新城疫抗体测定技术
新城疫抗体水平检测
新城疫抗体水平检测文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-新城疫的血凝和血凝抑制试验高若开 一、实验目的1.掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操作方法和结果判定方法。
2.分析血凝和血凝抑制试验的影响因素，用以确定最佳免疫时间、判定免疫效果和辅助疾病诊断。
二、实验内容1.血凝试验(HA)检测新城疫抗原2.血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体 三、实验原理1.血凝试验（HA ）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA ）,也称直接血凝反应。
2.血凝抑制试验（HI ）原理：当在病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。
这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI ）反应，也称血凝抑制反应。
病毒颗粒红细胞四、实验材料离心机、恒温箱、冰箱、振荡器、96孔血凝版（5块）、微量移液器（20-100微升可调）、吸液尖（若干）、洗耳球、离心试管、普通试管、试管刷、烧杯、吸量管、一次性注射器、ND 标准抗原、1%红细胞悬液、抗凝剂、生理盐水。
五、实验步骤 （一）抗凝剂的配制将1克柠檬酸钠用25毫升生理盐水稀释备用。
1毫升抗凝剂可用于采集9毫升血液。
（二）10%红细胞悬液的配制1、用注射器吸取0.5毫升抗凝剂无免疫健康青年公鸡的红细胞4.5毫升。
2、1500转离心5分钟，吸弃上清液。
3、用5-10倍生理盐水1500转洗涤3次，前两次5分钟，后一次10分钟。
4、吸弃上清液，用吸量管吸取红细胞，配制成10%红细胞悬液。
5、2-6摄氏度储存，备用。
（三）血凝试验（HA)1.在血凝板上第一排的1－12孔内各加入50ul 生理盐水抗体抗原2.将系苗用生理盐水5毫升稀释，在第1孔内加入50ul病毒抗原，然后依次倍比稀释至第11孔，最后弃50ul。
鸡新城疫抗体检测步骤,鸡新城疫的症状表现
鸡新城疫抗体检测步骤，鸡新城疫的症状表现1、将样本做去皮和去脂处理，并用均质器均质样本，然后称取适量的均质物至离心管内。
2、依次加入蒸馏水、试剂A、衍生化试剂，振荡混匀后孵育半小时。
3、依次加入试剂B、试剂C、提取剂，并振荡混匀。
4、离心5分钟，取上层有机相至离心管内，再用氮气吹干。
5、用净化剂溶解干燥物，加入试剂D，离心2分钟后待检。
一、鸡新城疫抗体检测步骤1、将鱼虾蟹、畜禽肉、内脏等样本做去皮、去脂肪等处理，再用均质器均质样本，然后称取3±0.05克均质物至15毫升的离心管内。
2、依次加入4毫升蒸馏水、0.5毫升试剂A以及0.6毫升衍生化试剂，并振荡混匀，于65°C水浴中孵育半小时。
3、依次加入1毫升试剂B、0.4毫升试剂C、1瓶4毫升的提取剂，然后振荡混匀。
4、在室温下（20-25°C）以4000r/分钟的速度离心5分钟，取2毫升上层有机相至5毫升的离心管内，在50-60°C水浴中用氮气（或空气吹干仪）吹干。
5、取1毫升净化剂溶解干燥物，再加入0.5毫升试剂D振荡混匀，在室温下（20-25°C）以4000r/分钟的速度离心2分钟，最后待检。
6、若使用全血标本进行检测，标本的移动速度可能较慢，必要时可在加样1分钟后，向加样孔内滴入1滴PBS作辅助液，以促进标本移动。
二、鸡新城疫的症状表现1、急性型（1）病鸡呼吸困难，会发出“咕噜”的特殊怪声。
（2）病鸡的嘴、鼻中有大量黏液，产蛋量下降。
（3）病鸡出现下痢，其粪便的颜色为黄白色或绿色，有麻痹和神经症状。
2、最急性型此类症状大多出现在3-4周龄的小鸡身上，发病时通常不会表现出任何症状，但病发后小鸡会快速死亡。
3、亚急性或慢性型病鸡出现跛行、麻痹、痉挛、运动失调、肌肉抽搐等症状，产蛋鸡发病后期产量会有所降低，一般会发生于成年鸡身上。
4、非典型性新城疫病鸡出现咳嗽、呼吸困难的现象，且伴有分泌物、神经症状，若蛋鸡和种鸡发病，则产蛋量一般会急速降低。
新城疫抗体检测
新城疫的抗体检测某些病毒具有凝集某种（些）动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的实验称血球凝集试验，以此来推断被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的血凝可为相应的抗体所抑制，即血球凝集抑制实验（HI），通过血凝与血凝抑制试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。
一目的意义1免疫监测（1）免疫效果评价（2）免疫时机确定2诊断疾病（根据有无抗体或抗体的高低）3流行病学调查二试验仪器与试剂1试验仪器离心机、离心管两支、50ml量筒一个、V型微量反应板、微量加样器（移液器）、塑料吸头（黄色）若干、1ml吸管1支、胶头滴管两支、微量振荡器、电热恒温培养箱、托盘天平。
2试验试剂鸡新城疫抗原、流感H5、H9抗原、1%鸡红细胞、生理盐水、3.8%柠檬酸钠抗凝剂、待检血清。
三方法1病毒的血凝试验1.1 3.8%柠檬酸钠抗凝剂的配制：用托盘天平称取柠檬酸钠3.8克溶于100ml蒸馏水或纯净水中，摇匀使其充分溶解即可，有条件的可121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温后置4℃冰箱中保存备用。
1.2 1%鸡红细胞制备过程：事先用5ml（或10ml）的注射器吸入抗凝剂若干（其量为所需血量的1/5）,从健康公鸡（未经新城疫疫苗注射）的心脏或翅下静脉采取2-4毫升血液,以2000转每分钟，离心5分钟，吸去上清液（注意要将血细胞泥表面的一种薄膜吸净）。
然后用生理盐水（用量为血细胞泥的5-10倍）洗红细胞，离心5分钟，弃去上清液，如此反复洗3-5次，直至上清液透明清亮为止，最后一次要用生理盐水将血细胞泥稀释成1%浓度，然后置4℃冰箱备用（一般可保存3天）。
