大鼠冰冻切片
课题_大鼠冰冻切片
+ 未经固定的组织切片时冰晶较多，这是公
认的事实，即使固定后的组织切片仍然会 有一定的冰晶，为防止冰晶的形成，常可 采取如下方法： 1.速冻法：将组织置入低 温环境，使组织骤然降温。2.利用高渗溶液 吸收组织分子：将组织置于20% ——30%的 蔗糖溶液中， 置4摄氏度冰箱足够时间，观 察组织快，待其沉底后，取出切片。这样 即可大大减少冰晶的形成。
+ 冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的
固定液固定1分钟后即可染色。以往，为了防止切 片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹 干后再固定。根据实验对比认为这种做法欠妥未 经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核 内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后 镜下分辨不出核内的各种物质。冰冻切片附贴于 载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这 样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变 化的情况下被固定起来，经一年多来1000例冰冻 切片的制作实践认为这样制作固定切片好，核染 色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。
+ 破碎的组织切片必然丢失实验信息，切片的完整性对研究结果的分析
无疑十分重要。切片破碎不全、有缺损的常见原因有： 1组织固定不 完全； 2温度设置不当。组织块过冷、过硬，则切片就容易破碎。组 织块冷冻不够，硬度和韧度达不到，切片也同样易粘、易碎；3组织 块带有皮肤、包膜、过大或冰晶过多；4 切片刀钝或较脏，切片出现 刮痕，使切片不完整；5操作手法不当，如速度不适宜，切片也可能 不完整。遇到上述情况，应有针对性的采取相应的措施。如注意组织 固定充分、尽量减少冰晶的形成，保持刀片的清洁与锋利，冷冻温度 要适宜，不同的组织应设置不同的温度，如较大组织块或含有较多脂 肪的组织应设置温度相对较低 ，冷冻时间稍长些。而脑、脊髓等温度 设置相对高些有作者采用“边冻边切”法制作切片，同样也取得较好 的效果。若组织带有不必要的皮肤或包膜，应尽量去除干净；如必须 保留皮肤或包膜，应注意采取相应的切片技术，如最好将皮肤或包膜 的平面与刀面垂直。此外，在切片时，应注意速度均匀。当然，要做 好这些，必须有一定的实践经验。
大鼠肾脏冰冻切片的体会
大鼠肾脏冰冻切片的体会【中图分类号】R５８７．２【文献标识码】B【文章编号】１００１－５３０２(２０１５)０９－０８５７－０１０．引言由于肾脏组织质地柔软,含水量高,或在取材过程中肾组织与水分接触, 突遇低温,易形成冰晶,快速冷冻切片的制作难度大,我们通过对大鼠肾脏的冰冻制片,总结经验如下. １材料使用德国产Leica—CM１９５０型冰冻切片机,Leica一次性刀片,冷冻组织包埋剂(O．C．T．),AF固定液,改良Gill苏木素染色液,２％碳酸氢钠返蓝液,逐级梯度酒精,中性树胶. ２方法２．１取材及包埋２．１．１取新鲜大鼠肾脏标本常规取材,标本要新鲜,无需固定,严禁浸入甲醛, 酒精,生理盐水等液,尤其是不可以用酒精固定,酒精固定后组织将无法冷冻.２．１．２将样本托放入冰冻切片机的冻台上预冷,加少许O．C．T．,在OCT 未完全冻结前快速的将组织放于样本托上,在组织周围适量的补充O．C．T,待包埋剂约１/３未冻结时压上冷冻锤,打开加强冷冻,使组织快速冷冻.２．１．３冰冻切片机温度设定在－１６oC—－１８oC为宜.冷冻时间一般为１min~２min.冷冻时间过长,组织易变硬变脆,细胞结构会发生改变,难于切片.２．１．４包埋组织时应将组织周边多留出O．C．T．用于牵引展开切片,O．C．T．中的小气泡应尽量去除,以免切片时挤压旁边组织产生皱褶,影响切片效果. ２．