新城疫抗体测定技术

4单位病毒液
2013动物疫病检测新技术暑期培训
回归试验
用4V进行的HA试验（用4个孔），用于检验4V配 制是否正确。 4V配制正确的判定标准： 前2个孔完全凝集，后2个孔不完全凝集，如下图：
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五、血凝抑制试验（HI）
当病毒与相应抗体结合后，病毒凝集红细胞 的能力受到抑制，称为病毒的血凝抑制。
采血器或灭菌干净青霉素小瓶中凝固成斜面，室温下2-3 小时或4℃冰箱中过夜使血清析出，也可通过离心加快血 清析出。 血清为淡黄色透明液体。

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翅静脉采血
针头在静脉血管一侧倾斜刺 入皮肤，再与血管平行进针后刺 入血管，见有少量回血即可采集 血液，采血完成后马上用手压迫 止血。
HA试验成功的关键环节（HI同） 正确使用微量移液器（吸头固定紧，每次都要排空）；吸头不能 混用；悬滴加样；混匀要彻底；时间和温度合适。
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四、4单位病毒的配制
HA试验，测定做NDV病毒的血凝效价 介 绍 ： 回 归 试 验
血凝效价除以4即为4V的稀释倍数
用生理盐水稀释HA试验的NDV液
3. 配制1%RBC悬液
根据红细胞的体积，计算所需生理盐水量，用所需生 理盐水将红细胞泥全部冲入小烧杯中，摇匀即可。
注意：摇匀时动作要轻柔，以防红细胞破碎或液体外溢。
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三、血凝试验（HA）
1．基本原理
血凝素 纤突
血凝素纤突 受体
RBC
血凝性病毒
有相应受体的红细胞
红细胞凝集（HA现象）
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配平注意事项
1．离心管、离心套管和管中液体作为一个整体进行配平 2．离心管中液体不能太满
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2. 离心洗涤红细胞
（1）共洗涤3次，转速和时间均为：2000r/min、5min。 （2）第1次离心时间到，用移液器吸取并弃掉上清液、白细胞和血小 板，加生理盐水，吹打混匀红细胞，配平后进行第2次离心，依此进行 第3次离心。 （3）第3次离心时间到，吸取并弃掉上清液、白细胞和血小板后，读 出离心管中红细胞的体积 。
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心脏采血
鸡右侧卧保定，上腿 自然踡曲，在上腿膝关节 稍前下方约1cm处（心脏
搏动最明显的部位）垂直
地面进针采血。
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二、制备1％RBC悬液
1. 制备抗凝血
在采血器（注射器）中吸入抗凝剂（3.8%的枸橼
酸钠，抗凝比例为1：10），心脏或静脉采血3-4mL， 颠倒采血器使血液与抗凝剂充分混匀，然后将血液注 入离心管中，用天平配平。
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2．操作术式（微量法，单位ul）
孔 号 1
21 25 25 25 25
2
22 25 25 25 25
3
23 25 25 25 25
4
24 25 25 25 25
5
25 25 25 25 25
6
26 25 25 25 25
7
27 25 25 25 25
8
28 25 25 25 25
是新城疫抗体监测和诊断的重要手段
是2011和2012年全国农业技能大赛的比赛项目，据
说还将是2014年全国农业技能大赛的比赛项目
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新城疫抗体测定基本操作规程
制备被检血清 制备1%RBC悬液 HA试验，测病毒的血凝价 配制4单位病毒 HI试验，测血清的抗体滴度 抗体滴度报告，以nlog2形式报告
新的操作方法和旧版有哪些不同？ 生理盐水、剂量、 反应条件
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HA试验结果及规律
完全凝集：红细胞呈伞状均匀分布于孔底
不完全凝集：介于两者之间
完全不凝集：红细胞呈明显钮扣状沉到孔底
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病毒的HA价（血凝滴度）：能使红细胞发生完全凝集的病毒最大稀释倍 数称为病毒的血凝价，常用nlog2或1：xxx表示。
血凝素纤突
血凝素纤突受体 RBC RBC RBC RBC RBC
HA
血凝性病毒
RBC
RBC
有其受体的红细胞
红细胞凝集（HA现象） Ag、Ab不对应
血凝素纤突
v
v
RBC
HI
血凝性病毒 抗体
v RBC v
RBC
v
v
RBC RBC
RBC
Ag、Ab对应
1．反应原理
２．HI试验操作术式（微量法，单位ul）
注意：吹打混匀红细胞时不要太用力，以免破坏红细胞。
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离心机的使用
离心机放置平稳
离心管对称放入离心机，使其处于平衡状态 按档位依次升高转速至所需速度。离心时间到，将转
速调为零，离心机停转后方可取出离心管。
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孔
号
1
25 25
2
25 25
3
25 25 25 25
4
5
25 25
6
25 25
7
25 25
8
25 25
9
25 25
10
25 25
11
25 －
弃25
12
50 －
生理盐水 被检血清
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国标ND抗体测定技术
山东畜牧兽医职业学院 朱明恩
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本技术依据中华人民共和国国家标准制定
国标：新城疫诊断技术（GB/T 16525-2008）
2009-05-01实施
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安排本内容的原因
是开设畜牧兽医类专业学校学生的必会技能
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仪器及材料
非免疫公鸡、 pH7.2生理盐水、 新城疫标准抗原、 新城标准阳性血清、新城标准阴性血清、 3.8%的枸橼 酸钠、96孔V型板、微量移液器、吸头、微型振荡器、 温箱、离心机、天平、采血器等。
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一、制备被检血清
心脏或静脉采血2-3mL（不加抗凝剂），采血后使血液在
9
29 25 25 25 25
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
10
210 25 25 25 25
11
211 25 25 25 25
12
对照
病毒稀释倍数 生理盐水 标准抗原
25
弃25
生理盐水
1%RBC悬液
25 25
振荡混匀，室温即20℃～25℃下静置40 min后观察结果。若环境温度太高，放4℃静置60 min。生理盐水对照孔红细胞成明显钮扣状沉到孔底时判定结果。