以前做冰冻切片
冰冻切片详细说明解读
冰冻切片详细说明切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。
冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。
其缺点是组织过大不易冰冻，连续切片困难。
5微米以下切片不易成功。
但是随着现在冰冻包埋液的不断改进，已经能切出少于3微米的切片一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。
组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。
1．恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。
目前恒冷箱切片机的品种较多。
此种切片适用于科研和教学上的连续切片。
要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。
2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。
3．二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。
打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。
若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。
硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。
4．半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。
先接通热器的循环流水，然后接通电源，电源的正负极切勿接反，用整流电源控制温度。
二、明胶冰冻切片法明胶包埋法一般多用于冰冻切片易破碎的组织，特别是某些有树枝状突起的组织，当其切片后投入水中时，常常引起分散，甚至发生丢失，某些间隙较多的组织，有时会因发生散乱而失去相互间的联系，可形成移位现象。
制作优良冷冻切片的方法
无褶无 刀痕 ； 组织内无冰晶 ； 核质分明 ， 染色适度 ； 组织结构清
晰； 脱水透明洁净 ； 封裱美观 ； 时间迅速 。
２ ． ７ 染 色注意事项 ： ① 提倡 使用新 鲜苏木素染液 ， 每天过滤 ， 防止沉渣及结 晶的形成。②温度过低 时 ， 影响着色 ， 可适 当加
如 遇 含 水 量 多 的 标 本 时 ，用 干纱 布 或滤 纸 吸干 水 分 后 再 进行 冰冻 。
温促进染色 。③盐酸酒精分化适度 ， 否则易造成着色不佳 ， 染 色质不清晰 ， 影响诊 断。 ④氨水返蓝要适度 ， 浓度过高易脱 片。
２ ． ８ 冰冻切片冰晶的控制 ： 冰晶的形 成取 决于组织 含水 量的 多少 和冷冻的速度过慢 ， 尤其组织 细胞水解 ， 淋巴结 ， 纵 隔肿
组织温度 的变化可 影响其软硬程度 ，温度过高组织变 软 ， 温
度过低组织变硬 ， 不 同的组织 适宜不 同的温度 ： 淋 巴结 、 肾上 腺、 脑组 织 、 脾脏、 子宫 内膜为 一 １ ５ —１ ０℃， 乳腺 、 肺、 胆囊 、 子
瘤， 卵巢肿瘤为甚 ， 还有在 取材时接触到水源 ， 冷冻过程 中速
度慢 ， 蛋 白质与水形成 的胶状体受到破坏 ， 水分从胶体状态的 蛋 白质 中分解 出来 ， 这些都是造成冰晶的原因。解决 的方法 ：
１ ． １ 快速诊 断 ： 冷冻切 片是 病理科 的急诊工 作 ， 用于临床 手 术科室快速组织学 诊断 ， 特别是在手术进 行当 中取 出病 变组 织， 要求病 理医师在 很短时 间 内作 出 良恶 性诊断 ， 为手术 医
吸附在载玻 片或 盖玻 片上 。⑧正确调整使用防卷板是获得平
不可错过的【冰冻切片制备】步骤！
不可错过的【冰冻切片制备】步骤！Frozen section01什么是冰冻切片？冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。
因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。
02制备步骤将组织在恒温冷冻切片机里切片。
冷冻腔内的温度一般设置为-18至-25℃，根据不同组织调节不同的腔温，平时应将冷冻头放置于冷冻台上。
冷冻切片机应长期处于恒温冷冻状态。
1）当冰冻组织取好后，在冷冻头上放少量的OCT或羧甲基纤维素(可用普通胶水代替)，放上组织，速冻；2）待组织冻结后，将冷冻头装到切片机上；3）粗切，修出切面细切几张，用毛笔刷去刀上组织片；4）放下抗卷板，开始切片，切片厚度一般为5～6微米，切出的片子用载玻片贴附后立即放入甲醇冰醋酸液（97ml甲醇+3ml冰醋酸）中固定，固定时间为10～20秒；03注意事项1）速冻：是冰冻切片的关键，因为只有速冻才能减少组织内的冰晶，最好的办法是将速冻头迅速压在组织上，冻好后就可切片。
特别适用于较脆的组织。
而含有脂肪较多的组织，最好放在液氮里处理。
在液氮里冷冻要注意不要冻过头，2～3秒钟就要拿出来看一下，只要有4/5的组织已经冻住就可以了，待冷冻头拿出后刚好全部冻住，否则就会引起组织发脆，或冷冻头与组织分离。
2）固定：切片后应立即放入甲醇冰醋酸中固定，不能等切片干后再固定，后者容易造成细胞退变。
固定液有很多种，甲醇作用快，收缩小，染色较清晰，是冰冻切片最理想的固定液，而每97ml加入冰醋酸3ml，会减少某些胶质、钙质较多的组织不容易掉片。
3）包埋剂：可用普通胶水代替，但要加入适量的水（胶水与水的比例大约在2：1左右）。
太稀了，容易损伤切片刀；太稠了，粘在切片上不容易洗掉，影响切片的质量。
4）冰冻用切片刀不仅要磨的快，而且要磨的直，否则切出的片子就不会平整，不能进入抗卷板。
最好能使用一次性刀片。
5）如组织发脆，可等几分钟后再切，也可用手在组织上稍稍加温；如果用手去摸组织块，最好戴手套，或用玻片间的纸夹在手与组织之间，以防感染。
冰冻切片——一项特殊的病理检查
冰冻切片——一项特殊的病理检查三台县人民医院四川绵阳 621100在低温条件下组织能够快速冷却到一定的硬度，然后进行切片，这种方法叫做冰冻切片。
对比石蜡切片来说，冰冻切片更加简单、快捷，因而对手术中的快速病理诊断较为常用。