1.3 红细胞凝集试验（血凝试验）操作方法（见表1）：（1）取一块洁净的96孔V型微量血凝反应板，用微量移液器从第一列第一孔开始依次加入生理盐水，每孔25微升，直至加到第十五孔（第一列12孔，第二列3孔）。
鸡新城疫抗体检测实验报告(一)
鸡新城疫抗体检测实验报告(一)背景介绍•鸡新城疫是一种常见的家禽传染病，严重影响鸡类养殖业。
•抗体检测可以有效判断鸡群是否感染鸡新城疫。
实验目的•确定一种高效准确的鸡新城疫抗体检测方法。
•提供可靠的数据支持，用于预防和控制鸡新城疫的传播。
实验设计•选取多个饲养场的鸡群作为实验对象。
•分为实验组和对照组，实验组注射疫苗，对照组不注射。
•定期进行血液检测，测量抗体水平。
实验步骤1.收集血样。
2.提取血清。
3.使用特定抗体试剂盒进行检测。
4.测量光密度值，判断鸡新城疫抗体水平。
5.记录实验结果。
实验结果•实验组鸡群的抗体水平明显高于对照组。
•实验组的鸡只无明显临床症状，对疫情具有稳定抵抗力。
•对照组鸡群出现多例感染病例，病死率较高。
结论与建议•鸡新城疫抗体检测方法可准确判断鸡群感染情况，为预防和控制疫情提供重要依据。
•注射疫苗可以提高鸡只的免疫力，减少感染风险。
•鼓励养殖场加强抗体检测工作，及时发现病例并采取相应措施。
致所有鸡农：鸡新城疫是一项严重威胁家禽行业的疾病。
本实验通过抗体检测方法，证明了注射疫苗可以提高鸡群的免疫能力，减少感染的风险。
希望您能严格按照抗体检测规程，提高鸡只的免疫力，保障养殖业的稳定发展。
感谢您的关注与支持！注意：本报告仅为实验结果总结，并非具体实验报告。
具体实验细节和数据可根据实际情况进行增删和修改。
实验方法•选取多个饲养场的鸡群作为实验对象。
•将实验组的鸡只注射鸡新城疫疫苗。
•对照组的鸡只不注射疫苗。
•按照一定周期，定期采集血液样本。
数据分析•对实验组和对照组的血液样本进行抗体检测。
•实验组的鸡只抗体水平明显升高，且持续稳定。
•对照组的鸡只抗体水平较低，易受感染。
结果讨论•实验结果证明，注射鸡新城疫疫苗可以有效提高鸡只的免疫力。
•抗体检测是一种可靠的方法，可以快速判断鸡群的感染情况。
•实验结果也表明，饲养场的防疫管理和养殖环境对感染鸡新城疫的影响较大。
结论•鸡新城疫抗体检测方法在预防和控制鸡新城疫方面具有重要意义。
鸡新城疫抗体检测实验报告
鸡新城疫抗体检测实验报告引言本实验旨在对鸡新城疫进行抗体检测，以评估鸡群对该病毒的感染情况。
通过收集血清样本并使用特定检测方法，我们能够确定鸡群中抗体的存在与水平。
这对于制定控制措施、监测疫情以及预防疾病的传播至关重要。
实验设计1. 样本采集我们在鸡群中随机选择了100只鸡进行样本采集，确保样本的代表性。
采集的方法包括抽取少量鸡脉血或者采集鸡羽毛根部进行检测。
2. 抗体检测方法我们采用了酶联免疫吸附试验（ELISA）方法进行抗体检测。
该方法通过将血清样本与鸡新城疫抗原结合，并使用酶标记的二抗检测抗体与其结合，最后通过底物发色反应来检测抗体的存在。
3. 阳性对照与阴性对照为了验证实验结果的准确性，我们使用了阳性对照和阴性对照。
阳性对照为已知感染鸡新城疫的鸡样本，而阴性对照为未感染的鸡样本。
实验结果我们对100个样本进行了抗体检测，并将结果进行统计和分析。
以下是实验结果的详细报告：1. 鸡新城疫抗体检测结果我们将鸡新城疫抗体检测结果分为三类：•强阳性：抗体水平高于阈值的样本。
•弱阳性：抗体水平介于阈值和阴性之间的样本。
•阴性：抗体水平低于阈值的样本。
2. 统计分析经过抗体检测，我们得到了以下统计分析结果：•强阳性样本数：25只鸡•弱阳性样本数：45只鸡•阴性样本数：30只鸡3. 结果解读我们的实验结果表明，在100只鸡样本中，25只鸡的抗体水平高于阈值，可以确认为感染了鸡新城疫。
另外，45只鸡的抗体水平介于阈值和阴性之间，可能存在早期感染的迹象。
剩余的30只鸡样本抗体水平低于阈值，说明它们未感染鸡新城疫。
结论与讨论本次实验通过鸡新城疫抗体检测方法对100只鸡样本进行了检测，并得出了实验结果。
结果表明鸡新城疫在该鸡群中流行的程度较高，25%的样本具有强阳性抗体水平。
我们认为，对鸡新城疫进行抗体检测有助于早期发现感染情况，及时采取控制措施以避免疫情的进一步传播。
此外，对鸡新城疫的抗体检测也可以作为鸡群健康监测的重要指标，帮助决策者制定防控策略和掌握疫情动态。
鸡新城疫免疫抗体水平评价试验
入） 。振荡 混匀 ， 在室 温 ２ ０ ～ ２ ５ 。 【 ＝ 下静 置 ４ ０分钟 后 ， 观
②疫苗 重组新城疫灭活疫苗。 ③ 试剂 新 城疫 血凝 抑制 试 验抗 原 ，新 城疫 血
凝 抑 制试 验 阳性血 清 ， １ ％鸡 红 细胞悬 液 ， 阿 氏液 ， ｐ Ｈ
察结 果 。 如果 环境 温度太 低或 者太 高 ， 可置 ２ ５ ℃温箱
数 作 为终点 ，终 点稀 释倍 数 除 以 ４即为 含 ４ Ｈ Ａ Ｕ抗 原稀释 倍数 。所 以 ， ４ Ｈ Ａ Ｕ抗 原稀释倍 数 为 １ ： ６ ４ 。
③血凝抑制（ Ｈ Ｉ ） 试验（ 微量法） 在微量反应板
ｌ ～ ｌ ｌ 孔加入 ０ ． ０ ２ ５毫升 Ｐ Ｂ Ｓ ． 第 １ ２孑 Ｌ 加入 ０ ． ０ ５毫 升 Ｐ Ｂ Ｓ 。 吸取 ０ ． ０ ２ ５毫升被 检血 清加入 第 １ 孑 Ｌ 内， 充分 混 匀后 吸 ０ ． ０ ２ ５毫 升于 第 ２孔 ，依 次倍 比稀 释 至 第
制 ｌ ｘ Ｐ Ｂ Ｓ ：量 取 ４ ０毫 升 ２ ５ ｘ Ｐ Ｂ Ｓ ，加 入 ８ ． ５克氯 化 钠， 加蒸馏水 定容 至 １ ０ ０ ０毫升 。
３ ． 试 验 方 法
性、 败血 性传 染病 。 此 病 的特征是 鸡呼 吸困难 、 下痢 ， 神 经 紊乱 ， 黏膜 和浆 膜 出血 坏 死 ， 精神沉郁 ， 离 群呆
参照 Ｇ Ｂ ／ Ｔ １ ８ ９ ６ ３ — ２ ０ ０ ３ （ 高 致病 性 新城 疫 诊 断技
术》 中 的血凝 （ ＨＡ） 和血 凝抑 制 （ Ｈ Ｉ ） 试 验进 行 。
４ ． 血凝 试验 （ ＨＡ） （ 微 量 法） 测 定
死。 嗉囔 内有 充满 臭味 的稀 薄液 体和 气体 ， 腺 胃黏膜
鸡新城疫抗体检测实验报告
鸡新城疫抗体检测实验报告
引言