２切片组织切片厚度设定为５um－６um.刀具提前安放好,调整好刀具角度,切片时控制好操作窗,以利保温.肾脏组织细胞比较致密,若时间过长会变脆且易碎,在冰冻切片时可用手指轻压组织回温,再进行切片.２．３固定切片后立即放入AF固定液固定３０s—１min,不可待切片干后再固定,这样会造成细胞核染色质不清晰,呈现毛玻璃样改变,细胞胞浆边界不清等组织细胞的退变现象. ２．４染色封片固定好的冰冻切片在苏木素染液中染色３０s—５０s,经１％盐酸分化,２％碳酸氢钠水溶液返蓝,伊红染色,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片. 制好的切片核浆对比分明,红蓝适度,颜色鲜艳,达到理想染色效果.３讨论与分析:３．１冰晶是由于冷冻缓慢,冷冻时间过长,胞质内与组织间隙未结合的水分析出形成的.肾脏因其组织结构,在组织冷冻过程中,组织内易产生大量的冰晶影响冰冻切片的诊断,为了防止组织内冰晶的产生,最佳的办法一是使用冻锤:新鲜标本包埋后放入冷冻台时,不能将冻锤马上按压在组织上,那样会使组织受挤压变形.应该待O．C．T．凝固６０％~７０％时,再将冻锤轻压在组织上, 这样既能防止冰晶的产生,又能得到较平整的切面;另一种方法为使用液氮冷冻,可将组织放入液氮中２s－３s,待组织冻至８０％时即可取出制片,否则过冻会引起组织发脆,冻头与组织分离[２]. ３．２将包埋剂放入－１０OC或－４OC冰箱内保存,包埋剂要使用OCT,而不能用胶水等替代,因OCT的主要成分为PVP,其能通过渗透的作用将细胞内的水分移出,减少冰晶形成.３．３冰冻的速度与样品的表面积和体积成正比,取材时组织块尽可能薄,０．２cm 为宜,扁平状冷冻速度快,切片的前几张冰晶少,越后冰晶越多,切片不能求快,而要确保切片质量,力争一次完成一张高质量的切片[１]. ３．４可预先做好OCT冻头,将冻头上的OCT 修平,有利于将组织放平,再在冰冻机内在肾组织上滴加OCT,有利于OCT迅速降温,避免组织复温,减少冰晶形成. ３．５肾脏冰冻制片时易产生不规则裂痕,与切片时温度和切片速度有关,操作时应注意操作窗不要开太大,免工作箱的温度升高;OCT的用量太少易产本皱褶,滴加OCT时要上下俩端多,俩侧少,同时要注意OCT不要有小气泡. ３．６冰冻切片机应安放在冷室内,避免压缩机反复工作,仪器要定期维护,除霜,清洁消毒.总之,冰冻切片技术是病理科最重要的常规工作之一,也是较难掌握的病理实验技术.要做好一张冰冻切片需要病理技术人员具有严格的责任心、严谨的工作态度、丰富的工作实践经验[３]在日常的工作中还需不断摸索经验提高切片质量,冰冻切片不仅要求病理技师在短时间内制出高质量的切片,还需要病理技师具有娴熟的技术,对冰冻切片机功能的熟练掌握合理应用.参考文献[１]陈乐真,徐庆中,陈国璋手术中病理诊断图鉴１版北京:科学技术文献出版社,２００５:２(还需卷数期数页码等现在还没查询查询后补上)[２]范慧,陈立华,刘宇冷冻切片的制作体会及常见问题分析．诊断病理学杂志,２００８,１３８(还需卷数期数页码等现在还没查询查询后补上)[３]吴艳霞．冰冻切片的制作方法分析．吉林医学,２００９,３０(６):４９３．。
大鼠脊神经结扎术手术步骤
①位于双侧髂前上棘连线大约为L4/5横突后,手术周围5cm范围剃毛,常规消毒皮肤,铺孔巾。
②以大鼠两骸前上脊连线的中点作中线,中线旁往左5mm,在L5-S1水平做一长约2cm的纵行切口,钝性分离皮下组织和椎旁肌肉。
③钝性分离至暴露L6下关节突,充分显露L6横突。
④用刮骨刀将L6横突周围的肌肉和结缔组织清除干净,暴露骨性结构。
⑤用小咬骨钳小心的咬除L6横突,仔细的分离L6横突下的筋膜,暴露下方的L4和L5神经,L4和L5神经以一定的夹角并排行走,通常靠里靠下粗大的神经为L5,操作时避免触碰到L4神经。
（可以先找坐骨神经，3分支时，中间的是坐骨神经，4分支时。
上2是坐骨神经）⑥用玻璃分针将L5神经充分的游离出来,用镊子将6-0铬肠线穿过L5神经并紧紧的打上两个结,在线结远端5mm处将L5神经剪断。
⑦用无菌生理盐水冲洗伤口,充分止血,擦干血渍,确认无活动性出血后,在伤口洒上链霉素粉防止术后伤口感染,逐层缝合伤口。