冰冻切片的种类繁多，有低温横冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醛循环制冷冰冻切片法等等。
这些方法中，有的随着时代的变迁和科技的不断发展，逐渐被淘汰，也有的如低温恒冷箱冰冻切片技术，也逐渐受到重视。
冰冻切片是把切下的病变组织放在冰冻切片机中迅速冷冻然后制成切片，然后由病理科医生快速的做出诊断。
一般患者在手术台上等待约30分钟左右时间，就可以得出诊断结果，这时，由手术医生决定对患者进一步的手术治疗。
通过这种方式，可以确定肿瘤的性质，从而制定合理的手术方案；还可以对恶性肿瘤的扩散情况进行一定了解，包括病变肿瘤是否浸润相邻的组织、有无转移等等；还可以对手术切缘的有无残留进行确定，同时能明确切除的组织类别。
冰冻切片诊断的缺点并不能说冰冻诊断对所有的病理诊断问题都能够解决，对比常规石蜡切片来说，其诊断准确率较低。
由于在术中对病变组织取材比较局限、组织冰冻过程中冰晶的形成会对制片质量有一定影响，以及组织特殊的处理过程和紧迫的阅片诊断时间等等因素的限制，使冰冻切片低于常规石蜡切片的精准效果，致使有时冰冻报告和常规报告之间存在异同，在一些情况下只能做到给手术医生提供一些参考性的意见，冰冻诊断还有可能要求手术医生多次病变组织送检，从而延长诊断时间，给患者的手术治疗带来一定影响。
冰冻切片病理检查的适用范围1.在进行手术过程中，突然发现患者的病变和原诊断、原定手术方案存在异样，或者出现一定怀疑时，就需要用到冰冻切片的病理检查来确定病情。
2.了解肿瘤细胞的转移程度以及患者淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，对确定是否需要彻底扫除淋巴结或其它的治疗措施有重要作用。
3.对于已经确定为恶性肿瘤的患者，需要了解手术范围、手术切缘是否有残留肿瘤组织。
石蜡切片冰冻切片超薄切片
石蜡切片技术虽然21世纪医学高科技迅猛发展、日新月异，新的诊断方法层出不穷，但迄今为止，即使是世界上最发达国家，疾病的确诊主要还是通过病理诊断。
病理诊断是所有其他诊断(包括临床诊断、影像诊断、实验室检查诊断乃至分子诊断)的金标准。
因此学习相关病理诊断技术具有重要意义。
病理技术不仅可以作为临床诊断的金标准，还可以帮助临床查明死因，对研究生来说还可以提供教学、科研的资料。
病理学科是一门基础与临床之间起着桥梁作用的重要学科，病理研究方法在技术工作上又是多方面的，有尸体解剖，大体标本的制作、制片技术（石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片、半薄切片、超薄切片）组织化学方法，免疫酶标技术、荧光技术、摄影技术等。
硕士研究生学习的课题研究阶段，往往需要自己设计并亲自动手操作，为满足研究生的实际需要，本章简要介绍常用的病理学有关技术，并注意尽量做到：①突出实用性：以行之有效的病理学常用技术为主线，围绕硕士研究生的实际需要，对病理学技术的原理、相关理论及具体操作方法、步骤等进行阐述。
②反映进展性：充分反映病理学的时代性与进展性。
第一节组织制片的概述组织制片技术的应用，从1665年由HOOk发现细胞开始，已有300多年的历史。
最早应用冰冻切片；随后又进一步利用石蜡的硬度，以石蜡包埋组织，制成石腊切片；后来又利用明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等物质的韧性，以其包埋组织而制作切片。
组织制片技术随着生物学和医学的发展而发展。
切片染色方法可以显示不同细胞和组织形态，以及细胞和组织中某些化学成分含量的变化。
因此，组织制片技术是教学、医学和科研中不可缺少的一个组成部分。
第二节制片的种类一、组织切片法：任何组织切片必须依靠切片机将组织切成薄片（厚度以μm计），再进行染色而得到结果。
在切成薄片以前必须设法使组织内部渗入足够的支持物质，使组织保持一定的硬度，然后使用切片机进行切片。
渗透到组织中的支持剂（物质）有多种，如石腊、明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等。
第三节冰冻切片介绍
第三节冰冻切片介绍冰冻切片术是一种常用的组织学技术，可以用于研究人体组织和动物组织的结构和功能。
它可以提供组织的横断面，便于观察不同结构的细胞和组织。
本文将介绍冰冻切片的原理、步骤和应用。
一、冰冻切片的原理冰冻切片是通过将组织固定在低温下进行切割，从而得到组织横切面的方法。
冷冻技术能够减少组织的变性和破坏，可以保留细胞和组织原有的形态和结构。
在常温下，组织中的脂质和蛋白质会被破坏，切片过程中也容易产生伤口和变形。
而低温冷冻可以减少这些问题的发生，使切片更加准确和可靠。
二、冰冻切片的步骤1.组织固定：将新鲜组织（或已加工处理的组织）固定在适当的固定液中，如4%的甲醛。
固定的时间根据组织的性质和要研究的问题而定，一般在几小时到几天之间。
2.组织置于冰箱中冷冻：将固定的组织置于冷冻器中进行冷冻，通常是在-20摄氏度以下。
冷冻的时间根据组织的大小和要研究的问题而定，约为几小时到一天。
3.制备冰冻切片：将冷冻的组织取出，放在切片机的架子上。
使用冰冷的刀片对组织进行切割，得到所需的冰冻切片。
切片的厚度根据组织的性质和要研究的问题而定。
4.切片上薄片：将冰冻切片绕在切片刀上，并用玻璃刀刮去多余的细胞和组织。
然后将切片放在玻璃片上，并以适当浓度的甘油溶液滴在切片上，使切片保持湿润。
5.染色和保存：根据需要将切片进行染色，使用常用的染色方法如血液染色、免疫染色等。
染色完成后，将切片放在一个干燥的玻璃片上，然后用封闭剂将切片封闭，以防止切片的变形和损坏。
最后，将切片保存在适当的环境中，避免阳光暴晒和湿气侵入。
三、冰冻切片的应用冰冻切片技术在医学研究和临床诊断中有广泛的应用。
1.病理学研究：冰冻切片可以用于观察组织的病理变化，如细胞增生、坏死和变异等。
通过冰冻切片技术，可以更加准确地诊断和鉴定疾病。
2.免疫组化染色：冰冻切片可以进行免疫组织化学染色，用于检测和定位特定蛋白质的表达。
通过这种方法，可以研究细胞和组织中特定分子的分布和功能。
制作冰冻切片的体会
制作冰冻切片的体会无论是在组织胚胎学等医学基础课中，还是在临床检验工作中，冰冻切片都有着举足轻重的作用，冰冻切片被广泛的运用在科研、教学和临床诊断中。