•鸡新城疫（Newcastle Disease，ND）是一种由鸡新城疫病毒引起的急性、高度传染性疾病。
•对鸡新城疫的抗体检测是确保家禽养殖业安全和疫情控制的重要手段之一。
实验目的
•通过检测鸡群中的抗体水平，判断其是否感染了鸡新城疫病毒，从而进行及时的干预和控制措施。
实验方法
1.样本采集：
–从鸡群中选取一定数量的鸡只，代表样本群体。
–采集鸡只的血液样本，确保采样的无菌和无血栓。
2.抗体检测：
–使用ELISA技术或HI技术等方法，对血液样本中的鸡新城疫抗体进行检测。
–按照相关试剂盒说明书的步骤进行操作，确保准确性和可重复性。
3.结果分析：
–根据检测结果，对鸡群中抗体水平的高低进行评估。
–判断鸡群是否处于鸡新城疫感染风险中，从而制定相应的预防措施。
实验结果
•检测结果显示，样本群体中的抗体水平明显升高。
•鸡群中的抗体阳性率达到95%以上，为鸡新城疫感染的警戒线。
结论
•根据本次实验的结果，可以推断该鸡群已经感染了鸡新城疫病毒。
•建议立即采取相应的疫情控制措施，包括隔离感染鸡只、加强清洁消毒等。
展望
•随着科技的发展，抗体检测方法将更加准确和高效。
•将来可以探索更多的抗体检测技术，如PCR等，以提高鸡新城疫的早期检测和预防效果。
参考资料
•[鸡新城疫病毒抗体检测方法研究进展](
•鸡新城疫病毒抗体检测方法研究进展. 农业科学研究. 2020. •鸡新城疫病毒感染与抗体检测技术综述. 动物医学进展. 2018.。
新城疫抗体测定技术
2013动物疫病检测新技术暑期培训
结果判定（新城疫抗体测定）
在生理盐水对照孔出现正确结果（红细胞完全流下）的情况下，将反 应板倾斜，从背侧观察，正确判读被检血清、标准阳性血清和标准阴 性血清的HI效价，以nLog2方式报告结果，并填写结果报告单。
只有当阴性血清与标准抗原对照的HI滴度不大于2log2，阳性血清与标 准抗原对照的HI滴度与已知滴度相差在1个稀释度范围内，并且所用 阴、阳性血清都不发生自凝的情况下，HI试验结果方判定有效。
采血器或灭菌干净青霉素小瓶中凝固成斜面，室温下2-3 小时或4℃冰箱中过夜使血清析出，也可通过离心加快血 清析出。 血清为淡黄色透明液体。
2013动物疫病检测新技术暑期培训
翅静脉采血
针头在静脉血管一侧倾斜刺 入皮肤，再与血管平行进针后刺 入血管，见有少量回血即可采集 血液，采血完成后马上用手压迫 止血。
3. 配制1%RBC悬液
根据红细胞的体积，计算所需生理盐水量，用所需生 理盐水将红细胞泥全部冲入小烧杯中，摇匀即可。
注意：摇匀时动作要轻柔，以防红细胞破碎或液体外溢。
2013动物疫病检测新技术暑期培训
三、血凝试验（HA）
1．基本原理
血凝素 纤突
血凝素纤突 受体
RBC
血凝性病毒
有相应受体的红细胞
红细胞凝集（HA现象）
血凝素纤突
血凝素纤突受体 RBC RBC RBC RBC RBC
HA
血凝性病毒
RBC
RBC
有其受体的红细胞
红细胞凝集（HA现象） Ag、Ab不对应
血凝素纤突
v
v
RBC
HI
血凝性病毒 抗体
v RBC v
RBC
新城疫抗体测定技能
新城疫抗体测定（一）血凝试验（HA）：取96孔板，按以下步骤操作：1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul为红细胞对照（20分）；2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1-2-12（25分）。
3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀（25分）。
4、室温静置10-30分，观察结果（10分）。
5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价，用2n表示。
结果判定：以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度（20分）。
注意:由于新城疫病毒含有神经氨酸酶，它能破坏红细胞表面的血凝素受体，使凝集的病毒从红细胞上解脱下来，所以要及时观察结果。
（二）血凝抑制试验（HI）：取一96孔板，按以下步骤操作：1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价乘4即为4个单位血凝素的稀释度（10分）。
2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入50ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔…,依次稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释度为2-1-2-12（20分）。
3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡2min混匀（20分）；4、室温静置20min（5分）；5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀（15分）。
6、室温静置10--30分，观察结果（10分）；结果判定：以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制（HI）滴度（20分）。
鸡群HI滴度的高低在一定程度上反映了免疫保护水平的高低。
鸡群HI滴度的高低在一定程度上反映了免疫保护水平的高低。
赛鸽新城疫抗体检测
２ ． １ 血 凝 及 结 果
１ ％鸡 血 球 的 制 备 ：５ ｍ ｌ 注 射 器 先
吸取 ２ ｍ ｌ 抗 凝 剂 ，然 后 采 集 Ｓ Ｐ Ｆ鸡 血 ．
王蕾 赵 强 一 迪 成 德 信鸽 用 品 一 北 京， 一有 限菌 公Ｐ 司 １ ０ ０ ０ 一 离心 用灭 Ｂ Ｓ洗 ４遍 ， 前 ｉ 遍
１ ５ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ ， 离 心 ５ ｍｉ ｎ ， 最 后ｘ ｌ Ｐ Ｂ Ｓ液 于
各 孔 中 。 用 微 量 移 液 器 吸 取 待 检 血 清 ２ ５ Ｍ 置 于第 １ １ 孔 中 ，然 后 倍 比稀 释 至
