拟南芥筛选培养基(1L)
[转载]拟南芥培养
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[转载]拟南芥培养一、拟南芥播种种子装入dorf管内，20μl种子加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；吸去乙醇，加入1ml 50%次氯酸钠：50%无菌水：0.05%吐温（or 5%漂白粉），震荡洗涤15-20分钟；稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠或漂白粉，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；将种子用接种环均匀铺于MS培养基上，用封口膜封口，放入4℃冰箱内冷处理2-3天（春化）。
MS培养基的用量：直径为9cm的培养皿用25ml，直径为6cm 的培养皿用12.5ml。
加培养基时先将凝固的培养基用微波炉高温5分钟左右至全部解冻，然后慢慢冷却至不太烫手时倒板，如要加潮霉素等抗生素也是在此次加，加入后摇匀然后倒板。
倒板后至自然冷却即可铺种，如水分较多或板不够硬，亦可于倒板后将培养皿盖打开晾10分钟左右（此时超净台要关闭）。
种子的杀菌、清洗、铺板等过程在超净工作台上无菌操作，操作者进入超净工作台要用酒精棉球擦拭手、器具、超净台，防止感染细菌、真菌。
二、MS固体培养基制备1．培养基母液的配制和保存MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。
这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。
现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。
大量元素(母液Ⅰ，20×) mg／LNH4NO3 33 000KNO3 38 000CaCl2·2H2O 8 800MgSO4·7H2O 7 400KH2PO4 3 400微量元素(母液Ⅱ，200×) mg／LKI 166H3BO3 1 240MnSO4·4H2O 4 460ZnSO4·7H2O 1 720Na2MoO4·2H2O 50CuSO4·5H2O 5CoCl2·6H2O 5铁盐(母液Ⅲ，200×) mg／LFeSO4·7H2O 5 560Na2-EDTA·2H2O 7 460有机成分(母液Ⅳ，200×) mg／LⅣA肌醇 20 000ⅣB烟酸 100盐酸吡哆醇(维生素B6) 100盐酸硫胺素(维生素B1) 100甘氨酸 400上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。
园艺-拟南芥侵染和筛选的流程
1摇菌（1）小摇：在超净工作台中取出无菌离心管，加入4ml纯净LB液体培养基，加入4ul 50mg/ml浓度的卡那霉素，加入8ul 10mg/ml浓度的利福霉素，加入阳性菌菌液，摇匀；在摇床中28℃培养2天；（2）大摇：在250ml三角瓶中加入150ml纯净LB液体培养基，加入150ul 50mg/ml浓度的卡那霉素，加入300ul 10mg/ml浓度的利福霉素，加入1.5ml菌液，过夜摇菌。
2配侵染液（1）1L超纯水中加入10g蔗糖及40ul表面活性剂Silwet L-77，磁力加热搅拌器搅拌均匀；（2）大摇后的菌液用分光光度计测OD600，用离心后的上清液作为对照，菌液OD600在0.8~1.0之间时，可以进行下一步；（3）将菌液倒入50ml圆底离心管中，常温4000g离心10分钟，收集菌株；（4）倒掉上清，加入少许侵染液，用移液器把菌打散打匀，倒入侵染液中。