所谓冰冻切片就是组织在低温状态下在很短的时间内变硬并进行切片。
在临床外科手术中常常需要进行快速病理诊断，而冰冻切片就是一个很好的方法。
标签：冰冻切片；制作；体会冰冻切片是一种在低温的条件下使组织快速冷冻到一定的硬度然后进行切片的方法。
其制作过程简单方便快捷，在手术中快速进行病理诊断从而为手术在中快速确定组织性质，对医生的手术方案具有指导意义。
冰冻切片的组织在送检前不需要进行处理，其组织没有发生变化，使得原来的生活形态得以保持，特别是在免疫组织化学染色中，组织中的糖、酶、抗原、脂类等成分由于没有受到干扰而存在，组织中的细胞抗原的免疫性也得到了保存，对于需要检测糖、酶、抗原、脂类的不会受到影响。
但是，冰冻切片的制作过程要比普通的蜡切片难度大、要求高，而且组织冰冻的程度不好把握，在切片的过程中组织较易破碎，很难切成符合要求的薄片，在染色的过程中很容易脱片，所有以上这些因素都会影响到切片的质量，从而影响到了检测结果。
对于如何能有效快速高质量的制作符合要求的冰冻切片一直使我们面对的问题。
1材料和方法1.1 材料：恒冷切片机，切片刀，固定液，胶水，实验用用的新鲜组织如肝、肾、脾、皮肤、食管、胃、淋巴结、心肌、脑、卵巢、小肠等组织。
1.2 方法：采用新鲜的实验用的新鲜组织，取一块大小为1.5cm×1.5cm×3cm 的新鲜实验用组织，去除组织中的脂肪组织，在取组织的时候要注意保持干燥以免引起组织细胞发生变性和变化，把组织放在低温液氮中快速冷冻放置于冰冻台上。
在切片机内快速冰冻2分钟之后待切。
如果组织的体积较大冰冻时间相应延长，如果所取组织体积较小则相应的缩短冰冻时间，切片刀的温度控制在零下25℃-零下30℃之间。
在开始切片之前要对切片刀和防卷板之间的角度进行调整以防切出来的组织薄片卷曲。
肺冰冻切片制作流程
肺冰冻切片制作流程
肺冰冻切片的制作流程主要包括以下几个步骤：
1、取材与准备：首先需要取出组织样本，并切割组织块使其符合冰冻切片用包埋模型。
这一步骤是为了确保切片的准确性和完整性。
2、骤冷：通常采用骤冷、速冻的方法进行，冷冻速度为1~10°C/s，以减少冰晶形成。
具体方法有干冰-丙酮（乙醇）法或液氮法。
3、冷冻保护：加入冷冻保护液，如甲醇或乙醇等，以防止组织解冻时发生变化。
4、包埋：使用低温包埋剂（OCT）包埋冰冻组织。
如果组织块小，可以适量加OCT包埋剂浸没组织。
5、切片：将组织放置于恒冷箱中进行切片。
在制成冻块后，置入恒冷箱切片机冰冻切片。
6、固定：样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，在4℃冰箱预冷5-10分钟让OCT胶浸透组织。
7、保存：若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。
此外，肺组织的最佳切片温度约-20℃，在此温度区间可以制作较满意的切片。
然而，肺组织冰冻切片的质量一般不如常规石蜡切片，且冰冻准确率大多低于90%。
因此，在制作过程中需要特别注意操作的准确性和技巧。
冰冻切片技术经验总结
冰冻切片制作技巧1.从锋利的刀片开始我发现使用新的锋利的刀片时常常做出高质量的片子。
我觉得在医疗场合中某些尽量省钱的做法显得有些因小失大。
一般我对每位患者的标本都使用一组新的刀片，当片子的质量开始下降时，我会立刻更换刀片。
某些组织如质地较硬的胶原和钙化组织会使刀片很快变钝，因此，经常更换刀片显得很有必要，有时候我在切片过程中要连续更换2-3次刀片。
2.坐着还是站着我切片时总是坐在一张凳子上。
要学会把刷子作为一种便捷的辅助工具来操作，从而精细地控制显微厚薄程度的片子。
切片时俯身弯腰，颈部过伸的姿势有些不妥，要尽量处于放松和舒适的姿势以便能最大程度控制你的左手。
3.刷子我是一位刷子的使用者。
我相信要想切好片子首先学会使用刷子。
刷子的作用就在于粘住片子并把片子弄到台子上。
冷冻的片子会自发的卷缩并从刷子上脱离下来，因此，我使用一把有硬毛、夹取面宽的刷子。
我发现来自中国的野猪毛十分坚硬，非常管用。
你可以花3美元从工艺店买一把1/4英寸长的#2号扁平无色的刷子，把毛削成一个角度。
由于是个有角的头端，加上握持刷子成一定的角度，这样刷子与组织接触时就会象扫帚一样的平。
我不能理解为什么有人使用脆弱的骆驼毛刷子，组织片很容易从这些柔软的毛上掉下来。
4.握持刷子左手象拿笔一样握持刷子，将第五指轻压于台面上以稳定握笔的手(或根据手和切片机尺寸的大小置于你感觉合适的地方)，这样可以保证操作者动作的灵活及可控性。
我把刷子削成一个角度，大致与左手握持刷子的角度相同，这样使刷子平着接触组织的1/4。
5.摇柄的旋转以连续均匀的力量转动切片机的摇柄，且要毫不犹豫。
我看到很多冰冻切片者手握着刷子在开始切片时总要停一下，缓慢的抓取组织，然后再开始转动摇柄。
依我的经验看来，这种动作增加了起始切片假象的可能，会使片子的厚度不均匀，也增加了处理脂肪类组织的难度。
我切片时，象前面所说的那样手握刷子，以一种连续的动作抓取组织，这个动作与刀片接触组织同时开始并贯穿于整个过程。
冰冻切片的体会-马晓龙2015
提高冰冻切片质量的体会马晓龙北京大学医学部病理学系/北京大学第三医院病理科maxiaolong1998@2015年2月22日冰冻切片是将组织直接冰冻后进行切片，是一种简便快速的方法，常用于配合临床手术，需在短时间内制出切片，为病理的快速诊断提供依据，在病理科属于急诊工作，其重要性和责任性都很大。
能否在短时间内制出质量好的冰冻片子，一直是许多病理技术人员关心的话题。
通过参加北京病理技术质量控制冰冻切片比赛暨北京“徕卡杯”冰冻切片大赛和代表北京参加全国冰冻切片大赛，并结合多年的冰冻切片工作经验，我对如何制做出质量好的冰冻切片有了更深刻的认识——我认为一张完美的冰冻切片必须具备切片的完整性，厚薄均匀，无摺叠和切痕，组织内无冰晶，染色核浆分明，红蓝适度，组织结构清晰。
以下是我的具体体会一：制片的前期准备1、正所谓“公欲善其事，必先利其器”，要想切出好的冰冻切片，必须要有性能优良质量可靠的冰冻切片机。
冰冻机的摆放空间要留有足够的面积，最好能对流通风，保证其散热良好。
2、平时要认真仔细研读机器说明书，熟悉各个按钮的功能，掌握其操作要领，在长期的人机配合过程中充分运用机器特性，提高切片技巧。
3、在日常工作中还要定期对冰冻机进行清理和必要的检查，最好每周2-3次。