⑧手术后将大鼠置于温暖干净的鼠笼中苏醒,并给予自由进食和饮水。
⑨假手术组在进行套线后,不结扎剪断神经,其它步骤与手术组完全一样。
每天检查一次后续L5脊神经结扎的第十天,对大鼠行为学测试后,用戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔麻醉。
打开胸腔,暴露其心脏,向左心室插入灌流针管,用止血钳将针管固定。
用憐酸盐缓冲液(O.Olmol/LPBS, pH7.4)冲洗大鼠体内血液。
再用4%多聚甲酸的磷酸盐缓冲液灌流、固定。
待大鼠组织固定后,取脊髓腰膨大节段,放在4%多聚甲醛中4°C冰箱内固定4小时。
后将脊髓转移到30%蔗糖溶液中,4°C冰箱脱水至组织下沉。
用冰冻切片机切片,脊髓厚度为35tim。
切好后将组织贴于载玻片上,放进一2(rc冰箱保存。
用PBS冲洗切片三次,每次7 —10分钟。
然后孵育一抗二抗4.2.1提取脊髓背角上蛋白大鼠断头,取脊髓腰膨大处脊髓背角侧半,保留SNL侧。
然后在装有液氮的碾钵中将组织碾磨成粉末状,移入EP管内,加入蛋白提取试剂,混合均勻放在冰上反应30min。
冰冻切片和石蜡切片对免疫组化染色效果的对比分析
冰冻切片和石蜡切片对免疫组化染色效果的对比分析方雪松【期刊名称】《中外医疗》【年(卷),期】2017(036)013【摘要】目的研究皮肤、肉芽组织采用石蜡切片以及冰冻切片免疫组化的染色效果.方法 2014年8月—2016年8月期间选取Wistar大鼠共60只,双盲法随机分为A、B两组各30只.实验前对60只大鼠进行背部切割伤,脱毛后在每只大鼠背部切割伤部位取1 cm×1 cm大小的皮肤块作为标本,A组大鼠皮肤块标本采用石蜡制片,B组大鼠皮肤块标本采用冰冻制片.对两组大鼠标本切片进行免疫组化染色,观察两组大鼠标本切片染色情况.结果 B组SP、EGF、EGFR以及FGF强阳性率分别为96.67%、100.00%、96.67%、93.33%,明显高于A组的0.00%(P<0.05).A1组抗原活性阳性率分别为93.33%、96.67%、93.33%、100.00%.明显高于A2组的13.33%、13.33%、3.33%、6.67%以及A3组的10.00%、16.67%、13.33%、3.33%(P<0.05).B1组EGF、FGF抗原活性强阳性率分别为100.00%、93.33%,高于B2组的6.67%、3.33%(P<0.05).结论冰冻制片免疫组化染色效果更佳,值得临床应用及推广.【总页数】3页(P16-18)【作者】方雪松【作者单位】安徽省立医院病理科,安徽合肥 230001【正文语种】中文【中图分类】R5【相关文献】1.卵巢肿瘤快速冰冻切片与石蜡切片病理诊断的对比分析 [J], 郭玲;董兵卫;黄明2.冰冻切片抗体在石蜡切片免疫组化中的应用 [J], 赵培荣;王一菱;吴景兰;宫璀璀3.脑组织冰冻切片漂片法与石蜡切片贴片法的免疫组化效果比较 [J], 钟琴;张燕翔;钱锋;杨波;任伯绪4.冰冻,石蜡切片ATP酶酶染色效果的对比观察 [J], 刘绍霖;侯文5.改良硬脂酸石蜡切片的免疫组化染色效果观察 [J], 胡小安;卢静;张润;戴瑜珍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
冰冻切片法破碎大鼠心肌组织提取RNA的实验研究
用于免疫荧光染色的大鼠视网膜冰冻切片的制作体会
［ 关键词 ］ Ｓ Ｄ大鼠 ；视 网膜 ；冰冻切 片；免疫 荧光 ［ 中图分类号 ］ Ｒ ７ ７ ４ ． １ ３ ［ 文献标识码 ］ Ａ ［ 文章 编号 ］ １ ０ ０ ８— ２ ３ ４ ４ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ３— ０ １ ６ ２— ０ ２
ｄ ｏ ｉ ：１ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ８— ２ ３ ４． ２ ０ １ ４ ． ０ ３ ． ０ １ ２