3农杆菌花序侵染（1）托盘垫上报纸，润湿，取八盆培养良好且适合侵染的拟南芥，每盆四株；（2）将全部的花全浸到侵染液中，全部的花均需浸湿，若花无法碰到侵染液，则用戴手套的手浸湿，每盆浸湿2分钟；（3）然后将植株迅速平躺放到托盘中，用黑塑料袋盖住；（4）暗处理24小时后正常培养；（5）用于摇菌的三角瓶，侵染用的瓶子、50ml插口圆底离心管及剩下的侵染液与菌液上清均需高温高压灭菌。
4收种子侵染后的拟南芥苗正常培养，30天时收取第一批种子，40天时收取第二批种子，晒干7~10天。
5 筛选T1代转基因阳性植株5.1 选择性培养基筛选（1）将种子倒入10ml离心管中，加满拟南芥种子消毒液（0.5%SDS、0.8%NaClO），均匀打散种子，手摇振荡15分钟；（2）在超净工作台中倒掉消毒液，加满灭菌水，将种子完全打散，振荡洗涤；（3）室温3000g离心2分钟，在超净工作台中倒掉无菌水，注意不要倒掉种子，重复进行五次洗涤过程；（4）加入0.2%琼脂糖悬浮种子，用移液器均匀涂在50ug/ml卡那霉素100ug/ml头孢菌素的MS固体培养基板上，每个板3ml，晾十五分钟，等水被板吸干后再封膜；（5）暗处理春化3d；（6）将选择性培养基上长出的T1代转基因阳性植株移到土中正常培养。
拟南芥培养基配置
1．1 播种和发芽拟南芥可在非无菌条件下，生长在土壤或人工配制的各种培养基中。
作为栽植的容器，可根据各自条件置于花盆或格状分离的多穴塑料盘中。
常用的混合物有泥炭藓、营养土、蛭石和珍珠岩等，例如珍珠岩∶蛭石∶泥炭藓=1∶1∶1的混合物，表土、堆肥或腐殖质土∶珍珠岩或蛭石=1∶1，1∶2或2∶1的混合物。
如果用于营养研究则可以蛭石类惰性物质作培养介质，施以配有营养物质的水溶液。
栽培拟南芥的介质均要求有良好的排水性，因此一般混合砂子、蛭石等惰性介质，保持良好的排水，防止过湿引起真菌和昆虫幼虫滋生。
播种前土壤混合物进行高压灭菌处理 30min，以杀死可能存在于混合物中的任何害虫。
在把土壤混合物置于花盆或其他容器中后，将整个容器置于水或营养液中，靠毛细管作用浸湿介质，然后将处理洗净来的种子，用尖头烧融后的移液管小心移至土表，均匀播下。
如果播种量较大，可用浓度为0．1g/100mL琼脂或砂子事先均匀混合后播种。
种子发芽期间必须保持高湿度，故容器可用塑料膜复盖，保持一周左右方可揭去。
[1]将播有种子的容器移至低温或相应低温条件下，在 2～4℃下放置 2～4d，从而于吸胀条件下破除种子休眠，这对新鲜收获的拟南芥种子尤为必要。
对大多数拟南芥品系来说其种子是中度休眠的，收获已久的这类生态型的拟南芥种子可免于低温处理，而有些生态型甚至需长达7d的低温处理。
干种子的低温处理往往是无效的。
低温处理后，将盆移至温室或生长室，在22℃ 左右发芽，夜温可比日温低2℃，用 2000lx的荧光灯给予光照，光周期为18h光 /6h暗（也可24h光照[2]），在 5d左右可见拟南芥发芽。
拟南芥发芽需光，故防止种子被土覆盖。
1．2 生长发育条件的控制[3]拟南芥一般是冬性一年生植物，自然条件下种子在秋天发芽，幼年期度过冬天，花分生组织在春季分化，种子在夏季成熟脱落。
大多数实验室栽植的拟南芥品种在发芽后 4周开花，而在 4～6周后采集种子。
CTAB法提取拟南芥DNA-基因组测序质量
CTAB法提取拟南芥DNA1.试剂：1L CTAB DNA提取缓冲液：Tris-HCl(pH 8.0): 100mMEDTA（pH8.0）: 20mM 121℃灭菌15min待用NaCl: 1.4MCTAB: 2%(W/V)PVP40000: 1%(W/V)2.实验方法：1，CTAB buffer于65℃预热15min。