清理机器内部既可以减少切片时的交叉污染，又可以同时对切片机的性能进行检验，必要时还要除霜，保证机器的正常运转。
切制有传染性疾病的标本时，事后还必须要对机器进行彻底消毒，防止疾病传染。
二：制片过程及注意事项1、取材：标本要新鲜，不要放在盐水、酒精和甲醛中浸泡，取材好的组织尽量用滤纸将组织表面的污血和水分吸干，以减少冰晶的产生。
理想取材小为1.5-2cm×1.5-2cm×0.2cm,取材要厚薄适宜，最厚不超过0.3cm，最薄不低于0.1cm，如果太厚则组织冰冻时间要延长，且易产生冰晶。
待组织全层冻好后，表层会太硬太脆，影响后续切片，而太薄的标本在修切过程中容易修到组织托头。
快速冰冻切片的几点体会
快速冰冻切片的几点体会作者：杨月红，袁永辉（武汉市中心医院，武汉市同济医科大学附属同济医院）来源：实用医技杂志快速切片是临床医生在实施手术过程中，就与手术方案有关的诊断问题请求病理医师快速进行的紧急会诊。
快速做好精良的冰冻切片是病理医师快速诊断的重要保证。
因此，怎样快速做好冰冻切片也是病理技师面临的一个重要问题。
从1994年到2004年，我院做了近3000例组织冰冻切片，在不断的摸索过程中，我们现在可以在20min 内做出一张高质量的冰冻切片，现将我的体会简介如下。
1、取材新鲜的手术标本忌浸入酒精、甲醛中，以防组织脱水，尤其注意在取材过程中器械干燥，不沾水，组织不能冲洗，以防冰晶形成，细胞变形。
组织块大小合适，长径<>2、温度冰冻切片机昼夜24h处于预冷的-4℃左右，做快速切片时将温度降到组织块所需温度。
不同组织对温度要求不同，温度过低，组织变脆、易碎，温度过高则组织过软，不能切片[1]。
根据我院多年快速切片的经验，不同组织的适宜温度见表1。
表1 我院常见手术组织适宜温度组织类型温度（℃）甲状腺、淋巴结、肝肾-16～-17子宫、乳腺、卵巢-21～-22胃、肠、肺-19～-20皮肤-20～-213、切片先要做好准备工作，使用前将刀架与组织块的角度调整好，调整好后不需要经常变换角度，刀要及时打磨，保持刀口锋利。
切片机内要保持清洁，用冰冻切片机消毒液喷洒消毒。
切片时用力均匀，厚度约在4Λm～5Λm，特殊要求时，可达到3Λm，切好的组织在干净的玻片上粘附时可顺着一个方向稍微用力轻轻一带，可避免组织摊片过程中皱折，切好后立即放入提前配制好的冰冻切片固定液中及时固定1min～2min[2]。
固定液使用专门配制的冰冻切片固定液，经过长期摸索，我院现使用的一种苦味酸固定液，配制方便，固定迅速，对组织的肿胀和收缩有一定的抑制作用，细胞的形态和结构与常规的石蜡切片相差不大，见表2。
表2 苦味酸固定液配制方法品种重量苦味酸85%酒精饱和液75ml甲醛10ml丙酮10ml冰乙酸5ml乙酸钠1g4、染色和封片切片后做快速HE染色，苏木素染色过程需加热进行，一般1min～2min即可。
冰冻切片详细说明解读
冰冻切片详细说明切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。
冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。
其缺点是组织过大不易冰冻，连续切片困难。
5微米以下切片不易成功。
但是随着现在冰冻包埋液的不断改进，已经能切出少于3微米的切片一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。
组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。
1．恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。
目前恒冷箱切片机的品种较多。
此种切片适用于科研和教学上的连续切片。
要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。
2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。
3．二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。
打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。
若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。
硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。
4．半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。
先接通热器的循环流水，然后接通电源，电源的正负极切勿接反，用整流电源控制温度。
二、明胶冰冻切片法明胶包埋法一般多用于冰冻切片易破碎的组织，特别是某些有树枝状突起的组织，当其切片后投入水中时，常常引起分散，甚至发生丢失，某些间隙较多的组织，有时会因发生散乱而失去相互间的联系，可形成移位现象。
生物显微技术介绍——冰冻切片
生物显微技术课程论文（2010——2011学年，第一学期）冰冻切片摘要：1.1冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度, 然后进行切片的一种方法。
因其制作过程较石蜡切片相对简便、快捷, 都应用于手术中快速病理诊断。
我科于1975 年开展术中冰冻切片检查, 1995 年采用快速恒冷式切片机(德国LE2ICACM1850) , 作冰冻切片1100 余例, 其中包括乳腺、肺、喉、甲状腺、淋巴结、消化道、泌尿道、卵巢、子宫、皮肤等组织。
结果显示, 切片顺利,制作效果满意, 为病理诊断提供了可靠的依据。
既免除了患者多次手术带来的巨大痛苦, 又节约了患者的住院费用, 深受广大临床医生及患者的欢迎及好评。
关键词：冰冻切片方法及注意事项冰冻切片机1 冰冻切片简介1.1冷冻切片的种类冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。
这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。
当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。