Ｐｒ ｏ ｄｕｃ ｔ ｉ ｏｎ ｏ ｆ Ｒａ ｔ Ｒｅ ｉｎａ ｔ Ｆｒ ｏ ｚ ｅ ｎ Ｓ ｅ ｃ ｉｏｎ ｔ Ｕｓ ｅ ｄ ｆ ｏ ｒ Ｉ ｍｍｕ ｎｏ ｌｕｏ ｆ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎｃ ｅ Ｓｔ ａｉ ｎｉ ｎ ｇ
用荧光显微 镜观 察其细胞排列及标记状 况。结果 ：完整眼球视 网膜结构形 态可保持相对规 则 ，但 偶 尔发生组 织牵拉 ；玻 璃
体 去除的视 杯标本免疫 荧光染 色结果相 对理 想。标 本厚度介于 ｌ ０～１ ２ ｍ冰冻切 片视 网膜血 管免疫荧光染 色结果优 于其他
厚度 者。结论 ：用于免疫 荧光的组织标本应尽量保持 其完整的 固有形 态，通过对 目标 结构的定性 、定位以及 定量 ，再现视
ｖ ｉ ｔ ｒ ｅ ｏ ｕ ｓ ｒ ｅ ｍｏ ｖ ａ ｌ ｗｅ ｒ ｅ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ ｌ ｙ ｉ ｄｅ ａ １ ． Ａｎ ｄ ｔ ｈｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｏ ｆ ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ｈ ｉ ｃ ｋ ｎｅ ｓ ｓ ｂｅ ｔ ｗｅ ｅ ｎ １ ０ —１ ２ ｍ ｗｅ ｒ ｅ ｓ ｕｐ ｅ ｒ ｉ ｏ ｒ ｔ ｏ ｏ ｔ ｈ ｅｒ ｓ． Ｃ ｏ ｎｃ ｌ ｕ－
冰冻切片实验技术
实验技术：组织切片的制备点击次数：350 发布日期：2009-11-9 来源：长沙赢润仅供参考，谢绝转载，否则责任自负组织切片的制备二）切片方法-细节注意1 切片方法的选择光镜和免疫组化研究的切片一般为5μm，而神经组织切片为20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。
1.1 冰冻切片是免疫组织化学中最常用的一种切片方法，能够最大量的保存抗原、操作简便，主要适用于不稳定的抗原（如检测细胞膜的某些抗原成分），但标本来源受限。
冰冻切片时,组织中水分易形成冰晶,影响抗原定位。
冰晶小而多，对组织结构损害大。
因此可采用以下措施减少冰晶的形成：①速冻，缩短组织从-33～-43℃的时间。
具体方法是：⑴干冰-丙酮（乙醇）法：将150-200ml丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不冒气泡时，温度可达-70℃。
用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。
将组织（约1cm×0.8cm×0.5cm）t投入异戊烷内速冻30-60s后取出，置-80℃低温保存或置恒冷冰箱内以备切片；⑵液氮法：将组织块平放于软塑料瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾。
此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
取出组织块后立即置入-80℃冰箱贮存或作恒冷切片。
②将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。
冰冻切片一般用恒冷切片机。
切片后如不染色，必须将切片吹干，贮存于低温冰箱内，进行短暂预固定干燥后贮存于低温。
【目的】组织标本必须首先被制成组织切片，再经过染色处理，然后才能在显微镜下进行临床诊断和科学研究。
【原理】苏木素染色结合伊红染色是常规组织学染色技术，也称为H & E染色。
大白鼠组织冰冻切片制备
大白鼠组织冰冻切片制备
肖全槐;陆锦标
【期刊名称】《吉林医药学院学报》
【年(卷),期】1995(000)003
【摘要】1 方法动物组织切片作为抗原底物检测自身抗体技术已被广泛应用,但抗原底物对实验结果影响很大,现就临床上常用作为抗原底物大白鼠组织切片制备作一探讨.取成年健康大白鼠,体重200g左右,断颈取心、肝、肾、胃、胰和骨骼肌等组织,生理盐水浸泡,去其脂肪、胃粘膜,心脏去掉心底、心尖留取中间部分并作纵向剖开.将经处理后的组织改切(?)2.0cm×0.5cm×0.5cm小块,用滤纸将