2，取叶片组织0.2 g, 液氮下磨碎至粉末状，用干净的药勺转移粉末到2ml 离心管中，加入1 ml预热的CTAB buffer（0.2g叶片对应1mlCTAB）。
混匀后置65℃水浴中保温15min，并不时轻轻摇动试管。
（此时应4°预冷离心机）。
3，冷却至室温后，加入800 ul Tris-平衡酚(pH8.0，含8-羟基喹啉)，颠倒混匀，室温静置15 min。
加入200 ul氯仿，充分混匀后置于冰上5min。
4，12000g 4℃离心15min，转移上清至新的离心管中（约1 ml，保证质量可取800ul），加入0.8倍上清体积(800 ul/640ul)的异丙醇（-20°预冷），混匀，-20℃沉淀2h以上（此步可过夜）。
5，室温12000g离心15min回收DNA沉淀。
6，加200ul RNase水，于37度溶解6min。
7，冷却至室温后，加入160ul Tris-平衡酚，颠倒混匀室温静置15min。
加入40ul 氯仿，充分混匀后置于冰上5min。
8，12000g 4度离心15min，吸取180ul上清至新的1.5ml离心管，加入1.5倍体积（144ul）的异丙醇（-20度预冷）及0.5V 7.5M 醋酸铵，混匀，-20度沉淀1h以上（也可过夜）。
9，室温12000g离心15min回收DNA沉淀。
10，80%乙醇清洗DNA，弃去上清液；离心10sec，用枪头移去残留液后，置超净工作台中干燥约6-10 min。
11，将DNA溶于20 ul ddH2O或weak TE中。
园艺-拟南芥侵染和筛选的流程
园艺-拟南芥侵染和筛选的流程-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII1摇菌（1）小摇：在超净工作台中取出无菌离心管，加入4ml纯净LB液体培养基，加入4ul 50mg/ml浓度的卡那霉素，加入8ul 10mg/ml浓度的利福霉素，加入阳性菌菌液，摇匀；在摇床中28℃培养2天；（2）大摇：在250ml三角瓶中加入150ml纯净LB液体培养基，加入150ul 50mg/ml浓度的卡那霉素，加入300ul 10mg/ml浓度的利福霉素，加入1.5ml 菌液，过夜摇菌。
2配侵染液（1）1L超纯水中加入10g蔗糖及40ul表面活性剂 Silwet L-77，磁力加热搅拌器搅拌均匀；（2）大摇后的菌液用分光光度计测OD600，用离心后的上清液作为对照，菌液OD600在0.8~1.0之间时，可以进行下一步；（3）将菌液倒入50ml圆底离心管中，常温4000g离心10分钟，收集菌株；（4）倒掉上清，加入少许侵染液，用移液器把菌打散打匀，倒入侵染液中。
3农杆菌花序侵染（1）托盘垫上报纸，润湿，取八盆培养良好且适合侵染的拟南芥，每盆四株；（2）将全部的花全浸到侵染液中，全部的花均需浸湿，若花无法碰到侵染液，则用戴手套的手浸湿，每盆浸湿2分钟；（3）然后将植株迅速平躺放到托盘中，用黑塑料袋盖住；（4）暗处理24小时后正常培养；（5）用于摇菌的三角瓶，侵染用的瓶子、50ml插口圆底离心管及剩下的侵染液与菌液上清均需高温高压灭菌。
4收种子侵染后的拟南芥苗正常培养，30天时收取第一批种子，40天时收取第二批种子，晒干7~10天。