1.2冷冻切片的目的1.2.1在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术方案不相符合，或者怀疑时，需要病理确定。
1.2.2了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。
1.2.3了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。
1.2.4在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织。
1.2.5显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。
1.2.6某些酶的显示如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等。
1.2.7神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。
1.2.8对某些物质所进行的免疫荧光的研究。
冰冻切片的步骤要求和作用
冰冻切片的步骤要求和作用环境要求：冰冻切片是一种常用的实验技术，在生物学研究、组织学以及免疫组织化学等领域中广泛应用。
它的作用是在保持组织的形态和结构的同时，为后续的研究提供高质量的样品。
下面是冰冻切片的步骤要求和作用的详细介绍。
步骤要求：1.样本选择：选择适合冰冻切片的样本，例如组织的大小适中且不易破裂的组织。
2.固定样本：使用适当的固定剂对样本进行固定，以保持组织的形态和结构。
3.处理样本：用缓冲液对样本进行洗涤处理，去除细胞液和外源性污染物。
4.冻结样本：将样本在低温条件下冻结，最常用的方法是使用液氮或酒精浴。
5.切片样本：使用切片机将冻结的样本切成薄片，通常为10-50微米的厚度。
6.挂片或贴片：将切片移至载玻片或切片笼中，并在玻片上做相应的标记。
作用：1.保持组织形态和结构：冰冻切片可以保持组织的天然形态和结构，避免固定和染色等过程对组织产生的变性和变形。
2.提供高质量的样品：因冰冻切片的快速切割过程，可以获得高质量、无伤害的组织样品，适合各种形态和形状的组织切片。
3.便于固定和染色：冰冻切片可以便于进一步固定和染色处理，以进行组织学、免疫组织化学等研究。
4.保存组织信息：冰冻切片可以有效保存组织的蛋白质、核酸和其他生物大分子的信息，保留了研究的全面性和综合性。
5.实时观察组织结构：冰冻切片可以随时进行观察和实时分析，不需要特殊的染色处理，有利于实验结果的快速获取。
总结：冰冻切片是一种常用且重要的实验技术，在生物学研究中发挥着重要的作用。
它的步骤要求和作用都与保持组织形态和结构、提供高质量样品、便于进一步处理和观察等方面密切相关。
通过冰冻切片技术，我们可以更好地理解和研究生物体内部的结构和功能，为生物学研究的进展提供有力支持。
冰冻切片实验步骤
冰冻切片实验步骤
嘿，咱今儿就来讲讲这冰冻切片实验步骤！
你可别小瞧这冰冻切片，就像是厨师要做出一道美味佳肴，每一步都得精心料理。
首先呢，得准备好新鲜的样本，这就好比是做菜得有好食材呀！把样本修整好，可不能随随便便就扔那儿了。
然后就是冷冻啦！把样本放到那专门的冷冻设备里，让它快速地冻起来，这就像是给样本穿上了一层“冰铠甲”。
接下来，切片环节可就来咯！要小心翼翼地操作，不能切得厚了薄了的，那得跟艺术品一样精致才行。
想象一下，要是切得乱七八糟，那后面还怎么观察呀！
切好片之后呢，还得给它贴上标签，可不能搞混了呀，这就像给每个小宝贝起个名字一样。
再之后，就是染色啦！给这些切片染上漂亮的颜色，让它们能更好地展示出自己的特点。
这就跟给人化妆似的，得恰到好处，才能凸显出美来。
染完色，可不能忘了清洗呀，把多余的染料洗掉，让切片干干净净的。
最后就是观察啦！在显微镜下，仔细地瞅瞅这些切片，看看能发现
啥秘密。
这就像是在寻宝一样，充满了惊喜和期待呢！
做冰冻切片实验呀，就跟走一条小路似的，每一步都得稳稳当当的，要是哪一步出了岔子，那可就前功尽弃啦！所以呀，得打起十二分的
精神来。
总之呢，冰冻切片实验可不简单，但只要咱认真对待，一步一个脚
印地去做，肯定能收获满满的成果呀！加油吧！。
冰冻切片制作方法与注意事项固定：固定即借助化学试剂是组织和
冰冻切片制作方法与注意事项一、固定：固定即借助化学试剂是组织和细胞中的有机和无机成分凝固或沉淀，停止发生死后组织变化，尽量保持其活体状态的过程。
固定的方法有浸泡固定法，注射、灌注固定法，蒸汽固定法，本实验用的是注射、关注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难流入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，就可采用灌注或灌流固定法。
固定时将固定液直接注入动物的血管，经血管分支到达整个组织或全身，从二十只得到充分固定。
固定液分为单纯固定液和混合固定液。
单纯固定液有甲醛、乙醇、氯化汞、醋酸、苦味酸等，混合固定液包括Bouin液、Zenker液、Carnoy液、中性甲醛液等。
本实验用的固定液为4%甲醛（10%福尔马林）。
固定后的处理：用水配制的固定液固定后应用流水冲洗，可是组织中的固定液随时溢出和随时洗去。
对小动物和脑组织等，应以浸泡为主，即能达到冲洗的目的，又不损害组织。
【注意事项】1.固定要及时。
2.组织块的大小要合适。
3.应有足够的固定液，一般与组织块的比例为20:1，容器勿过小，组织勿过多。
4.固定时间要合适，甲醛固定液一般固定两天左右，第一天要更换一次固定液。
5.要进行促使固定，在固定期间轻轻地搅动组织或摇动容器使组织移动有利于固定液的渗透，适当提高温度也可缩短固定时间。
6.选择合适的固定液。
7.一次取材数量过多时，应对取材部位和顺序进行编号，并及时做好记录。
二、脱水脱水就是用某些溶剂逐步将组织块内的水分置换出来的过程，使用的试剂称为脱水剂。
脱水剂有非石蜡溶剂的脱水剂如乙醇、丙酮等，和脱水兼石蜡的脱水剂如正丁醇等。
本实验所用的是乙醇脱水。
乙醇是最常用的脱水剂，其优点是脱水能力强，即能与水相混合，又能与透明剂相混，并可使组织硬化，便于切片。
缺点是穿透组织的速度快，且容易使组织收缩、变脆。
为克服这一缺点，在一般脱水中，应采用循序渐进的方法，逐步升级，经一系列不同浓度的乙醇，使组织中的水分逐渐被乙醇代替。