【总页数】1页(P202-202)
【作者】肖全槐;陆锦标
【作者单位】空军沈阳军械修理厂!沈阳市110021
【正文语种】中文
【中图分类】R361.2
【相关文献】
1.冰冻切片技术制作药用植物组织永久切片的研究 [J], 张建逵;王冰;许亮;康廷国
2.脑组织冰冻切片漂片法与石蜡切片贴片法的免疫组化效果比较 [J], 钟琴;张燕翔;钱锋;杨波;任伯绪
3.冰冻切片后剩余组织制作石蜡切片与常规石蜡切片的比较 [J], 班翔;黄淇;田云云;赵瑞波
4.新鲜冰冻黄瓜做为冰冻组织切片中的结膜和角膜组织衬托 [J], Dua.,HS;李彬
5.对卵巢肿瘤患者的病灶组织冰冻切片与石蜡切片进行病理检查的效果对比 [J], 崔萍;史晓敏
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大鼠视网膜、视神经冰冻切片适宜厚度探索
胞 ，密疏适 宜 ，胞核清楚 ，核膜光 滑完整 ，神经纤维层厚度均匀 ；６ Ｉ ｘ ｍ视神经冰冻切片 Ｈ Ｅ染色显示视神经纤维
排列密集 、规则 ，染 色均 匀 ；免疫组化染色结果 显示 ５ ｔ ｘ ｍ、６ Ｉ ｘ ｍ和 ８ Ｉ ｘ ｍ 的大鼠视网膜冰冻切 片 Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ — ｌ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ荧
ｐ ， ｍ， ８ ｍ， １ ０ Ｉ ｘ ｍ， １ ２ ｍ， １ ５ ｐ ， ｍ） ｆ ｒ ｏ ｚ ｅ ｎ ｓ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｔ ｉ ｎ ａ ａ ｎ ｄ ｏ ｐ ｔ ｉ ｃ ｎ ｅ ｖｅ ｒ ｏ ｆ Ｓ Ｄ ｒ ａ ｔ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｍ ａ ｄ ｅ ｆ ｏ ｒ ＨＥ
２ ４ ｆ ｅ ｍ ａ ｌ ｅ Ｓ Ｄ ｒ ａ ｔ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｒ ａ ｎ ｄ ｏ ｍｌ ｙ ｄ ｉ ｖ ｉ ｄ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ３ ｇ ｒ ｏ ｕ ｐ ｓ（ ｎ＝８ ） ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ｓ ． Ｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｔ ｈ ｉ ｃ ｋ ｎ ｅ ｓ ｓ （ ５ ｌ ｘ ｍ， ６
将２ ４只 ｓ Ｄ大 鼠随机 分为 ３组 ，使用传 统 的石蜡 切片行 Ｈ Ｅ染色做对
照 ，分 别对不 同厚度 的冰冻切 片做 ＨＥ染 色和 Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ — ｌ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ荧光 染色进行 观察 （ ５ ｍ、６ ｍ、８ ｍ、１ ０ ｍ、１ ２
视 网膜冰冻切 片 Ｈ Ｅ染色显示 ６ Ｉ ｘ ｍ和 ８ ｍ的大 鼠视 网膜各层 细胞可看到完整 细
韩宏艳 ，李 艳 ，熊 帅，杨琪瑶 ，李簧婷 ，曹 霞 （ 昆明医科 大学第二附属 医院， 云南 昆明 ６ ５ ０ １ ０ １ ）
［ 摘 要］ 目的 针对大 鼠眼球冰冻切片难度 高 ，各研究对 眼球冰冻切片厚度差异较大 的问题 ，探索大 鼠视 网
冷冻切片protocol
冷冻切片实验材料：固定好的鼠脑试剂：30%蔗糖；包埋剂；1*PBS用品与仪器：冷冻切片机；刀片；24孔板实验步骤：（切片的地点在1楼和6楼，1楼的切片机在使用前需要预约）1、将前一天放于4%PFA中固定的鼠脑样品取出放入30%蔗糖中进行固定。