5 筛选T1代转基因阳性植株5.1 选择性培养基筛选（1）将种子倒入10ml离心管中，加满拟南芥种子消毒液（0.5%SDS、0.8%NaClO），均匀打散种子，手摇振荡15分钟；（2）在超净工作台中倒掉消毒液，加满灭菌水，将种子完全打散，振荡洗涤；（3）室温3000g离心2分钟，在超净工作台中倒掉无菌水，注意不要倒掉种子，重复进行五次洗涤过程；（4）加入0.2%琼脂糖悬浮种子，用移液器均匀涂在50ug/ml卡那霉素100ug /ml头孢菌素的MS固体培养基板上，每个板3ml，晾十五分钟，等水被板吸干后再封膜；（5）暗处理春化3d；（6）将选择性培养基上长出的T1代转基因阳性植株移到土中正常培养。
拟南芥种植到培养基中的方法
拟南芥种植到培养基中的
方法
It was last revised on January 2, 2021
拟南芥种植到培养基中的方法
材料：1/2MS培养基、植物组织培养专用琼脂、1ml吸头（灭菌）、0.1%琼脂糖、水（灭菌）、75%酒精
种植过程在超净工作台内进行，具体方法为：
1、种植前先将实验过程中用到的物品放到超净工作台，紫外线灭菌15分钟左右，提供一个相对无菌的环境。
注：种子不能放在紫外灯下照射，以免引起损伤和变异。
2、用75%酒精棉球将暴露于实验台内的手及其他部分擦拭一遍，起消毒作用，种植过程中最好不要在上风向放东西，手也最好不要在上风向经过。
3、在放有种子的离心管中加入75%的酒精，消毒5分钟左右，时间不宜过长以免影响种子的活性。
酒精的量大约为离心管体积的2/3，上下颠倒离心管使种子与酒精充分接触。
种子不宜过多（超过50ul），否则消毒效果不好。
4、消毒完后，将离心管中的酒精吸出，用灭菌的ddH2O漂洗3-5遍，注意有一些种子会漂浮在水中。
在洗的过程中用移液器慢慢吹打，注意更换吸头，避免交叉污染。
5、种子漂洗完后将适量0.1%琼脂糖加入离心管中。
之所以用琼脂糖而不是水是因为琼脂糖有粘性，种子会悬浮在其中，而在水中种子一般都沉在底部不便于种植。
将种子均匀滴到1/2MS培养基中，每个平皿大约种植30粒左右，在培养皿的盖和底部最好都要写上种植的拟南芥的名称以及日期，最后用胶条将培养皿封口。
6、将培养皿放到4℃冰箱中（主要是让种子均匀发芽），2-3天后便可拿到培养间中。
花序浸染法转化拟南芥
花序浸染法转化拟南芥1 种植或者移栽拟南芥之前都需要提前一天泡土，泡土过程中要加足量的水。
营养土和蛭石1：1比例混合。
2 可以采取两种方法种植野生型拟南芥：一种是直接在大钵子里种八、九颗，小钵子里种四、五颗，等它稍微长大以后去掉长势不好的或者不能成活的，大钵子保留四颗，小钵子保留两颗，这种方法不用移栽；另一种是现在大钵子里种上几十颗（小钵子里相应的减少），等它们长成小苗后移栽（千万不要等它们长大了再移栽，因为这时它们的根会缠绕在一起，很不好移栽，而且还容易伤根），这种方法移栽比较麻烦，但是在移栽过程中能保证你要移栽的每一颗都是长势良好的拟南芥。
不管你采取哪种方法，在种下拟南芥后都需要浇水并盖膜，盖膜的目的是为了保持水分。
注意：移栽拟南芥后还需要盖3到4天的膜，因为刚移栽的苗子比较小。
总之盖膜时间自己灵活掌握。
3 转拟南芥一般用GV3101这个农杆菌，在你电转农杆菌，挑取阳性克隆检测后，先用2ml离心管少量摇菌，每管装1ml的LB，分装2管，摇8—10小时（时间灵活掌握，有时候需要摇更长的时间才能浑浊）待浑浊后再转移到500ml三角瓶（按1：100的比例装有200ml的LB）中大量摇菌8—10小时直到浑浊为止（有时候需要摇更长的时间才能浑浊）。
浑浊的标准是OD值为0.8，但是现在基本都不测OD值。
