以前做冰冻切片

冰冻切片与漂片免疫组化

以前做冰冻切片,总是遇到问题,后来查文献,自己又做实验比较,总算找到了又快又好地办法, 拿出来和大家分享一下.

1. 取脑一定要在冰上操作,液体也一定用冷的

2. 30%蔗糖一定要充分,最好中间换液一次, 20%的可以不做

3. 沉淀后冻存,一定要快冻, 最好在干冰上操作.

4. 最重要的一点, 灌注的时候, 不要用0.1M PB, 用0.01M PBS. 以前不知道,很多书上写的都是0.1M PB,后来自己用了发现还是有洞. 为了这个,我还专门作了对照实验,结果0.01M PBS更好一些, 原因不知道为什么, 但是事实如此. (理论上高浓度液体更利于保护细胞不会因为冰冻损伤)

5. 如果做磷酸化的抗体,一定记得在灌注液里加一定的抑制剂,如NaF等.

蔗糖俺用25%/PBS 的，不用换液，只要过夜12个小时就能沉下去了。包埋的时候不用冲洗，但是要注意一定要用吸水纸擦干蔗糖溶液，否则切片有麻烦

我做切片的时候，先用20％蔗糖（PB配）沉底，再用30％蔗糖沉底，这样脱水比较充分。一般是等切片机温度达到-22度之后，再将包埋好的脑组织放入。脱水不充分也会导致切片有洞，而且片子容易向内卷，很不好贴。一直这样做了很久，效果都还不错。

取脑后，直接投到液氮？？我试过，由于脑组织水分多，下液氮后直接就碎了～～

防止脑袋冻碎办法：

先准备好一个保温杯，倒入适量的液氮，然后在杯身中放一个纸杯（塑料或玻璃杯禁用），再在杯中放一金属片，以防止纸杯翻倒，动物脑袋取好后，先放在一张小锡箔纸上，然后连锡箔纸一起转移至杯中的金属片上面，盖上保温杯盖，3-5分钟后，见大脑表片颜色变白，表示冷冻完全，随即将大脑用锡箔纸包好，转入-80度冰箱长期保存。

脑片切好后保存方法：

1、先用手指在玻片（已挂好胶）后均匀轻轻过一下，将脑片组织贴在玻片上。

2、37度干燥箱中烘干。

3、放入切片盒中，盖紧盒盖，并用胶带将切片盒封严，外用样品袋包扎严实，即可防止水汽进入。于-20度可保存半年以上，于-80度可保存一年以上。

切忌经常打开盒子。

想请问0.01M PBS的配方，谢谢！

0.01M PBS配方（pH7.2～7.4）（500 ml）

Na2HPO4•12H2O2（分子量358.14）2.9g

NaH2PO4•2H2O2 （分子量156.01）0.295g

NaCl 4.5g

ddH2O 500 ml

混匀，完全溶解后，用H3PO4调PH值至pH7.2～7.4。

用前配制或者于4度短期保存。

用Google搜了一下发现网上很多0.01M PBS配方是：

NaCl 8.0g ；

KCl 0.2g ；

Na2HPO4 1.44g ；

KH2PO4 0.24g ；

加蒸馏水至1000ml，调节pH 到7.4

（pH 有用Na2HPO4或KH2PO4调节也有用HCl调的）

需要注意的是，通常所说的浓度0.01M 指的是缓冲溶液中所有的磷酸根浓度，而非Na 离子或K 离子的浓度，Na 离子和K 离子只是用来调节渗透压的。

我计算了下两种配方磷酸根浓度都在0.01M ，而jmfan的配方浓度更精确些，但是发现其配方中没有钾离子，不知道会不会在渗透压上有影响？另外对调PH的问题，我们一直都是用HCl调的，没有用过H3PO4或其盐，有没有大虾对这方面清楚的呢？

其实PBS的配方的确有很多，不尽相同，这里所说的PBS就是指磷酸钠盐缓冲液，当然还有磷酸钾盐缓冲液，即KPBS，我做IHC时是用磷酸钠盐缓冲液的，这2者对实验影响应该不是很大。楼主可以查一些与你检测指标相关的文献，在文献的实验方法中，会注明是用磷酸钠盐缓冲液还是用磷酸钾盐缓冲液的。

至于调节PH问题，一般是用与缓冲液相对应的弱酸根离子或弱碱性离子来调节的，所以调PBS的PH时理所当然是H3PO4来调节的，当然用HCL或盐也可以的，但不常用的，并且HCL是强酸，挥发性，稍不小心就很容易调过的

还有一点就是：我给你的那个配方，如果水的PH值没有问题的话，按相应质量的溶质配好后的PBS的PH为7.3左右，所以可以不用调PH即可用，楼主可以试试看

严格地说PBS指配方：0.01M PBS配方（pH7.2～7.4）（500 ml）

Na2HPO4•12H2O2（分子量358.14）2.9g

NaH2PO4•2H2O2 （分子量156.01）0.295g

NaCl 4.5g

ddH2O 500 ml

引用中的这个配方（NaCl 8.0g ；KCl 0.2g ；Na2HPO4 1.44g ；KH2PO4 0.24g ；加蒸馏水至1000ml，调节pH 到7.4）是1X DULBECCO'S PHOSPHATE BUFFERED SALINE (PBS) WITHOUT CALCIUM, MAGNESIUM，注意，是Dulbecco 改良的配方，简称D-PBS，还有含钙镁的配方，例如从INVITROGEN订的Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (10X) liquid Contains calcium and magnesium.

PBS - Phosphate Buffered Saline Formulation(HyClone):厂家的配方跟名称都很严谨

我实验样品冰冻切片厚20微米，很巧的是，我做的是膜受体蛋白。

一般来说，切片薄一点比较好，染色清晰，细胞形态可能要明显一点，但是有可能难以观察完整的单个细胞，因为可能刚好切到细胞体了，还有薄片切片时比较难切，后来我看了一些文献，有14微米的，20微米的，30微米的，甚至还有40、50微米的，文献上的说法也不一，我想这可能与检测蛋白的分布、特性以及丰富度等有关吧，

我20微米后的切片染色结果不错，不过我没切30微米的做比较，呵呵～

讲一下制作的技巧

制作切片时，组织进行冷冻时，必须在组织的上、下方加入适量的OCT。形成组织上、下方有一定的边，进行切片时，应将组织大面放在横位，这样可以避免组织切片时皱缩。切好的片必须跟组织相似，要避免因切片不完整造成医生漏诊。贴附组织时手不能颤抖，而且在贴附组织时手要有一个向下伸展的动作。取材时刀片要锋利，应从刀柄处拉切到刀尖，忌采用切割式切取，镊取组织块要用无齿镊、动作轻柔、避免挤压等。

你切片是连续放24孔板吗？如果是的话，能否谈谈切玩以后怎么选择脑片做组化的？就是说假如要选取某一个或几个位置的脑片（eg, bregma -1.2, 0.8, 2.2, ect)，具体应该怎么做能选的比较准?

我切下来放入12孔细胞培养板板（有保护液，参照我的另一个帖子，可以搜索到）保存，需要染色时就拿出一个孔来做free floating。切片的放置顺序是从A1，A2，A3......B1，B2......C4，第一轮放完后（每孔一片），继续从A1开始放入至C4，染色时就取一个孔的全部片子出来，每一个孔就是一套全脑的切片，如果你的切片厚度是30um，那么每套片子的层面距离就是30um×12，