（鼠脑刚放入时会浮在液面上，放置过夜，待沉淀后可进行切片操作）2、进行切片操作之前要进行一些准备工作，首先，在24孔板（每个鼠脑大概需要2个24孔板）每个孔中加入1ml PBS，用来舒展脑片。
其次，具有自带荧光的鼠脑的切片需要使用包有锡纸的24孔板，防止其荧光淬灭3、开切片机，将CT和OT温度都调节为-20℃，切片厚度设定为40μm。
4、用包埋剂包埋底座，凝固后将底座置于切片机相应位置上，调整好底座的位置，使之与刀片平行，转动切片转轮，将底座切平，注意不要让底座的厚度太大，根据切口的情况调整切片机使之运作良好。
（注意切片的转轮要在每一次切片完成后锁定，防止切伤手指）5、沿与冠状切平行的方向将鼠脑的小脑部分切除，将剩余的脑放置在底座上（注意鼠脑的中缝线要对准底座上的豁口），底座平行放置于-20℃环境下，可看到鼠脑由底座部分向上逐渐变白。
6、待鼠脑完全变白后，向鼠脑上添加包埋剂，等待鼠脑包埋好。
（如发现部分鼠脑未包埋住或包埋不充分，需要向该部位再次添加包埋剂）7、鼠脑包埋好后，将底座上流出的多余包埋剂切除，然后将样品连同底座放至切片机上进行切片。
8、放好样品后，先按后退键，将盛放样品的基座向后放，目测使刀片不能切到样品的位置。
9、转动切片机，使样品慢慢接近刀片，继续转动切片机进行切片，直至看到嗅球部位的脑组织，清理掉嗅球之前切下的切片。
10、自嗅球开始，每10片样品切片用玻璃钩粘起，放至第一个24孔内（脑切片如果粘在孔壁上不能直接用玻璃钩刮下来，而要用孔内的PBS冲刷下来），以此类推，直至得到自己需要的样品切片为至。
11、切片过程中注意观察切片形状，可发现得到切片的先后顺序依次为：嗅球、前额叶、含有胼胝体的脑片、SVZ、SCN等。
冷冻切片方法及注意事项
冷冻切片方法及注意事项冷冻切片是一种常用的组织学研究方法，它能够帮助研究人员观察和分析生物组织的结构和功能。
下面将详细介绍冷冻切片的方法及注意事项。
1.组织采集：首先需要选择适当的生物组织样本，可通过手术切取、尸检或动物献体等方式获得。
2.组织处理：取出组织样本后，应立即进行处理，以防止样本脱水和坏死。
可将组织放入理化盐水或生理盐水中，避免干燥、坍塌或变形。
3.固定组织：使用适当的固定剂对组织进行固定，以保持组织结构的完整性。
常用的固定剂有福尔马林、戊二醛、乙醛等。
固定时间应根据组织大小和厚度进行调节，较小的组织可以固定2-4小时，而较大的组织可能需要24小时以上。
4.预冷冻：固定后的组织应在冷冻前进行预冷冻处理，以提高冷冻切片的质量。
预冷冻的方法包括放入冷冻剂中（如液氮、干冰等）或将其放入冰盒中进行冷藏，使组织完全冷却。
5.冷冻切片：使用冷冻切片机将预冷冻的组织切成薄片。
为了获得更好的切片结果，刀片的角度和厚度需要进行适当的调整。
同时，切制时需要快速而轻柔地移动切片机，以防止组织被拉伸或损坏。
6.切片收集：将切片收集在玻片上，通常使用细长形的切片夹或切片板来收集切片。
确保切片不受损并保持平整。
7.切片保存：将切片放入适当的保存溶液中，如PBS（磷酸盐缓冲液）或甘油等，以防止切片干燥和变形。
可以根据需要选择冷藏或冷冻保存。
冷冻切片需要注意以下事项：1.样本质量：选择新鲜、完整的组织样本，避免坏死、变性或损伤的组织。
2.固定剂选择：选择适当的固定剂进行组织固定，以保持组织结构的完整性。
3.冷冻速度：组织应尽快冷却，以避免组织脱水或破坏。
冷冻速度过慢可能会导致晶体形成，影响切片质量。
4.切片机状态：保持切片机的良好状态，定期检查刀片的锋利度和调整角度，以确保切片的质量。
5.切片技巧：需要轻柔、均匀地切片，避免组织被拉伸或扭曲。
同时，切片过程中需要快速操作，以减少冰晶对组织的破坏。
6.切片收集：收集切片时要避免切片叠加或悬浮，以免影响切片的观察和分析。
冰冻切片免疫荧光取材
冰冻切片免疫荧光取材2.1.5 免疫荧光技术检测PTEN 蛋白表达。
2.1.5.1 标本制备1) 取材：对照组和模型组分别随机选取15 只大鼠于0d、1d、3d、7d、14d时相点进行免疫荧光技术检测，每个时相点3 只，麻醉后（水合氯醛3.5%，1ml/100 克，腹腔注射)，先用生理盐水灌注（生理盐水的量不能少于250ml，最好300ml 以上），将血液冲净后用4%多聚甲醛灌注，0.1g/mol 磷酸缓冲液配制的4 C 4%多聚甲醛（PH=7.4）约250ml 灌注至肢体僵硬，待充分固定后断头取脑组织，组织厚度约为3~5mm。