（在摇菌过程中所用的离心管和LB要灭菌，另外还要注意添加抗生素利福平，最好选用利福平和另外一种到两种抗生素以达到双抗或者三抗的效果，实际上双抗就可以了，理论上可以添加三种抗生素，一种是利福平，GV3101农杆菌本身就是抗利福平的；另一种是农杆菌自身所携带的协助Ti质粒载体上的基因所抗的抗生素；还有一种就是T-DNA区内基因所对应的抗生素），接下来就是离心富集农杆菌（用离心瓶或者是50ml的大离心管，这个时候离心瓶或者50ml大离心管可以灭菌也可以不灭菌），然后用100ml的5﹪的蔗糖悬浮，蔗糖溶液中加入20微升表明活性剂，也就是浓度0.02%（此时的蔗糖溶液就不用灭菌了，因为以后的侵染也不在超净工作台操作）。
农杆菌侵染拟南芥
拟南芥侵染方法：
1、取150ml 含相应抗生素的液体LB培养基，接入2-3ml准备好的农杆菌菌液，大摇过夜
至培养基由红色转为黄色。
2、将培养后的150ul农杆菌菌液导入灭过菌的50ml离心管中，4℃，3000rmp离心15min
3、弃上清，加入50ml 1／2 MS，将菌泥搅起
4、将培养4周左右,刚开花的拟南芥植株上的果荚去除，将上面准备好的菌液倒入培养皿
中，将整个花序浸入菌液10sec
5、将浸好的拟南芥植株在黑暗条件下，处理18-24h后继续光照，一周后可再dip一次
用于Dip的1／2 MS配方：（每150 ml菌液加50 ml 1／2 MS液）
MS大量5 ml
蔗糖10 g
水95 ml
表面活性剂20 ul
常用1／2 MS配方（1 L）：
10X大量元素50 ml
100X微量元素 5 ml
100X铁盐 5 ml
蔗糖（1%）10 g
琼脂粉8 g
拟南芥生长土壤：
腐殖土：蛭石=1:1混匀，装双层袋子，高压121℃灭菌40分钟
注意：灭完菌后要加适量水将土和湿，不能太湿，然后土装入钵里压实，将钵放入装有水的底盘中，一个小时左右钵中土壤浸湿后便能种苗。
种子消毒：
30%H2O2+85%乙醇1:4混合
取250微升混合液加入种子种用枪头吹打40S，放在滤纸上晾干，然后铺在1／2 MS平板上。
4℃冰箱中放置春花1-5天，一般新种子春花时间长点。
16\8 光周期，待真叶长出时，用镊子将苗从平板移植到土壤中。
营养土产家：吉林省德惠市芳洁花土厂(花卉营养土) 我们是从北京际翔园艺花圃公司买的。
6、GFP转基因拟南芥的筛选及荧光观察
卡那培养基上筛选tubulin-GFP转基因幼苗
生长一个月左右的GFP转基因植株
体式荧光显微镜观察GFP转基因植株
Bars= 100 μm
CONFOCAL荧光显微镜观察GFP-TUBULIN 在气孔保卫细胞中的定位
材料与试剂
• 材料：野生型拟南芥种子WT、 GFP转基因拟南芥种子
• 试剂：
75％乙醇； 50％84消毒液； 无菌水； MS培养基；
。 MS+kan(卡那霉素）培养基 1ml 移液器
实验操作注意事项： • 严格无菌操作！ • 消毒过程动作要快！ • 枪头不要重复使用，物品不要拿出超净 台！ • 点种时每个位置尽量只点一颗种子！ • 操作时尽量避免说话和人员走动！ • 注意小组内的配合和小组间的协调！
种子消毒及播种实验流程 （超净工作台中完成所有步骤）
1. 将培ห้องสมุดไป่ตู้皿做好标记， 2. WT和GFP两种类型的种子已春化（ 置于4℃冰箱48h）（已
做）； 3. 用1 ml量程的移液器去掉EP管中的ddH2O，加入新的500 ul
ddH2O ，再加入500ul 84消毒液，混匀；颠倒数次，孵育6 min （混匀，尽量将液体吸净，动作要快）； 4. 1 ml无菌ddH2O水，洗3遍后，去上清 5. 最后加入200 μl ddH2O 6. 用移液器吸取单颗种子，将种子点在培养基表面（每皿4-5 颗种子 尽量均匀）； 7. 封膜，正置平放于培养架上培养。
实验六、八
GFP转基因拟南芥的筛选及荧光观察
2019-11-13
实验六 拟南芥种子消毒及无菌培养
