蛋白质类药物分析

（一）生物学活性及比活性测定
检测意义 获取准确的效价信息，保证产品有效 效价：有效性指标，反映药品效力 生物学活性才能真实反映生物技术药效价 原因：生物制品分子大、结构复杂、不稳定，
使得重量与效价不一致 生物制品技术药:单位（U、AU、IU）
（二）生物学活性测定方法分类
1、动物基础的活性测定 1）离体动物器官法：脑利钠肽的兔主动脉 2）体内测定法：EPO的小鼠网织红细胞
动物基础的活性测定 细胞基础的活性测定 酶学基础的活性测定 结合反应的活性测定
70%~130%标示量 80%~120%标示量 85%~115%标示量 85%~115%标示量
（五）蛋白质药物的比活性
样品：原液 定义与计算：比活性：单位重量蛋白的活性
单位（IU/mg） 意义：真实反映有活性的蛋白质所占的比例，
2、细胞基础的活性测定 1）促细胞生长法：大多数细胞因子类 2）抑制细胞生长法：细胞毒素、血管抑制剂 3）间接保护细胞法：IFN保护WISH
3、酶学基础的活性测定：重组酶类 4、受体-配体、抗原-抗体结合基础的活性测定：抗
原决定簇与活性中心常不一致
（三）生物学活性测定方法选择
1、细胞培养法＞离体器官法＞体内法 2、细胞染色标记方法：MTT＞3H-
Thymidine＞流式细胞仪（测细胞周期） 3、定量法＞半定量法＞定性法 4、生物学活性不一定与临床药效类型一致 工艺稳定、测生物活性特别复杂时，可替代。
如rh-GH用HPLC
（四）生物学活性测定（Chp附录ⅩC）
样品：原液、成品
标准：不同生物活性测定方法的规定标准
测定方法
规定标准
厂家间、表达系统间、批间比较 便于配制成品
第二节 蛋白质和多肽类药物分析
一、鉴别 二、结构确证 三、检查 四、含量测定 五、残余杂质检测 六、安全性及其他检查
一、鉴别
Байду номын сангаас 鉴别药物的真伪
（一）化学鉴别：双缩脲反应（是否蛋白质/多肽 类）
（二）紫外吸收光谱扫描（Chp附录ⅡA）
（二）成品质量标准
鉴别试验：免疫印迹或斑点法，阳性 物理检查：外观、可见异物、装量 化学检查：水分、pH值 生物学活性：标示值的%范围 无菌检查：不得检出 内毒素检查：≤10EU剂量 异常毒性检查：符合规定
三、蛋白质和多肽类药物活性及测定方法
（一）生物学活性及比活性测定 （二）生物学活性测定方法分类 （三）生物学活性测定方法选择 （四）生物学活性测定 （五）蛋白质药物的比活性
标准：阳性
SDS-PAGE Western blot
（四）HPLC法
根据待测样品（T）与标准品（S）/对照品方 法的保留时间（t0）的一致性进行定性分析
当T的t0与S完全相同，则能判定T可能与S为 同一物质；特别是如果色谱条件改变，T的t0 与S的t0仍能一致，则基本判定是同一物质
影响多肽、蛋白质分离、纯化和分析
（三）颜色反应
可用于蛋白质定量与定性分析 1）茚三酮反应 2）双缩脲反应 3）酚试剂反应
双缩脲反应
Cu2+ (碱性溶液) 红紫色络合物
（四）紫外吸收
蛋白质和多肽组成中常含有酪氨酸、色氨酸 和苯丙氨酸等芳香族氨基酸，在远紫外光区 （200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一 特征吸收峰
质谱法
外源性DNA残留量：≤10ng/剂量（见Chp附录ⅨB）
宿主蛋白残留量：≤0.1%，0.05%（见Chp附录ⅨC）
残余抗生素：不得检出（见Chp附录ⅨA）
细菌内毒素：≤10EU剂量（见Chp附录ⅫE凝胶限 量试验）
结构确证：等电点（见Chp附录ⅣD）、紫外吸收 光谱扫描（见Chp附录ⅡA）、N末端15个氨基酸 顺序、肽图（见Chp附录ⅧE）、氨基酸组成
肽
（一）高分子特性
是其胶体性、变性和免疫学特性的基础
1、胶体性质
可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨 基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合 作用在蛋白质颗粒外面形成一层水化层，同 时这些颗粒带有电荷，因而蛋白质溶液是相 当稳定的亲水胶体（Φ1-100nm）。
疏水色谱
2、变性与复性
蛋白质高级结构是其理化特性及生物学功能基础
二、结构确证
等电点（PI）测定 紫外光谱扫描 末端氨基酸序列测定 肽图分析 氨基酸组成分析
第九章 蛋白质和多肽类药物的分析
第一节 概述
一、蛋白质和多肽重要理化性质 二、蛋白质和多肽类药物质量控制标准 三、蛋白质和多肽类药物的活性及测定方法
一、主要理化性质
高分子特性：是其胶体性、变性和免疫学特性基础 两性解离与等电点：影响多肽、蛋白质分离、纯化和
分析 颜色反应：茚三酮反应、双缩脲反应、酚试剂反应 紫外吸收：280nm处最大吸收，可定量蛋白质和多
样品：原液
方法：紫外扫描
标准：最大吸收波长与特征波长一致、批与 批间一致
一级结构不含芳香族氨基酸重组药物，在 280nm附近没有最大吸收峰，可不做紫外 吸收光谱测定
重组脑利钠肽(rhBNP)
（三）免疫印迹
方法：通常用免疫印迹（immunoblotting） 和斑点免疫（Dot Immunobinding）进行 鉴定，特别当电泳出现两条或两条以上区带 时则应该用免疫印迹进行鉴定
二、蛋白质和多肽类药物质量标准
（一）原液质量标准 （二）成品质量标准
（一）原液质量标准
生物学活性、比活性（见药典附录ⅩC） 蛋白质含量（见Chp附录ⅥD） 纯度：≥95%，非还原SDS-PAGE（见Chp附录
ⅣC）、HPLC法（见Chp附录ⅢB） 分子量：还原型SDS-PAGE法（见Chp附录ⅣC）、
。当蛋白质受某些理化因素影响，其分子内原有高级
构象发生变化，蛋白质理化性质和生物学功能改变或
丧失，但一级结构未变，即变性作用(denaturation)
表征：生物活性丧失；物理（溶解度、粘度、扩
散系数、光谱特性）和化学（化学反应，被酶解性）
改变.
生物活性
3、凝集（Aggregation）
（二）两性解离与等电点