灌注一定要充分，肝脏变硬呈瓷白色为最佳；2)固定：4℃4%多聚甲醛固定24h。
3)灌流固定好的脑组织不需后固定可直接脱水；脱水：用30%蔗糖（4%多聚甲醛配置）固定脱水10~24h，换新液继续脱水，组织沉底后即可包埋；4)包埋：包埋器（本实验采用奶片盒或大片剂含片盒替代包埋器）内先放入少量OCT，将组织块放入（放组织时动作要慢，轻轻下压，小心组织移位和产生气泡），放好后继续加入OCT 至全部包裹组织为止，将标注的纸条放于包埋块周边，以明确分组及定位大脑的前后切面位置。
将包埋好的组织块直接放入-80℃冰箱冷冻，冻好后用锡纸包好-80℃保存备用；5)切片：切片前先将恒冷箱切片机调至-20℃预冷20min，同时将组织从-80℃冰箱内取出，置于恒冷箱切片机内30min，将组织块用OCT 粘贴在托物台固定，冠状面连续切片，然后进行切片。
6)贴片染色标本切片厚度为15~20um，漂片染色（蛋白表达量低的采用）切片厚度为30~40um。
选用多聚赖氨酸预处理的载玻片进行贴片，贴片时玻片应从一侧贴附切片，如果不平可用小毛笔蘸少许纯水轻轻抚平。
7)将贴好的切片置于37℃温箱烤1h，烤干后即可进行染色或装入切片盒密封-80℃保存备用。
2.1.5.2 免疫荧光染色步骤1) 取出冰冻切片，室温放置30min，PBS 洗10min×3 次；2) 0.4%Triton-100 浸泡10min（1000ml PBS+4ml Triton-100）；3) PBS 洗10min×3 次；4) 抗原修复（高压锅限压阀冒气后计时1.5min，冷水降压，自然冷却）；5) PBS 洗10min×3 次；用组化笔在距离组织2mm 处划圈；6) 5%驴血清（与二抗源性相同）封闭1h；7) 一抗：甩去多余血清，不洗。
大鼠脑组织冰冻切片免疫组化漂片法的实验研究
【 Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄ ｓ 】 Ｂ ｌ ｅ ａ ｃ ｈ ｉ ｎ ｇ ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ Ｉ Ｈ Ｃ Ｆ ｒ ｏ ｚ ｅ ｎ ｓ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ
免疫 组织 化 学 （ Ｉ Ｈ Ｃ）是 常规病 理诊 断 中不可 缺 少 的重要方 法 ，在神经 科研 中也至关重 要。常规 免疫 组化 采用 贴 片法 进行染 色 ，操作 步骤 中易发 生干 片 ， 试 剂使 用量较 大 ，染色组 织数量 较少 ，对需 要进行 大
例 ，应用漂片法进行免 疫染色。结果 组织切片 完整 ，染色背景干净 ，未见非特异 染色，Ｔ Ｈ￣ Ｅ Ｉ 性表达 明显 ，形 态正常。结论 应用漂 片法对
大鼠脑组织进 行免疫组化染 色，可优化染 色效果 ，提 高工作效 率。
冰冻切片技术
冰冻切片技术1：实验原理：利用物理降温的方法将新鲜组织标本冷冻产生一定的硬度进行切片，与石蜡切片相比，冷冻切片不需要脱水处理。
因此制片速度快，是术中进行快速病理争端的良好方法。
2：实验步骤：①取材：从新鲜的小鼠中剖取肝、肺、心、胰腺、肾等组织器官至载玻片上②冷冻前将恒温冷冻切片机的速冻住头温度和箱内温度调至-20--15℃，将组织器官移到涂了一层耦合剂的组织支承器冻面上，用镊子压平，再挤上一层耦合剂覆盖标本。
放至冰冻机中降温处理③标本冷冻后将组织支承器固定在切片机的机头上，调整机头的位置使其正好位于切片刀的后方。
④以粗修的方式粗修到暴露标本的最大平面，用毛笔清除机头、组织支承器及刀片上的组织碎屑。
⑤确认切片的厚度，一般为4到5vm不等，根据组织的不同可适当调整切片的厚薄。
⑥放下放卷板使其位置恰好与刀片的刀刃完全平行并略突出刀刃⑦以转动大轮推进的方式进行切片，良好的切片将在放卷板的下方形成一张完整平坦无褶的薄片，若切片略有弯曲，可用毛笔轻轻展平。