冰冻切片快速病理诊断30年总结
冰冻切片快速病理诊疗30 年总结秦皇岛市肿瘤医院病理科康文喜谢芳芳王小聪李英邮编： 066001 术中冰冻切片快速病理诊疗是 1818 年由 PieterdeRiemer 第一创建发明的， 1891 年Halsted 和 Accarty 将冰冻切片技术列为正式诊疗方法。
当前国内外已将此项技术广泛应用于临床，解决手术中的病理诊疗问题。
并日趋遇到外科医生和患者的欢迎和必定。
跟着冰冻切片技术和临床外科手术的发展，要求做冰冻的病例逐年增加，截止到2012 年 10 月份，本院病理科展开快速冰冻病理诊疗30 余年，共达成冰冻快速病理诊疗1476 例，累积了必定的经验和教训，为了更进一步提升冰冻快速病理诊疗水平，提升冰冻诊疗正确率，降低误诊率，作者将 30 年来全部冰冻切片快速病理诊疗病例进行总结剖析以下。
1资料和方法1.1 一般资料本组 1476 例大多数来自本院住院病人，小部分来自其余医院。
此中男 897 例，女 579 例，年纪最大 81 岁，最小 5 个月。
1.2 病变部位乳腺 1052 例，软组织 42 例，胃 33 例，淋奉承 33 例，骨 12 例，腹膜 9 例，睾丸及附睾 8 例，甲状腺 47 例，小肠 15 例，大肠 25 例，膀胱 5 例，脊椎 5 例，阑尾 10 例，胆道 14 例，阴茎 19 例，卵巢 53 例，脑及脑膜 3 例，前列腺 3 例，肝 12 例，肾 26 例，脊髓 2 例，喉 2 例，子宫 42 例，精索 1 例，纵隔 1 例，腹膜后 1 例，眼 1 例。
1.3 方法本组 1476 例均采纳德国入口莱卡冰冻切片机切片， HE染色，一般光学显微镜察看。
1.4 结果 1476 例中，恶性肿瘤 687 例，良性肿瘤 388 例，瘤样病变 170 例，炎症 202 例，结核 29 例，确诊 1457 例，未能确诊 15 例，误诊 4 例。
2.议论冰冻切片质量差，最先好多有名的病理学家如 Ewing、Brewer、Simpson等以前思疑冰冻切片的正确性， 1960 年 Cryostat 冰冻切片机正式应用于临床后，冰冻切片质量有了很大提升，但和白腊切片对比仍很逊色，瞄正确的冰冻病理1 / 3诊疗带来必定困难，特别对年青的病理科医生来说难度较大，缺少经验的病理科医生难以胜任此项工作，下边依据自己个人的经验发布一点见解。
冷冻切片制作体会
冷冻切片制作体会冷冻切片是借助在低温的条件下，使组织迅速冻结达到一定硬度进行切片的一种方法。
冷冻切片技术距今已近有100多年的历史，主要在外科手术中确定病变性质，了解肿瘤的扩散情况，包括肿瘤是否浸润相邻组织，有无区域淋巴结转移等及手术切缘有无肿瘤组织残留。
因此，制作一套高质量的冷冻切片对于确保病理诊断的科学性、可靠性是极其重要的。
如今，绝大多数的医院都有国产或国外的冷冻切片机，冷冻切片已经成为病理科的日常工作，成为病理科不可缺少的一部分。
资料与方法一般资料：2004年4月～2010年12月将我院手术中的各种送检活体组织标本，使用仪器德国莱卡-3050s型冷冻切片机制作病理冷冻切片。
方法：冷冻温度一般在-21～-25℃之间，使用OCT包埋剂。
细小组织全部取材，大组织的取材大小为1cm×1cm×0.5cm，在包埋冻头上加少量冷冻包埋剂，在包埋剂未完全冻结之前放上组织，然后在示组织大小加适量包埋剂。
冻好的组织先粗刨修，暴露组织最大切片后再进行切片。
冷冻切片厚度以5～8μm为宜，将组织切片展平贴于载玻片上。
冷冻切片在95%酒精内固定1～2分钟，自来水充分浸洗，哈瑞士苏木素染色1～2分钟，水洗，1%盐酸酒精分化3～10秒，水洗，0.1%氨水蓝化3～5秒，水洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。
注意事项手术送检的标本要新鲜、干燥、完整，未进行过固定。
太小组织如肝穿、肾穿等组织可以放在用生理盐水浸湿的纱布上。
取材时在不影响病理诊断的前提下，标本取材尽量小一点，组织厚度不＜3mm，这样有利于组织的快速冻结。
应尽量避开坏死及有钙化的区域，对于乳腺组织及淋巴结的取材，应尽量将多余脂肪剔除。
含骨的组织不建议做冷冻切片。
要剔除手术中残留的线头、细小铁丝、钢钉等杂物。
用干净的滤纸充分吸干组织中多余的水分，能有效的减少冰晶的产生。
冷冻组织含游离水分过多，组织未吸干水分就直接包埋，切片中冰晶形成的区域无细胞组织结构，呈结晶样或不规则空隙，周围组织因为冰晶影响，组织结构不同程度破坏，细胞收缩，细胞核明显变小，不利于诊断。
冷冻切片法流程
冷冻切片法流程冷冻切片法可是个很有趣的实验方法呢！让我来给你讲讲它的流程吧。
一、准备工作。
咱得先把要用的东西都准备好。
像冷冻切片机得提前检查好，确保它能正常工作。
还有载玻片、盖玻片，这些小物件可不能少。
冷冻剂也得备足了，这就像是给咱们的切片准备的“小冰箱”呢。
另外，取材工具也很重要，像手术刀之类的，要锋利又干净。
标本也是关键，要选取合适的组织，这个组织得具有代表性，就像选演员一样，得挑个能把整个故事讲清楚的“主角”组织。
二、取材。
这一步可不能马虎。
要快速地把组织取出来，为啥要快呢？因为时间一长，组织可能就会发生变化啦。
就像新鲜的水果放久了会烂一样，组织放久了结构可能就不那么准确了。
取出来的组织大小也要合适，不能太大也不能太小。
太大了放不进切片机，太小了又可能切不到想要的结构，就像穿衣服一样，得不大不小刚刚好。
而且在取材的时候，要尽量减少对组织的损伤，这组织可是很“娇弱”的呢。
三、冷冻。
把取好的组织放到冷冻切片机里面冷冻。
这个过程就像是把食物放进冰箱速冻一样。
冷冻的温度得调好，不能太冷也不能不够冷。
太冷了可能会让组织变得太硬，容易碎掉，就像冰块掉地上容易裂一样。
不够冷呢，组织又切不好，软趴趴的怎么能切出漂亮的切片呢。
在冷冻的时候还要注意观察组织的状态，就像看着锅里的菜有没有熟一样。
四、切片。
等组织冷冻好了就可以切片啦。
切片的时候手要稳，就像绣花一样。
切片的厚度也很有讲究，太厚了看不清楚细胞结构，太薄了又容易切坏。
这就需要不断地练习，找到那种恰到好处的感觉。
而且切出来的切片要完整，不能缺边少角的，不然就像漂亮的拼图少了几块，多可惜呀。
五、贴片。
切好的片子要贴到载玻片上。
这个时候要小心操作，就像把小宝贝轻轻地放在床上一样。
要确保片子贴得平平整整的，不能有褶皱，要是有褶皱就像衣服没熨平一样，看着就不舒服，而且还会影响观察呢。