实验目的
1.建立无菌实验操作的概念； 2.掌握植物（拟南芥）无菌培养的方法。
GFP报告基因
预实验一：拟南芥的萌发实验
预实验一：拟南芥种子的接种和春化1.实验品种：拟南芥Arabidopsis thaliana种子2.仪器工具与药品表1 实验用仪器、工具、药品名称数量名称数量磁力搅拌器1套烧杯（500ml），量筒（50ml）各1个PH计1支玻璃棒1个微波炉1台称量纸、滤纸各1套湿热灭菌锅1台蓝盖瓶（200ml）蓝盖瓶（100ml）三角烧瓶（1000ml）1个2个1个紫外线超净台1台小镊子3个冰箱、纯水机各1台报纸、麻绳少许电子天平（）1台培养皿2套移液枪（20ul）移液枪（1ml）灭菌枪头（20ul）灭菌枪头（1ml）1只1只1套1套1/2MS培养基蔗糖NaOH、HCl琼脂75%乙醇超纯水2.5%NaClO纳米TiO21.24g15g适量5g100ml1000ml100ml0.75g宽口生态瓶（空）1个方形培养皿（10个）1套3.方法与步骤3.1拟南芥种子的接种（1）称量：称取1/2MS培养基1.24g，蔗糖15g，琼脂5g；量取无水乙醇75ml，NaClO 2.5ml，超纯水200ml和500ml两份。
（2）培养基的制备：将有500ml超纯水的烧杯放入磁力搅拌机上，放入磁石，打开开关；先后加入1/2MS培养基1.24g，蔗糖15g。
（3）调节PH：打开PH计，待其PH稳定后，先用纯水润洗后用纸巾擦干，在放入烧杯中测定，期间用NaOH和HCl调节PH至5.7-5.8。
（4）配置杀菌消毒剂：用超纯水配置75 %乙醇100ml，2.5 %NaClO100ml和200ml超纯水，放入对应的蓝盖瓶中。
（5）转移：将溶解好的培养基倒入1000ml三角烧瓶中。
（6）包扎：将三角烧瓶用塑料纸和麻绳包扎好，将生态瓶中放入少许滤纸，也按上述方法包扎好；将2套培养皿和镊子用报纸和麻绳包扎好，放入湿热灭菌锅中121℃30min。
（7）紫外杀菌：将紫外线超净台的门关闭，开启紫外灯提前杀菌30min。
（8）接种种子：晾凉后（培养基除外），将灭菌锅中的用具放入紫外线超净台，再移入种子、20ul的枪（含枪头）和方形培养皿。
简单粗暴提取拟南芥DNA-1
Simple, but robust and highly scalable protocol简单粗暴法提取DNA1. 四片以上叶子的苗龄时，取一片适当大小（0.5-1cm2均可，没必要太大）；2. 加钢珠和500μL extraction buffer，磨样3min，12000rpm离心10min（时间不可太短，否则无法充分分层）；3.吸取400 ~450μL上清（尽量不要吸到叶片组织沉淀）至1.5mL离心管，加等体积异丙醇（或2倍体积冰乙醇）沉淀，-20℃放置30min左右，离心5min；4.倒掉乙醇，加500μL 75%乙醇，泡洗10min后倒掉75%乙醇，可重复洗1遍；5.晾干（最好过夜），加100μL ddH2O溶解，约1hr后即可取1μL左右直接做PCR（10μL的PCR体系）模板。
说明：1.extraction buffer配方（1L）：12.1 g Tris, 28.1 g NaCl, and 18.6 g EDTA（实是乙二胺四乙酸二钠即EDTA Na2，加水溶解并定容至1L；分子生物学实验一般都是用的EDTA Na2，所以一般默认简称EDTA）2.本方法改编自：Alonso J M, Stepanova A N. Plant Functional Genomics:Methods and Protocols[M].2nd ed. Humana Press, 2015. 326-335（大家可以看看这本书，方法挺全）3.此法提取DNA，室温放2个月做PCR没有问题，没有试过放更长时间（更长时间建议还是放-20℃冰箱）。
