD3及活性casepase-3的表达,显示联合用药增加了肿瘤浸润淋巴细胞与细胞凋亡。

6..二甲双胍组与PD-1联合用药,联合用药CD3表达及活性casepase-3表达增加,显示联合用药增加了肿瘤浸润淋巴细胞与细胞凋亡。结论1.相比于单独用药,雷帕霉素与PD-1单抗联用通过降低PD-L1表达水平,增加肿瘤浸润淋巴细胞数量,促进凋亡,显著抑制TNBC小鼠肿瘤生长。

2.二甲双胍与PD-1单抗联用通过降低PD-L1表达水平,增加肿瘤浸润淋巴细胞,显著增强了二甲双胍对TNBC小鼠肿瘤的抑制作用。

3.雷帕霉素通过抑制mTOR 活性,降低PD-L1的表达水平。

二甲双胍降低PD-L1表达水平,与雷帕霉素一致,提示可能通过调控

AMPK/mTOR通路,抑制mTOR降低PD-L1表达水平。