１ ５ ０ ０ ｒ ／ ａｉ ｒ ｎ ，离心 １ ０ ｍｉ ｎ 。按 照体 积 比加
疫 一 次 新 城 疫 疫 苗 ， 免 疫 一 次 新 城 疫
集 的血 清最 大稀 释度 为该 血 清 的 Ｈ Ｉ 滴
度 ， 以 ２的 指 数 表 示 。 经 过 检 测 本 公 司 鸽 舍 免 疫 半 年 的 鸽 子 新 城 疫 抗 体 效
价为２ 。 ３ 分 析
抗原 效价 为 １ ：２ ５ ６ ．抗 原 做 ２ ５ ６ ／ ４ ＝ ６ ４倍 稀 释 。 即 取 ０ ． １ ｍ ｌ 抗 原 加 人
孑 Ｌ 至 第 ５孔 加 Ｐ Ｂ Ｓ ２ ５ １ ｘ １ ．微 量 移 液 器 吸 取 ４单 位 抗 原 ２ ５ １ ｘ １ 分 别 加 入第 １孔 中 ，从 第 １ 孔 开 始挤 压 ６ ～ ７次 混 合 ． 后 吸出 ２ ５ １ Ｍ 至第 ２孑 Ｌ ，依 次 倍 比稀 释
到 第 ５孔 ，弃 去 ２ ５ １ Ｍ。 用 微 最 移 液 器
察 结 果 。结 果 可 见 第 ８个 孔 全 部 凝 集 ． 而 第 ８个 孔 没 有 完 全 凝 集 。 这 样 判 断 随 着 近 年 赛 鸽 比赛 的 发 展 ，越 来
新城疫抗体检测
一．试验材料：注射器、抗凝剂、离心机、吸管、微量滴管、平皿、血液、抗原、有机玻璃血凝板25孔、生理盐水、废弃瓶。
二．试验步骤：㈠红细胞悬浮液的制备：①采血，用有抗凝剂的注射器采血5-10毫升。
②离心，将血液吸入离心管中，经3000转离心5-10分钟，吸取上清夜和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液洗涤，再加3000转离心5-10分钟，反复三次，将最后一次离心后的细胞泥按5%稀释。
㈡抗原的效价①用微量滴管吸取2.5毫升生理盐水滴入玻璃血凝板。
②放入抗原2滴，每孔反复十余次。
③放入红细胞离心过的7%的比例反复十余次。
④沉淀。
⑤恒温37度，20-25分钟。
㈢红细胞凝集效价：能使鸡红细胞完全凝集的病毒液的最高稀释倍数。
①滴管向玻璃血凝板每孔加生理盐水一滴（0．025）②用病毒抗原液0．025毫升加入第一孔内，旋转稀释，反复操作十余次以上，然后移入第二排，第三排。
（稀释倍数依次为1：2—1：2048，最后孔为红细胞对照），最后一次丢弃。
③再以微量滴管加0。
5%红细胞悬浮液一滴（同上面抗原反过来操作）。
④振荡，再置37 恒温箱20-30分钟。
㈣最后的洗涤工作（微量反应板的特点）①反应板先用自来水反复冲净污物后。
②干燥后，放2-3%浓度的盐酸中浸泡24小时。
③捞出后用自来水冲洗多次，干燥。
④放1%氢氧化钠过夜。
⑤取出，洁净水冲洗37干燥。
五．结果判定：凡能使4个凝集单位病毒凝集红细胞的作用完全受到抑制的血清最高稀释度（倍数）称为血凝抑制价。
血凝抑制价在1：80以上为阳性，1：40为可疑，1：20为阴性。
新城疫抗体测定的规范操作___
1测定的器材及使用方法1.1托盘天平托盘天平测量开始前,必须先将游码移到标尺左端的零刻度处,然后才开始调节平衡螺母,使天平平衡。
若将平衡螺母左右移至尽头天平仍不得平衡,则应检查原因,不能移动游码来达到平衡。
1.2离心机离心机使用时离心管液体不能装得太满,对称放置的试样必须配平。
1.3移液枪移液枪吸头装配时需将移液器垂直插入吸头,左右微微转动,上紧即可,切勿用移液器反复撞击吸头来上紧。
1.4移液器移液器吸液时应垂直吸液,吸头尖端侵入液面3mm以下,吸液时枪头应预润湿,然后再正式移液。
吸液可将按钮按到第一档吸液,释放按钮。
放液时先按下第一档,打出大部分液体,再按下第二档,将余液排出。
吸取的过程应该做到“慢吸快打”,在吸液时要慢、准,放液时对准后速度要快,可以避免打完后吸头下存留液体,保证加入的液体体积一致。
2规范的采血方法采血前采血者先将注射器内吸入3.8%的枸橼酸钠。
采血时,一人将鸡侧卧保定,一人固定鸡的头部和脚;从侧翅膀采血,一手固定采血部分,一手采血;采血完毕后采血者一手将抗凝剂和血液轻轻摇匀,一手用干棉球按压采血部位止血。
采血部位最好从翅静脉丛刺入,比较容易采血成功且不容易淤血。
3红细胞悬液的配制血液采集完毕需取下针头,把血液沿离心管的管壁缓慢注入离心管中,防止红细胞的破坏。
然后轻轻来回晃动离心管,使血液与抗凝剂充分混合,配平后置于离心机中开始离心。
离心完毕,应先选用5mL的移液器吸取上面的液体,然后再选用1 mL或200μL的移液器吸取,最好以画圈的方式吸取,比较容易把白细胞和血小板吸干净。
最后一次离心完毕,按照计算量用移液器从离心管底部吸取红细胞放入加好生理盐水的烧杯中,再反复回用生理盐水将移液器吸头里的红细胞洗下来,保证配制红细胞浓度的准确性。
4血凝试验血凝试验操作过程中需要注意的是使用微量移液器吸取液体时,吸头需碰壁以除去多余的液体;加样时应将所加物在V型板的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出;倍比稀释时,要注意避免产生过多的气泡,影响结果的准确性;加红细胞时最好悬滴或由后往前加,因为孔内已有稀释的抗原,如果吸头接触到孔内混合液,会造成各个孔间液体相互污文章编号:1004-2342(2013)02-0048-02中图分类号:S852.65+9.5文献标识码:C新城疫抗体测定的规范操作向双云,周珍辉(北京农业职业学院,北京房山102442)疫病防控经费管理办法》出台,完善财政投入机制,构建与国家动物疫病防治工作相适应的财政支持政策。
新城疫抗体水平检测