⑧打开放卷板，将标记好的载玻片平稳的轻压组织，使其平整的吸附到载玻片上。
⑨将切好的标本薄片迅速放入95％的乙醇固定液中进行3min的固定，再经过1min的流水冲洗，进入染色程序⑩按照：苏木素（1min）→流水冲洗（3min）→伊红染液（30s）→流水冲洗（1s）→85％乙醇→95%乙醇（10s）→无水乙醇①（30s）→无水乙醇②（1min）→二甲苯①（1min）→二甲苯②（1min）①将染色完成的标本使用树胶与盖玻片进行封片操作②将标本放到显微镜下，观察拍照记录10×、40×的镜下观3：实验结果：在镜下可观察到小鼠的肝细胞，细胞核被染成蓝色，胞质及细胞间隙被染成淡红色，同时可见大多数细胞中脂肪将细胞核挤到细胞一侧。
4：结果分析及讨论：①切片前先预调好厚度，提前准备好要使用的工具。
②切片时，观察窗不可打开过大，预防温度升高影响切片③在每一次切片之后都应该要注意清理碎屑，以防污染④严格把握染色时间，避免因染色时间太短或太长而影响实验观察5：思考题：①什么时候做冰冻切片：1：在手术:进行中，突然发现病人的病变原及诊断，判断病变是否为肿瘤2：判断肿瘤的良恶性2：了解淋巴结是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其他的治疗措施。
基于正交设计大鼠脑动脉血管分叉冠状冰冻切片制备方法研究
ｔｒ ｏ ｌ ｅ ｑ ｉ ｋｙ ｏ ｔｉ ｅ ｒｒ ｔ ｅ ｅ ｒ ｒ ｒ ｉ ｒ ａｉｎ ｃ ｒ ｎ ｌｓ ｃｉ ｎ ｂ Ｐ Ｓ ３ ０ ｏ ｓ ｃ ｕｄ ｂ ｕ ｃ ｌ ｂ ａ ｎ ｄ ｆ ａ ｒ ｂ ａ ａ ｔｙ ｂ ｆ ｃ ｔ ｏ ｏ ａ ｅ ｔ ｙ Ｓ Ｓ １ ． ． ｏ ｃ ｌ ｅ ｕ ｏ ｏ
大鼠脑冰冻切片
大鼠脑冰冻切片
我做大鼠脑冰冻切片的程序如下，没有出现碎裂和冰晶。
（1）麻醉，开胸，经主动脉关注0.9%的生理盐水（主动脉可用丝线或动脉夹固定针头），待心脏鼓起时剪开右心耳，灌注到经右心耳流出液清澈为止。
（2）前固定：灌注4%多聚甲醛（用0.1M PB配置），先快后慢，开始会出现四肢抽搐，直到肝脏变硬，灌注量约300 ml，时间30-40 min。
（3）取脑，后固定在4%多聚甲醛过夜。
（4）脱水：30%蔗糖溶液（用0.1M PB配置）脱水层底，最多可放置1周。
（5）冰冻切片：先从液氮罐中取出适量液氮放在保温杯中，将脑用OCT包埋在探头上，探头用绳子固定好，放进保温杯中保持15s后取出，但不要将脑浸入液氮中，以防止碎裂。
（6）取出探头放入冰冻切片机机箱内平衡（-26度）1小时后开始切片。
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【操作步骤】
1．小鼠的灌注固定：动物经麻醉后开胸暴露心脏，经左心室先快速灌注生理盐水
(50mL左右)至流出液变清亮，然后换4％多聚甲醛继续灌注大约100ml至组织变硬。
2．取材：小心剥离脑组织，置广口瓶中用4％多聚甲醛后固定12～24h。
3．脱水：将标本移入30%蔗糖溶液（用4％多聚甲醛配制），4℃放置至组织块沉底
4．将少量包埋剂OCT滴加到标本台，放入恒冷箱切片机内至变白，然后取出快速将
表面用单面刀片修平。
5．用安全刀片将标本底部修平后迅速粘附于标本台，然后置入-24℃恒冷箱切片机的
冷冻台。
待组织略微发白时用OCT在标本表面涂一薄层，继续冷冻20min。
6．调好切片厚度后开始切片。
如果是采用漂片，切片厚度一般20～30μm，切好的片子可以连续收集也可以每隔5～6片收集一片，移入含4％多聚甲醛的6孔板、24孔板
或别的容器。
如果是准备做贴片，片厚一般10μm；可以连续裱片，也可以每隔5片或10片裱一片，贴好后放切片盒，50度左右烤片1小时使其贴牢.
7．将切好的片子放4℃保存备用。
做室旁核的话可以将脑袋反过来，在腹侧面，大概切掉视交叉前和下丘脑之后的部分、只保留中间部分然后连续切片就可以了。
如果是漂片，室旁核的部分切不了很多；如
果贴片那切出来的要多一点。
做免疫组化的话漂片就可以了。
液氮或低温冰箱里的冻存必须要有防冻液，否则必然切片会碎掉。