六、染色。
贴片完成后就可以染色啦。
染色剂就像给组织穿上不同颜色的衣服，这样我们就能更清楚地看到不同的结构啦。
以前做冰冻切片
冰冻切片与漂片免疫组化以前做冰冻切片,总是遇到问题,后来查文献,自己又做实验比较,总算找到了又快又好地办法,拿出来和大家分享一下.1.取脑一定要在冰上操作,液体也一定用冷的2. 30%蔗糖一定要充分,最好中间换液一次, 20%的可以不做3.沉淀后冻存,一定要快冻,最好在干冰上操作.4.最重要的一点,灌注的时候,不要用0.1M PB,用0.01M PBS.以前不知道,很多书上写的都是0.1M PB,后来自己用了发现还是有洞.为了这个,我还专门作了对照实验,结果0.01M PBS更好一些,原因不知道为什么,但是事实如此. (理论上高浓度液体更利于保护细胞不会因为冰冻损伤)5.如果做磷酸化的抗体,一定记得在灌注液里加一定的抑制剂,如NaF等.蔗糖俺用25%/PBS的，不用换液，只要过夜12个小时就能沉下去了。
包埋的时候不用冲洗，但是要注意一定要用吸水纸擦干蔗糖溶液，否则切片有麻烦我做切片的时候，先用20％蔗糖（PB配）沉底，再用30％蔗糖沉底，这样脱水比较充分。
一般是等切片机温度达到-22度之后，再将包埋好的脑组织放入。
脱水不充分也会导致切片有洞，而且片子容易向内卷，很不好贴。
一直这样做了很久，效果都还不错。
取脑后，直接投到液氮？？我试过，由于脑组织水分多，下液氮后直接就碎了～～防止脑袋冻碎办法：先准备好一个保温杯，倒入适量的液氮，然后在杯身中放一个纸杯（塑料或玻璃杯禁用），再在杯中放一金属片，以防止纸杯翻倒，动物脑袋取好后，先放在一张小锡箔纸上，然后连锡箔纸一起转移至杯中的金属片上面，盖上保温杯盖，3-5分钟后，见大脑表片颜色变白，表示冷冻完全，随即将大脑用锡箔纸包好，转入-80度冰箱长期保存。
脑片切好后保存方法：1、先用手指在玻片（已挂好胶）后均匀轻轻过一下，将脑片组织贴在玻片上。
2、37度干燥箱中烘干。
3、放入切片盒中，盖紧盒盖，并用胶带将切片盒封严，外用样品袋包扎严实，即可防止水汽进入。
于-20度可保存半年以上，于-80度可保存一年以上。
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冰冻切片与漂片免疫组化以前做冰冻切片,总是遇到问题,后来查文献,自己又做实验比较,总算找到了又快又好地办法, 拿出来和大家分享一下.1. 取脑一定要在冰上操作,液体也一定用冷的2. 30%蔗糖一定要充分,最好中间换液一次, 20%的可以不做3. 沉淀后冻存,一定要快冻, 最好在干冰上操作.4. 最重要的一点, 灌注的时候, 不要用0.1M PB, 用0.01M PBS. 以前不知道,很多书上写的都是0.1M PB,后来自己用了发现还是有洞. 为了这个,我还专门作了对照实验,结果0.01M PBS更好一些, 原因不知道为什么, 但是事实如此. (理论上高浓度液体更利于保护细胞不会因为冰冻损伤)5. 如果做磷酸化的抗体,一定记得在灌注液里加一定的抑制剂,如NaF等.蔗糖俺用25%/PBS 的，不用换液，只要过夜12个小时就能沉下去了。
包埋的时候不用冲洗，但是要注意一定要用吸水纸擦干蔗糖溶液，否则切片有麻烦我做切片的时候，先用20％蔗糖（PB配）沉底，再用30％蔗糖沉底，这样脱水比较充分。
一般是等切片机温度达到-22度之后，再将包埋好的脑组织放入。
脱水不充分也会导致切片有洞，而且片子容易向内卷，很不好贴。
一直这样做了很久，效果都还不错。
取脑后，直接投到液氮？？我试过，由于脑组织水分多，下液氮后直接就碎了～～防止脑袋冻碎办法：先准备好一个保温杯，倒入适量的液氮，然后在杯身中放一个纸杯（塑料或玻璃杯禁用），再在杯中放一金属片，以防止纸杯翻倒，动物脑袋取好后，先放在一张小锡箔纸上，然后连锡箔纸一起转移至杯中的金属片上面，盖上保温杯盖，3-5分钟后，见大脑表片颜色变白，表示冷冻完全，随即将大脑用锡箔纸包好，转入-80度冰箱长期保存。
脑片切好后保存方法：1、先用手指在玻片（已挂好胶）后均匀轻轻过一下，将脑片组织贴在玻片上。
2、37度干燥箱中烘干。
3、放入切片盒中，盖紧盒盖，并用胶带将切片盒封严，外用样品袋包扎严实，即可防止水汽进入。
于-20度可保存半年以上，于-80度可保存一年以上。
切忌经常打开盒子。
想请问0.01M PBS的配方，谢谢！0.01M PBS配方（pH7.2～7.4）（500 ml）Na2HPO4•12H2O2（分子量358.14）2.9gNaH2PO4•2H2O2 （分子量156.01）0.295gNaCl 4.5gddH2O 500 ml混匀，完全溶解后，用H3PO4调PH值至pH7.2～7.4。
用前配制或者于4度短期保存。
用Google搜了一下发现网上很多0.01M PBS配方是：NaCl 8.0g ；KCl 0.2g ；Na2HPO4 1.44g ；KH2PO4 0.24g ；加蒸馏水至1000ml，调节pH 到7.4（pH 有用Na2HPO4或KH2PO4调节也有用HCl调的）需要注意的是，通常所说的浓度0.01M 指的是缓冲溶液中所有的磷酸根浓度，而非Na 离子或K 离子的浓度，Na 离子和K 离子只是用来调节渗透压的。
我计算了下两种配方磷酸根浓度都在0.01M ，而jmfan的配方浓度更精确些，但是发现其配方中没有钾离子，不知道会不会在渗透压上有影响？另外对调PH的问题，我们一直都是用HCl调的，没有用过H3PO4或其盐，有没有大虾对这方面清楚的呢？其实PBS的配方的确有很多，不尽相同，这里所说的PBS就是指磷酸钠盐缓冲液，当然还有磷酸钾盐缓冲液，即KPBS，我做IHC时是用磷酸钠盐缓冲液的，这2者对实验影响应该不是很大。
楼主可以查一些与你检测指标相关的文献，在文献的实验方法中，会注明是用磷酸钠盐缓冲液还是用磷酸钾盐缓冲液的。