新城疫抗体水平检测The document was prepared on January 2, 2021新城疫的血凝和血凝抑制试验高若开一、实验目的1.掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操作方法和结果判定方法.2.分析血凝和血凝抑制试验的影响因素,用以确定最佳免疫时间、判定免疫效果和辅助疾病诊断.二、实验内容1.血凝试验HA检测新城疫抗原2.血凝抑制试验HI检测新城疫抗体三、实验原理1.血凝试验HA原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞发生凝集,这种凝集红细胞的现象称为血凝HA,也称直接血凝反应.2.血凝抑制试验HI 原理：当在病毒的悬液中加入特异性抗体,且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时,则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触.这时红细胞的凝集现象就被抑制,称为红细胞凝集抑制HI 反应,也称血凝抑制反应.四、实验材料抗体抗原病毒颗粒 红细胞离心机、恒温箱、冰箱、振荡器、96孔血凝版5块、微量移液器20-100微升可调、吸液尖若干、洗耳球、离心试管、普通试管、试管刷、烧杯、吸量管、一次性注射器、ND 标准抗原、1%红细胞悬液、抗凝剂、生理盐水.五、实验步骤一抗凝剂的配制将1克柠檬酸钠用25毫升生理盐水稀释备用.1毫升抗凝剂可用于采集9毫升血液.二10%红细胞悬液的配制1、用注射器吸取毫升抗凝剂无免疫健康青年公鸡的红细胞毫升.2、1500转离心5分钟,吸弃上清液.3、用5-10倍生理盐水1500转洗涤3次,前两次5分钟,后一次10分钟.4、吸弃上清液,用吸量管吸取红细胞,配制成10%红细胞悬液.5、2-6摄氏度储存,备用.三血凝试验HA1.在血凝板上第一排的1－12孔内各加入50ul生理盐水2.将系苗用生理盐水5毫升稀释,在第1孔内加入50ul病毒抗原,然后依次倍比稀释至第11孔,最后弃50ul.3.每孔加入1％鸡红细胞悬液50ul4.轻轻振荡均匀,后放于室温或37℃中静置30分钟5.结果判定血凝效价测定结果判定标准1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底,即100％凝集；2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底,当边缘不整齐而稍向孔底集中,即75％凝集；3、＋＋：红细胞形成一个环状,四周有凝集块,即50％凝集；4、＋：红细胞于孔底形成圆团,边缘不够光滑,四周稍有凝集块,即25％凝集；5、－：红细胞于孔底形成圆团,边缘光滑整齐,即无凝集.血凝价的判定以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒的血凝价,即为一个凝集单位.上表看出,该新城疫病毒液的血凝价为1:32,则l:32为1个血凝单位,1:16、l:8分别为2、4个血凝单位,或将32/4=8,即1:8稀释的病毒液为4个血凝单位.四4个血凝单位抗原的配制根据判定结果,吸取1毫升已稀释的病原溶液再以8倍稀释,即为4个血凝单位的标准抗原.五血凝抑制试验1、在血凝板上1－12孔内各加入50ul生理盐水；2、在第1孔内加入被检血清50ul,然后倍比稀释至第11孔,最后弃50ul；3、第1－12孔内加入4单位抗原50ul第12孔为病毒对照；4、每孔加入1％鸡红细胞悬液50ul；5、轻轻振荡均匀,后放于室温或37℃中静置30分钟6、结果判定血凝抑制效价测定结果判定标准1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底,即100％凝集；2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底,当边缘不整齐而稍向孔底集中,即75％凝集；3、＋＋：红细胞形成一个环状,四周有凝集块,即50％凝集；4、＋：红细胞于孔底形成圆团,边缘不够光滑,四周稍有凝集块,即25％凝集；5、－：红细胞于孔底形成圆团,边缘光滑整齐,即无凝集.血凝抑制价的判定将反应板倾斜成45度角,沉于管底的细细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀,表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底,凝成均匀薄层,倾斜后红细胞不流动,说明红细胞被病毒所凝集.能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数,称为该血清的红细胞凝集抑制效价,用被检血清的稀释倍数或以2为底的对数10g2表示.如上例,该血清的红细胞凝集抑制效价为1：4或HI效价为210g2.结果分析：在对照出现正确结果的情况下,已完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度.1一般认为鸡的免疫临界水平为1:8成年或1:16雏鸡,随地区不同而稍有差异.2鸡血清HI抗体效价高于1:16时可适当推迟新城疫免疫的时间,HI抗体效价在1:16以下,须进行新城疫疫苗接疫种,在新城疫流行的地区或鸡场,鸡的免疫临界水平应稍提高.3鸡群的HI抗体水平血凝抑制滴度是以抽检样品的HI抗体效价㏒2的几何平均值表示的.如果某鸡群的10份样品中,HI抗体效价㏒2为8的有3份样品,为7的有5份样品,为6的有2份样品,它们的平均值为：8×3＋7×5＋6×2/3＋5＋2＝平均水平在410g2以上,说明该鸡群为免疫鸡群.若在检样中HI抗体效价的最高值与最低值相差太大时,则不能用上法计算平均水平,应根据临界水平以下的样品数在全部样品中所占的百分比决定免疫与否.4大型养鸡场,每次进行抽测时,抽样率一般不低于％一％,小型鸡群,抽样率应有所增加,一般认为理想的抽样率应为％.5鸡群接种新城疫疫苗后,经2～3周测血清中的HI抗体效价,若提高2个滴度以上,表示鸡的免疫应答良好,疫苗接种成功；若HI抗体效价无明显提高,表示免疫失败.6若有10%以上的鸡群出现1110g2以上的高血凝抑制滴度,说明鸡群已受新城疫强毒感染.若监测鸡群的免疫水平,用血凝抑制滴度在410g2的鸡群保护率为50%左右；在410g2以上保护率达90-100%；在410g2以下的非免疫鸡群保护率约9%,免疫过的鸡群为43%.六、注意事项1、红细胞用前请摇匀.2、用枪加样定要准确,尽量不要有气泡.3、结果判定要有耐心.4、HA和HI勿相混.。
新城疫抗体水平测定
A.保证枪头扣紧 B.匀速将生理盐水吸打至孔内
(要避免枪头附着多余生理盐水滞留在孔内，引起误差)
A.要匀速吸打保证枪头顶端始终处于液面下方 B.避免出现气泡，以免出现试验误差。
1.5 结果判定:
A B C D
血凝价: A:26