检测2Kb片段扩增成功（更长片段没有试过，可用于做TAIL PCR）。
因没有用氯仿、异戊醇抽提，全程可不用在通风橱操作。
所提DNA中蛋白含量稍高，加水后有白色不溶物属正常现象，不影响PCR。
拟南芥ems诱变及突变体筛选
1、当Fv/Fm比值在0.5左右时,说明在突变体中 PSll内部的电子传递受阻或者突变体中部分PSll功 能丧失的结果。这是由于Fo升高引起的。 2、当Fv/Fm比值高于0.6时，则认为PSll下游电子 传递链复合物(包括PSI和细胞色素b6/f等)受到影 响。 3、当突变体的Fv/Fm降低到0.7左右，说明在突变 体中Psll内部的电子传递没有受阻，而可能是PSll 以后的Cytb6f或PSI复合物发生突变的结果。
• 植物叶片经过充分暗适应后,PSI和PSll均处于 还原状态，在650nm,光强为0.05o.1μmol/m2s的测量红光下，由于Psl主要吸收 远红光，Psll主要吸收红光，此时叶片电子传 递过程主要停留在PSll中，得到稳定的初始荧 光值FO。施加单饱和脉冲(3000μmol/m2 s for 0.8s)后，Psll暂时达到饱和，Psll的电子受体 QA被完全还原，叶绿素荧光产量由基态F(o) 上升到最大值F(m)。这可以决定PSll最大光化 学量子产量,Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm(Maximum quantum yield of PSll)，表明最大PSll光能转 化效率。在拟南芥野生型叶片中,常在0.8-0.84 之间。
100mmol/L磷酸缓冲液配置：
• 1、准备100ml 1M K2HPO4和100ml 1M KH2PO4; • 2、将70ml K2HPO4和20ml KH2PO4在烧 杯中混匀； • 3、用KH2PO4将PH调到6.5； • 4、将1M的磷酸缓冲液稀释到100mmol/L。
突变体筛选
• 根据光合色素的改变来筛选叶色突变体 因为很多与光合作用相关的基因突变,会直接引 起叶片颜色的改变。叶色变异是比较常见的突 变性状,一般在苗期表达,但少数突变体直到发 育后期才发生叶色突变。由于基因突变往往是 直接或间接影响叶绿素的合成和降解,改变叶绿 素含量和叶绿素a/b的比值,所以叶色突变体也 多为叶绿素突变体。叶色突变体的分类主要从 苗期叶色来划分,如白化、黄化、浅色光成像系统对突变体进行筛选， 设定不同伪彩色参数挑选出Fo；Fm； Fv/Fm;NPQ变化的突变体。 室温状态下,暗适应后的突变体野生型各生 长时期植株用于分析。
拟南芥培养基配置
1．1 播种和发芽拟南芥可在非无菌条件下，生长在土壤或人工配制的各种培养基中。
作为栽植的容器，可根据各自条件置于花盆或格状分离的多穴塑料盘中。
常用的混合物有泥炭藓、营养土、蛭石和珍珠岩等，例如珍珠岩∶蛭石∶泥炭藓=1∶1∶1的混合物，表土、堆肥或腐殖质土∶珍珠岩或蛭石=1∶1，1∶2或2∶1的混合物。
如果用于营养研究则可以蛭石类惰性物质作培养介质，施以配有营养物质的水溶液。
栽培拟南芥的介质均要求有良好的排水性，因此一般混合砂子、蛭石等惰性介质，保持良好的排水，防止过湿引起真菌和昆虫幼虫滋生。
播种前土壤混合物进行高压灭菌处理 30min，以杀死可能存在于混合物中的任何害虫。
在把土壤混合物置于花盆或其他容器中后，将整个容器置于水或营养液中，靠毛细管作用浸湿介质，然后将处理洗净来的种子，用尖头烧融后的移液管小心移至土表，均匀播下。