至于调节PH问题，一般是用与缓冲液相对应的弱酸根离子或弱碱性离子来调节的，所以调PBS的PH时理所当然是H3PO4来调节的，当然用HCL或盐也可以的，但不常用的，并且HCL是强酸，挥发性，稍不小心就很容易调过的还有一点就是：我给你的那个配方，如果水的PH值没有问题的话，按相应质量的溶质配好后的PBS的PH为7.3左右，所以可以不用调PH即可用，楼主可以试试看严格地说PBS指配方：0.01M PBS配方（pH7.2～7.4）（500 ml）Na2HPO4•12H2O2（分子量358.14）2.9gNaH2PO4•2H2O2 （分子量156.01）0.295gNaCl 4.5gddH2O 500 ml引用中的这个配方（NaCl 8.0g ；KCl 0.2g ；Na2HPO4 1.44g ；KH2PO4 0.24g ；加蒸馏水至1000ml，调节pH 到7.4）是1X DULBECCO'S PHOSPHATE BUFFERED SALINE (PBS) WITHOUT CALCIUM, MAGNESIUM，注意，是Dulbecco 改良的配方，简称D-PBS，还有含钙镁的配方，例如从INVITROGEN订的Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (10X) liquid Contains calcium and magnesium.PBS - Phosphate Buffered Saline Formulation(HyClone):厂家的配方跟名称都很严谨我实验样品冰冻切片厚20微米，很巧的是，我做的是膜受体蛋白。
一般来说，切片薄一点比较好，染色清晰，细胞形态可能要明显一点，但是有可能难以观察完整的单个细胞，因为可能刚好切到细胞体了，还有薄片切片时比较难切，后来我看了一些文献，有14微米的，20微米的，30微米的，甚至还有40、50微米的，文献上的说法也不一，我想这可能与检测蛋白的分布、特性以及丰富度等有关吧，我20微米后的切片染色结果不错，不过我没切30微米的做比较，呵呵～讲一下制作的技巧制作切片时，组织进行冷冻时，必须在组织的上、下方加入适量的OCT。
形成组织上、下方有一定的边，进行切片时，应将组织大面放在横位，这样可以避免组织切片时皱缩。
切好的片必须跟组织相似，要避免因切片不完整造成医生漏诊。
贴附组织时手不能颤抖，而且在贴附组织时手要有一个向下伸展的动作。
取材时刀片要锋利，应从刀柄处拉切到刀尖，忌采用切割式切取，镊取组织块要用无齿镊、动作轻柔、避免挤压等。
你切片是连续放24孔板吗？如果是的话，能否谈谈切玩以后怎么选择脑片做组化的？就是说假如要选取某一个或几个位置的脑片（eg, bregma -1.2, 0.8, 2.2, ect)，具体应该怎么做能选的比较准?我切下来放入12孔细胞培养板板（有保护液，参照我的另一个帖子，可以搜索到）保存，需要染色时就拿出一个孔来做free floating。
切片的放置顺序是从A1，A2，A3......B1，B2......C4，第一轮放完后（每孔一片），继续从A1开始放入至C4，染色时就取一个孔的全部片子出来，每一个孔就是一套全脑的切片，如果你的切片厚度是30um，那么每套片子的层面距离就是30um×12，你也可以放10张片子，再重复放置。
这样的话，每套片子是30uMX10。
你也可以切20，40，50uM，根据自己的要求。
关于定位，必须参照动物的解剖图谱。
你可以拿出一套片子，作CV染色，这套片子以后就是你的标准参照了。
CV染色之后，很容易你就能区分不同的区域，以后你就知道哪一个孔里大概是什么位置。
你们在孵育一抗，二抗，ABC 时是在哪里？我为了省抗体，放在了1.5 毫升离心管里。
然后37度孵育一个小时。
我用毛笔捞片子总粘毛笔，怎么回事？显色是在培养板里。
可以用接种细菌用的“金属丝”弯曲成一个“p”形状，用于捞片，由于这种金属丝弹性较好，使用起来感觉不是那么死板，基本上不会损伤脑片。
我孵育抗体一般也是在ep管中。
我们在免疫组化过程中捞片都是用一个玻璃吸管弯成的小钩钩来挑的，毛笔只有在最后把片子铺在载玻片上的时候才用。
洗片的时候都是在24孔板，有时候孵育的时候也用1.5ml的EP管。
主要是看抗体的稀释度，如果稀释度很高，不需要减小液体体积来节省抗体的话，也用24孔板来孵育。
1.我是先用生理盐水心脏灌注，后改为用0.01MPBS配置的多聚甲醛灌注,各150ml(大鼠).2. 4%多聚甲醛浸泡1夜；先沉20%蔗糖，后沉30%蔗糖（用0.1M PB配制），20%的蔗糖沉底即可，我们的经验是30%蔗糖多沉几天，否则切出的片子很脆，容易形成细条状。
3. 为了防止切片有空洞，切之前液氮速冻1min，冰切机（-22℃）15min后再切片。
我们以前没有液氮速冻，切出的片子全是空洞。
3、用PH7.2的PBS灌注脑组织（以大鼠为例：一只大鼠用200ml灌注液）。
4、然后再用0.9%的生理盐水灌注冲洗（200ml）。
5、断头取脑。
6、用25—30%遮糖浸泡12—16小时。
取材，切片。
但切片前一定用滤纸将遮糖吸净。
7、冰冻切片机的温度分二步。
箱内温度是—20度，刀座温度是—16度。
8、为了不脱片可以在清洗好的玻片上涂上多聚赖氨酸。
9、如果是作免疫组化有另外的处理方法。
首先就是捞片的方法，感觉太费劲。
用楼主的方法还必须用吸管吸水，其实我一直用的方法是用针灸针做成的捞片，这样一张一张的将片子捞到24孔中，非常迅速，而且有水的存在不会损伤了标本，楼主的做法很可能损坏了标本。
将载玻片一头放于皿底，一头搭于皿边上，形成一个倾斜的角度，将切片用针灸针（做成的捞勺）捞片于培养皿中（这样全程都在水中操作保护标本），用勾线笔笔头轻轻拖住标本的一边（借助水的吸附力拖动标本，这样标本在水中不容易出现皱着和破损），将标本拖到载玻片上合适的位置，笔头一转，脱离标本，而且多余的PBS会顺着培养皿的PBS 液流入培养皿，这样的话标本留下的水会很少（这一点很重要，显微镜下看片的时候就知道为什么了）！切片是大鼠脊髓，数量在10张左右，因为孔体积小，面积越大的切片数量要越少。
盒子里是海绵。
板子是找厂家做的。
吸管要加大口径，还要用酒精灯烧一下。
把贴片的链接补上了。
曲拉通-100，现在我只是在封闭液里加，有个体会给大家说一下，我把封闭液1毫升分装好，用前再用枪头加3微升曲拉通，曲拉通因为是油性的，枪头外壁上很容易沾上，这样加到封闭液里的量就比较多，造成染色失败。
现在我是用纸把外壁的擦掉再加，就没问题了。
少数情况下也不用。
你所说的先染色后裱片的方法叫做whole-mount，全组织标本包埋。
这种方法一般切片较厚，可达到100um，甚至更厚。
所以楼主不用担心没有附着物的问题，在操作中直接用一把弯钩的镊子就可以了。
这种方法的好处就是更直观，立体感更强。
更具有统计学意义。
但是这种片子在制作过程中比较麻烦，由于切片较厚，还需要triton透膜等步骤。
而且观察的时候最好采用激光共聚焦。