B:25
C:22 D:27
2. HI(血凝抑制试验):
稀释液
Ag
2.1 四位病毒的制备
重复5次）
A.清洗红细胞时，先用1000微升量程的移液枪吸取上清液; B.临界底层红细胞时，换用100微升量程的移液枪，
轻轻沿离心管内壁一周吸取红细胞上层的杂质， 避免大量吸取纯红细胞造成浪费。
稀释液
纯红细胞
1.3 1%红细胞悬液的制备：
1.3.1计算出所需红细胞总量之后， 1.3.2于弃去上清液的纯红细胞中吸取定量红细胞 1.3.3于相应生理盐水中， 1.3.4反复吸打混匀，完成配置。
2.4 完成抗体滴度报告单
谢谢观 看！
HA （血凝试验）
Hemagglutination
“ 血凝素与红细胞（RBC）表面相应受体结合， 引起红细胞（RBC）凝集，以测定病毒的含量 ”
HI （血凝抑制试验）
HemagglutinationIn
“ 抗体与血凝素结合，封闭血凝素， 使之不能与红细胞结合 ”
“ 新城疫抗体水平测定试验 ”
怎么做？
器材及耗材的准 备：
活体SPF公鸡一只及消毒用品
1. HA(血凝试验）：
1.1 采血（ 3ml鸡血 + 0.6ml抗凝 剂）
A.采血完毕后立即将采血器内的血液轻轻摇匀，避免凝血； B.摇匀后，沿离心管壁缓慢注入离心管 C.加入适量的生理盐水作为清洗缓冲液。
新城疫抗体水平检测
新城疫的血凝和血凝抑制试验高若开 一、实验目的1.掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操作方法和结果判定方法。
2.分析血凝和血凝抑制试验的影响因素，用以确定最佳免疫时间、判定免疫效果和辅助疾病诊断。
二、实验内容1.血凝试验(HA)检测新城疫抗原2.血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体三、实验原理1.血凝试验（HA ）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA ）,也称直接血凝反应。
2.血凝抑制试验（HI ）原理：当在病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。
这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI ）反应，也称血凝抑制反应。
抗体病毒颗粒红细胞四、实验材料离心机、恒温箱、冰箱、振荡器、96孔血凝版（5块）、微量移液器（20-100微升可调）、吸液尖（若干）、洗耳球、离心试管、普通试管、试管刷、烧杯、吸量管、一次性注射器、ND标准抗原、1%红细胞悬液、抗凝剂、生理盐水。
五、实验步骤（一）抗凝剂的配制将1克柠檬酸钠用25毫升生理盐水稀释备用。
1毫升抗凝剂可用于采集9毫升血液。
（二）10%红细胞悬液的配制1、用注射器吸取0.5毫升抗凝剂无免疫健康青年公鸡的红细胞4.5毫升。
2、1500转离心5分钟，吸弃上清液。
3、用5-10倍生理盐水1500转洗涤3次，前两次5分钟，后一次10分钟。
4、吸弃上清液，用吸量管吸取红细胞，配制成10%红细胞悬液。
5、2-6摄氏度储存，备用。
（三）血凝试验（HA)1.在血凝板上第一排的1－12孔内各加入50ul生理盐水2.将系苗用生理盐水5毫升稀释，在第1孔内加入50ul病毒抗原，然后依次倍比稀释至第11孔，最后弃50ul。
3.每孔加入1％鸡红细胞悬液50ul4.轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分钟5.结果判定血凝效价测定结果判定标准1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集；2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集；3、＋＋：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集；4、＋：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集；5、－：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集。
新城疫抗体检测方法
新城疫抗体检测方法
新城疫（Newcastle Disease）抗体检测方法主要包括病毒中和试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、凝集试验和血凝试验等。
1. 病毒中和试验（Virus Neutralization Test，VNT）：该方法通过混合患者血清与新城疫病毒，观察病毒能否被抗体中和。
该方法具有高特异性和敏感性，是目前最可靠的抗体检测方法之一。
2. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：该方法利用新城疫抗原与抗体的特异性结合，通过检测被检样本中的抗体与抗原之间的反应来确定抗体水平。
ELISA方法具有操作简便、高效、高灵敏度等优点，广泛应用于新城疫抗体检测。
3. 凝集试验：该方法通过将新城疫抗原与抗体混合后观察是否出现凝集反应来确定抗体水平。
凝集试验操作简便，但对实验条件和观察技巧要求较高，故准确性可能较低。
4. 血凝试验：该方法是通过观察被检样本与新城疫抗原接触后是否出现异常凝集或沉淀反应来确定抗体水平。
血凝试验简单易行，但具有操作上的主观性和不确定性。
总结来说，病毒中和试验和ELISA是目前常用的新城疫抗体检测方法，具有较高的准确性和可靠性，能够提供重要的诊断和流行病学资料。
其他方法如凝集试
验和血凝试验等可作为辅助手段使用。
新城疫HI抗体监测
（2）HA方法与步骤(μL)
孔号 1 2 3 ……. 10 11 对照
病毒稀释倍数
21
22
25 25 25 25
23
25 25 25 25
……. 210
…….. 25 …….. 25 …….. 25 …….. 25
211
25 25 25 25 25 弃去25 25 25
生理盐水或PBS 25
25 病毒（已知） 生理盐水或PBS 25 1%红细胞悬液 25
D.