如果播种量较大，可用浓度为0．1g/100mL琼脂或砂子事先均匀混合后播种。
种子发芽期间必须保持高湿度，故容器可用塑料膜复盖，保持一周左右方可揭去。
[1]将播有种子的容器移至低温或相应低温条件下，在 2～4℃下放置 2～4d，从而于吸胀条件下破除种子休眠，这对新鲜收获的拟南芥种子尤为必要。
对大多数拟南芥品系来说其种子是中度休眠的，收获已久的这类生态型的拟南芥种子可免于低温处理，而有些生态型甚至需长达7d的低温处理。
干种子的低温处理往往是无效的。
低温处理后，将盆移至温室或生长室，在22℃ 左右发芽，夜温可比日温低2℃，用 2000lx的荧光灯给予光照，光周期为18h光 /6h暗（也可24h光照[2]），在 5d左右可见拟南芥发芽。
拟南芥发芽需光，故防止种子被土覆盖。
1．2 生长发育条件的控制[3]拟南芥一般是冬性一年生植物，自然条件下种子在秋天发芽，幼年期度过冬天，花分生组织在春季分化，种子在夏季成熟脱落。
大多数实验室栽植的拟南芥品种在发芽后 4周开花，而在 4～6周后采集种子。
拟南芥培养
拟南芥培养实验目的：拟南芥无菌培养。
实验仪器：光照培养箱,盆.培养皿,超净台,灭菌锅.实验试剂：营养土,蛭石,MS培养基实验步骤：1、配制MS培养基（一般装在三角瓶里，最好只装最大体积的70％以内），高温灭菌（115度15分钟）在未固化情况下，（固化的话可以在微波炉里融化再使用）在超净台里倒入培养皿（一般一个培养皿内装25ml左右培养基，培养皿也是要灭菌的，一般用报纸或者牛皮纸包一排，十几个吧），待充分凝固之后平放密封保存（倒好之后最好静置15－20分钟，然后放在塑料袋里，保存在4度）2、将拟南芥种子用10％消毒水（洗洁精体积分数）浸泡15分钟左右（要保证每粒种子都浸透），无菌水冲洗3遍，加入适量0.12%的琼脂溶液（要灭菌的）用蓝枪头播在之前准备的灭菌MS固体培养基上(要在超净台中操作)，点种子大概的确有点难以想象，下次你来拿种子和苗的时候我可以给你演示一下；3、４℃春化2天后转到光照培养间，温度２２℃／１８℃（日／夜），1６ｈ／８ｈ光周期，（也不用这么严格的，一般22－25度，5000－7000lx，白炽灯光照培养，光照强度五千Lx。
差不多就行了）4、大约7－10天后，拟南芥根须和芽均已长出，长到3至4片叶后可以移入土中培养（平板里长太久的话似乎会影响植物以后的生长）。
5、用营养土和蛭石以1：1的比例混合拌匀配制，以保证营养及透气性。
用高温杀菌以杀死土中的害虫。
（我们现在种得多，土都不灭菌的，注意拔拔杂草就行了）6、用镊子小心夹住培养皿中的拟南芥茎处，取出放在土上，卷起根须塞入土中。
避免将叶片带入土里。
放在光照培养间，条件和长平板一样就行了7、在托盘中浇水，通过毛细作用由底部的孔吸收上去，保证土壤湿润。
刚移植的前两天可以用基本上透明的盖子盖住盆顶。
MS培养基的配方是对的单位mg/L大量元素：NH4NO3 1 650KNO3 1 900CaCl２·2H2O 440MgSO4·7H2O 370KH2PO4 700微量元素：KI 0.83H3BO3 6.2MnSO4·4H2O 22.3ZnSO4·7H2O 8.6Na2MnO4·2H2O 0.25CuSO4·5H2O 0.025CoCl2·6H2O 0.025FeSO4·7H2O（27.8）+Na2-EDTA·2H2O（37.3）有机成分：肌醇100烟酸0.5盐酸吡哆醇（维生素B6）0.5盐酸硫胺素（维生素B1）0.5甘氨酸 2注意：肌醇一般是要另外分开来独自配成浓缩液，因为它比较难溶，一般配成100倍，而除去肌醇后的有机，还是可以配成1000倍的。