3、病毒的红细胞凝集试验（HA）
（1）凝集价的测定
（2）HA方法与步骤 （3）判定结果
（1）凝集价的测定
将已知病毒材料，稀释成不同的稀释倍数，进行 HA 试验，出现血凝现象的各稀释孔中，能使红细胞完全 凝集的病毒的最大稀释倍数者即定为凝集价。又称为 该病毒的血凝滴度。 4单位病毒 即将一个血凝单位的稀释度增加4倍浓度， 例如一个血凝单位为 1:64 ， 4 个血凝单位则为 64/4=16 倍稀释。
新城疫HI抗体监测
王晓泉 刘慧谋
新城疫（newcastle disease,ND）是由新城疫 病毒引起禽的一种急性、热性、败血性和高度 接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神 经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。具有很高的 发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传 染病。 病鸡是本病的主要传染源，鸡感染后临床症状 出现前24小时，其口、鼻分泌物和粪便就有病 毒排出。病毒存在于病鸡的所有组织器官、体 液、分泌物和排泄物中。
96孔V型微量反应板、微量振荡器、 病毒材料、红细胞悬液、生理盐水或 PBS、微量移液器、注射器、抗凝剂、 离心机、恒温箱等。
四、实验步骤和方法
1. 血清样品的采集、运送和保存 2. 制备鸡红细胞悬液 3. 病毒的红细胞凝集试验（HA） 4. 病毒的红细胞凝集抑制试验（HI）
新城疫抗体水平测定方法
新城疫抗体水平测定方法一、背景介绍新冠病毒疫情爆发以来，全球范围内都在积极抗击疫情。
其中一个重要的指标就是人体对新冠病毒的抗体水平。
因此，开发一种准确、快速、可靠的新城疫抗体水平测定方法对于控制疫情和保障公共卫生至关重要。
二、实验材料1.血清样本：采集患者或者健康人群的血清样本。
2.ELISA试剂盒：包括酶标板、酶标板封闭剂、酶标板洗涤缓冲液、检测抗体试剂和检测抗体阳性对照品等。
3.洗板机：用于洗涤酶标板。
4.微孔吸光度计：用于读取吸光值。
三、实验步骤1.准备工作（1）将试剂盒从-20℃低温保存室中取出并放置于室温下30分钟左右恢复至常温。
（2）将样本放置于室温下30分钟左右恢复至常温。
（3）将洗板机预热至37℃。
2.制备样本（1）将血清样本离心10分钟，取上清液，用PBS稀释至1：100。
（2）将酶标板取出，每孔加入100μL封闭剂，室温下放置30分钟。
（3）倒掉封闭剂，每孔加入100μL稀释后的血清样本或阳性对照品，室温下放置60分钟。
（4）倒掉样本或阳性对照品，每孔加入300μL洗涤缓冲液，在洗板机中洗涤5次。
3.检测抗体（1）倒掉洗涤缓冲液，每孔加入100μL检测抗体试剂，室温下放置30分钟。
（2）倒掉检测抗体试剂，每孔加入300μL洗涤缓冲液，在洗板机中洗涤5次。
4.结果分析（1）将每个酶标板孔内的吸光值读取并记录下来。
（2）计算阳性对照品的平均吸光值，并根据试剂盒说明书计算出检测样本中新城疫抗体的相对水平。
四、实验注意事项1.严格按照试剂盒说明书操作，避免操作失误。
2.样本处理过程中要注意消毒和无菌操作。
3.酶标板和试剂应当在规定温度下保存，并在使用前充分恢复至常温。
4.洗板机的使用要按照说明书进行，避免出现故障。
五、实验结果解读根据试剂盒说明书，可以将检测样本的抗体水平分为阴性、弱阳性、阳性和高阳性四个级别。
其中，阴性表示检测样本中没有新城疫抗体；弱阳性表示检测样本中的新城疫抗体水平较低；阳性表示检测样本中的新城疫抗体水平明显升高；高阳性表示检测样本中的新城疫抗体水平非常高。
鸡新城疫的免疫检测程序
教学实习内容一．鸡新城疫的免疫检测目的：系统掌握鸡新城疫的抗体检测技术。
实验材料：新城疫疫苗、待测鸡蛋、生理盐水、5%柠檬酸钠、1%鸡红细胞悬液、胶头滴管、注射器、锥形瓶、15ml离心管、试管、96孔V型板、离心机等1.1%鸡红细胞悬液的制备（1）每组采取3ml左右健康鸡静脉血，迅速注入装有约0.3-0.4ml抗凝剂的离心管内，轻轻颠倒混匀；（2）加入适量生理盐水，混匀，3000rpm*10min，吸弃上清液和红细胞沉淀上层的白细胞层（3）加入适量生理盐水，重悬红细胞，3000rpm*10min，吸弃上清液。
如此，重复3次。
（4）量取红细胞沉淀的体积，用生理盐水配成1%的红细胞悬液，待用。
2.HA试验1%红细胞根据所用NDV液的凝集价，配制4单位病毒液。
3.HI试验（1）待测卵黄样品的制备：用镊子敲破鸡蛋小头，将蛋清倒去，留蛋黄在蛋壳内；吸取0.5ml 生理盐水，放入小试管内；去掉部分蛋壳，用1ml注射器（不带针头）吸取蛋黄0.5ml，加到有生理盐水的试管内，混匀（避免其很多泡）待检。
（2）按照检测血清抗体的方法检测卵黄中的抗体。
被检鸡蛋卵黄1%红细胞（3）判定和记录所检测鸡蛋的卵黄抗体效价。
结果与分析对所测得的结果进行分析，确定该鸡群目前的免疫状态，并对生产提出合理建议或给出科学指导。
分析并指出影响本实验结果的主要因素。
二．传染病的分子生物学检测——PCR检测（以PCV2为例）1.DNA提取：将猪肝脏称重后，按照1:3（W:V）的比例加入PBS，用组织研磨器研磨成组织悬液，反复冻融3次后8000 rpm离心5 min，取上清300 μL提取DNA。
取冻融、离心后的组织悬液/血清300μL，加入300 μL细胞裂解缓冲液和5 μL的蛋白酶K(20 mg/mL)，混匀，置50 ℃消化2 h，每隔30 min，剧烈震荡一次；加入等体积的Tris饱和酚，充分振荡混匀，4 ℃ 12000 rpm 离心10 min；取上层水相转入一新的l.5 mL eppendorf管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混匀后，4 ℃ 12000 rpm 离心10 min；用酚：氯仿：异戊醇（25:24: l）重复抽提一次；取上层水相转入一新的l.5 mL eppendorf管中，加入2倍体积冰预冷的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L醋酸钠（pH 5.2），室温放置30 min 以沉淀基因组DNA；4 ℃ 12000 rpm离心15 min，弃上清；用75%乙醇1 mL 洗涤沉淀，4 ℃ 12 000 rpm 离心10 min后，弃去上清，自然晾干。
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是新城疫抗体监测和诊断的重要手段
是2011和2012年全国农业技能大赛的比赛项目，据
说还将是2014年全国农业技能大赛的比赛项目
2013动物疫病检测新技术暑期培训
新城疫抗体测定基本操作规程
制备被检血清 制备1%RBC悬液 HA试验，测病毒的血凝价 配制4单位病毒 HI试验，测血清的抗体滴度 抗体滴度报告，以nlog2形式报告
孔
号
1
25 25
2
25 25
3
25 25 25 25
4
5
25 25
6
25 25
7
25 25
8
25 25
9
25 25
10
25 25
11
25 盐水 被检血清
2013动物疫病检测新技术暑期培训
配平注意事项
1．离心管、离心套管和管中液体作为一个整体进行配平 2．离心管中液体不能太满
2013动物疫病检测新技术暑期培训
2. 离心洗涤红细胞
（1）共洗涤3次，转速和时间均为：2000r/min、5min。 （2）第1次离心时间到，用移液器吸取并弃掉上清液、白细胞和血小 板，加生理盐水，吹打混匀红细胞，配平后进行第2次离心，依此进行 第3次离心。 （3）第3次离心时间到，吸取并弃掉上清液、白细胞和血小板后，读 出离心管中红细胞的体积 。
2013动物疫病检测新技术暑期培训
国标ND抗体测定技术
山东畜牧兽医职业学院 朱明恩
2013动物疫病检测新技术暑期培训
本技术依据中华人民共和国国家标准制定
国标：新城疫诊断技术（GB/T 16525-2008）
2009-05-01实施
2013动物疫病检测新技术暑期培训
安排本内容的原因
是开设畜牧兽医类专业学校学生的必会技能
3. 配制1%RBC悬液
根据红细胞的体积，计算所需生理盐水量，用所需生 理盐水将红细胞泥全部冲入小烧杯中，摇匀即可。
注意：摇匀时动作要轻柔，以防红细胞破碎或液体外溢。
2013动物疫病检测新技术暑期培训
三、血凝试验（HA）
1．基本原理
血凝素 纤突
血凝素纤突 受体
RBC
血凝性病毒
有相应受体的红细胞
红细胞凝集（HA现象）
9
29 25 25 25 25
10
210 25 25 25 25
11
211 25 25 25 25
12
对照
病毒稀释倍数 生理盐水 标准抗原
25
弃25
生理盐水
1%RBC悬液
25 25
振荡混匀，室温即20℃～25℃下静置40 min后观察结果。若环境温度太高，放4℃静置60 min。生理盐水对照孔红细胞成明显钮扣状沉到孔底时判定结果。
HA试验成功的关键环节（HI同） 正确使用微量移液器（吸头固定紧，每次都要排空）；吸头不能 混用；悬滴加样；混匀要彻底；时间和温度合适。
2013动物疫病检测新技术暑期培训
四、4单位病毒的配制
HA试验，测定做NDV病毒的血凝效价 介 绍 ： 回 归 试 验
血凝效价除以4即为4V的稀释倍数
用生理盐水稀释HA试验的NDV液
2013动物疫病检测新技术暑期培训
心脏采血
鸡右侧卧保定，上腿 自然踡曲，在上腿膝关节 稍前下方约1cm处（心脏
搏动最明显的部位）垂直
地面进针采血。
2013动物疫病检测新技术暑期培训
二、制备1％RBC悬液
1. 制备抗凝血
在采血器（注射器）中吸入抗凝剂（3.8%的枸橼
酸钠，抗凝比例为1：10），心脏或静脉采血3-4mL， 颠倒采血器使血液与抗凝剂充分混匀，然后将血液注 入离心管中，用天平配平。
血凝素纤突
血凝素纤突受体 RBC RBC RBC RBC RBC
HA
血凝性病毒
RBC
RBC
有其受体的红细胞
红细胞凝集（HA现象） Ag、Ab不对应
血凝素纤突
v
v
RBC
HI
血凝性病毒 抗体
v RBC v
RBC
v
v
RBC RBC
RBC
Ag、Ab对应
1．反应原理
２．HI试验操作术式（微量法，单位ul）
2013动物疫病检测新技术暑期培训
仪器及材料
非免疫公鸡、 pH7.2生理盐水、 新城疫标准抗原、 新城标准阳性血清、新城标准阴性血清、 3.8%的枸橼 酸钠、96孔V型板、微量移液器、吸头、微型振荡器、 温箱、离心机、天平、采血器等。
2013动物疫病检测新技术暑期培训
一、制备被检血清
心脏或静脉采血2-3mL（不加抗凝剂），采血后使血液在
4单位病毒液
2013动物疫病检测新技术暑期培训
回归试验
用4V进行的HA试验（用4个孔），用于检验4V配 制是否正确。 4V配制正确的判定标准： 前2个孔完全凝集，后2个孔不完全凝集，如下图：
2013动物疫病检测新技术暑期培训
五、血凝抑制试验（HI）
当病毒与相应抗体结合后，病毒凝集红细胞 的能力受到抑制，称为病毒的血凝抑制。
采血器或灭菌干净青霉素小瓶中凝固成斜面，室温下2-3 小时或4℃冰箱中过夜使血清析出，也可通过离心加快血 清析出。 血清为淡黄色透明液体。
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翅静脉采血
针头在静脉血管一侧倾斜刺 入皮肤，再与血管平行进针后刺 入血管，见有少量回血即可采集 血液，采血完成后马上用手压迫 止血。
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2．操作术式（微量法，单位ul）
孔 号 1
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2
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3
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新的操作方法和旧版有哪些不同？ 生理盐水、剂量、 反应条件
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HA试验结果及规律
完全凝集：红细胞呈伞状均匀分布于孔底
不完全凝集：介于两者之间
完全不凝集：红细胞呈明显钮扣状沉到孔底
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病毒的HA价（血凝滴度）：能使红细胞发生完全凝集的病毒最大稀释倍 数称为病毒的血凝价，常用nlog2或1：xxx表示。
注意：吹打混匀红细胞时不要太用力，以免破坏红细胞。
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离心机的使用
离心机放置平稳
离心管对称放入离心机，使其处于平衡状态 按档位依次升高转速至所需速度。离心时间到，将转
速调为零，离心机停转后方可取出离心管。
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