第五章高效液相色谱法6hppt课件
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高效液相色谱法 PPT课件
①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
第五章高效液相色谱法6hppt课件-PPT精品文档
四、检 测 器 高效液相色谱仪中的检测器是三大关键部件 (高压输液泵、色 谱柱、检测器)之一，主要用于检测经色谱柱分离后的组分浓 度的变化，并由记录仪绘出谱图来进行定性、定量分析。一 个理想的液相色谱检测器应具备以下特征：灵敏度高；对所 有的溶质都有快速响应；响应对流动相流量和温度变化都不 敏感；不引起柱外谱带扩展；线性范围宽；适用的范围广。 可惜至今没有一种检测器能完全具备这些特征。 常用的检测器为紫外吸收检测器 (UVD)、折光指数检测器 (RID)、电导检测器(ECD)和荧光检测器(FD)。 在高效液相色谱技术发展中，检测器至今是一个薄弱环节， 它没有相当于气相色谱中使用的热导池检测器和氢火焰离子 化检测器那样的即通用又灵敏的检测器。但近几年出现的蒸 发激光散射检测器(ELSD)有望成为高效液相色谱全新的通用 灵敏的质量检测器。
第四节 高效液相色谱仪简介 高效液相色谱仪可分为分析型和制备型，虽然它们的性能 各异、应用范围不同，但其基本组件是相似的，对分析型商品 仪器可有如下两种组合方式： ①完全紧凑的整体系统。其死体积小，灵敏度高，体现高 效液相色谱仪总体实用的特点。 ②独立部件的组合系统。其灵活性高，可根据不同的分析 目的，组装成不同的联接方式。 现在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很 高，即能控制仪器的操作参数 ( 如溶剂梯度洗脱、流动相流量、 柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等 ) ，又能对获得 的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰 面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全 的分析工具。
（二）柱连接方式 柱接头通过过滤片与色谱柱管连接，在色谱柱管的上 下两端要安装过滤片，过滤片一般用多孔不锈钢烧结 材料。此烧结片上的孔径小于填料颗粒直径，却可让 流动相顺利通过，并可阻挡流动相中的极小固体颗粒， 柱出、入口的连接管的死体积亦 应愈小愈好，一般常用窄孔 (内径0.13mm)的厚壁(1.5— 2.0mm)不锈钢管，以减少柱 外死体积。所用柱接头，联 接螺帽，密封圈及色谱柱接 头皆为不锈钢材料。
高效液相色谱法培训PPT课件
chromatography）。
8
手性色谱(chiral chromatography) 用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类： 直接法 手性固定相法（chiral stationary phase;CSP) 手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA) 间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类 烷基磺酸盐——用于碱类
5
离子色谱法（ ion chromatography ） 离子色谱是由经典的离子交换色谱 发展起来的一种液相色谱技术，利 用物质在离子交换柱上迁移的差异 而达到分离，用于亲水性阴阳离子 的测定。根据是否采用抑制柱，可 分为抑制型离子色谱和非抑制型离 子色谱。
本法中流动相在检测前已蒸发，故梯度 洗脱基线稳定。
45
喷雾 蒸发 检测
色谱柱流出物
N2
组分的 气溶胶
溶剂 光 源
泵
水不注
、 醋 酸 。
能 含 缓 冲 盐 ， 若 调 节
意
： 流 动 相 必 须 是 挥
pH
发
可性
用的
氨，
46
质 谱 检 测 器
47
Flu
10%
Ms
1%
other 4%
Conduc 5%
1
第一节 概述
8
手性色谱(chiral chromatography) 用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类： 直接法 手性固定相法（chiral stationary phase;CSP) 手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA) 间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类 烷基磺酸盐——用于碱类
5
离子色谱法（ ion chromatography ） 离子色谱是由经典的离子交换色谱 发展起来的一种液相色谱技术，利 用物质在离子交换柱上迁移的差异 而达到分离，用于亲水性阴阳离子 的测定。根据是否采用抑制柱，可 分为抑制型离子色谱和非抑制型离 子色谱。
本法中流动相在检测前已蒸发，故梯度 洗脱基线稳定。
45
喷雾 蒸发 检测
色谱柱流出物
N2
组分的 气溶胶
溶剂 光 源
泵
水不注
、 醋 酸 。
能 含 缓 冲 盐 ， 若 调 节
意
： 流 动 相 必 须 是 挥
pH
发
可性
用的
氨，
46
质 谱 检 测 器
47
Flu
10%
Ms
1%
other 4%
Conduc 5%
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第一节 概述
高效液相色谱法(HPLC) ppt课件
此法在杂环类药物的鉴别实验中有广泛应用。
ppt课件
32
流动相选择该注意的几点问题
1、尽量使用高纯度试剂做流动相，防止微 量杂质长期积聚而损坏色谱柱；
2、避免流动相与固定相发生相互作用而使 柱效下降或损坏柱子；
3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防 止产生沉淀并在柱中沉积；
4、流动相同时还应满足检测器的需求。
高效液相色谱法 （HPLC）
ppt课件
1
色谱法定义
• 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分 离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测 手段，就成为色谱分析法。
• 色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体， 由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法 （LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在 固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相 色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、 液-液色谱。
阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；
流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液 ；
阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；
应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核酸等。
而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分
在最佳条件下得以分离。
ppt课件
10
四、液相色谱分析法的原理
• （二）高效液相色谱的分离过程 •
• 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固 定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。 它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或 分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶 质得以分离。
ppt课件
32
流动相选择该注意的几点问题
1、尽量使用高纯度试剂做流动相，防止微 量杂质长期积聚而损坏色谱柱；
2、避免流动相与固定相发生相互作用而使 柱效下降或损坏柱子；
3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防 止产生沉淀并在柱中沉积；
4、流动相同时还应满足检测器的需求。
高效液相色谱法 （HPLC）
ppt课件
1
色谱法定义
• 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分 离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测 手段，就成为色谱分析法。
• 色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体， 由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法 （LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在 固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相 色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、 液-液色谱。
阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；
流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液 ；
阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；
应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核酸等。
而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分
在最佳条件下得以分离。
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10
四、液相色谱分析法的原理
• （二）高效液相色谱的分离过程 •
• 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固 定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。 它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或 分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶 质得以分离。
高效液相色谱分析ppt课件
liquid-solid adsorption chromatograph
三、离子交换色谱
ion-exchange chromatograph
五、离子对色谱
ion-pair chromatograph
四、离子色谱
ion chromatograph
六、排阻色谱
size- exclusion chromatograph
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
2019/9/23
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题： (1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； (2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。
2019/9/23
1、离子色谱法原理
离子交换原理，与传统离子交 换的不同点： 采用交换容量非常低的特制离子 交换树脂为固定相； 细颗粒柱填料，高柱效；采用高 压输液泵； 低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱 来消除淋洗液的高本底电导）； 可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物； 各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。
B2 Dm DmT
柱温T 低，流动相大B相忽略
2019/9/23
速率理论(与GC对比)
• 讨论：
• 1）流动相流速对HPLC板高的影响(与GC对比)next
三、离子交换色谱
ion-exchange chromatograph
五、离子对色谱
ion-pair chromatograph
四、离子色谱
ion chromatograph
六、排阻色谱
size- exclusion chromatograph
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
2019/9/23
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题： (1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； (2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。
2019/9/23
1、离子色谱法原理
离子交换原理，与传统离子交 换的不同点： 采用交换容量非常低的特制离子 交换树脂为固定相； 细颗粒柱填料，高柱效；采用高 压输液泵； 低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱 来消除淋洗液的高本底电导）； 可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物； 各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。
B2 Dm DmT
柱温T 低，流动相大B相忽略
2019/9/23
速率理论(与GC对比)
• 讨论：
• 1）流动相流速对HPLC板高的影响(与GC对比)next
高效液相色谱分析 教学PPT课件
四、离子交换色谱
此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结 合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既 适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、 氨基酸、核酸等。
1. 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力 （或离子交换能力）的差别来实现分离的。
阳离子交换: R - SO-3H M R SO-3M H
从速率理论各项的差别看HPLC与GC的区别
H A B Cu u
1）涡流扩散项A 2）分子扩散项 B/u
A=2dp B=2Dl
3）传质阻力项
包括固定相传质阻力系数和流动相传质阻力系数
Hs
Cs df2 Ds
u
Hm
Cm
d
2 p
Dm
u
Hsm
Csm d p2 Dm
u
改进固定相成为提高液相色谱柱效的一个重要问题
惰性核
薄膜型
表面多孔型
四、排阻色谱法固定相
• 软质凝胶：水为流动相，孔径大小由交联剂控制 • 半硬质凝胶：适用于非极性有机溶剂，不能随意 更换溶剂，能耐较高压力，流速不宜大
• 硬质凝胶：多孔硅胶、多孔玻珠；多孔硅胶化学 稳定性好，热稳定性好，机械强度高，吸附问题需 要进行特殊处理。
• 选择填料时首先要考虑相对分子质量排阻极限
三、离子对色谱法（IPC）
主要用来分离强极性有机酸和有机碱。
原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为 对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子 与对离子形成离子对AB，该AB离子对的性质与A 离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子 的保留特性。
还可借助离子对的生成给试样引入紫外吸收活发 荧光的基团，以提高检测的灵敏度。
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定 相, 现多为化学键合固定相（通过化学反应将有机 分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、 流失小、适于梯度淋洗等特点 ）。
高效液相色谱法PPT课件
12
13
开机前的准备工作
1、将试验中要求的流动相配制好。 2、流动相要抽滤除气。 3、安装好试验要求的色谱柱。
14
15
正相色谱法
采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与 腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏 水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷）， 常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯 甲烷等以调节组分的保留时间。常用于 分离中等极性和极性较强的化合物(如酚 类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
3、关上排液（或灌注）旋钮，逐渐将流 速升高。平衡至少30分钟后准备进样。
23
进样前准备——样品过滤
一次性注射器
样品瓶
针式（头）过滤器
24
仪器：手动进样器-六通阀/定量环
25
手动进样器工作原理
装填状态
样品注入
26
手动进样器
27
28
仪器：检测器
29
仪器：检测器-紫外
ＤＡＤ检测器 流路
UV/Vis双灯，全波长检测
6
色素 玻璃柱
石油醚
碳酸钙颗粒
俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现 的，色谱法(Chromatography)因之得 名。
7
色谱法的分离原理是：
溶于流动相中的各组分经过固定相时， 由于与固定相发生作用（吸附、分配、 离子吸引、排阻、亲和）的大小、强 弱不同，在固定相中滞留时间不同， 从而先后从固定相中流出。又称为色 层法、层析法。
8
色谱分离过程
流动相 Temporal
course
9
液相色谱理论发展简况
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃 管柱在室温和常压下用液位差输送流动 相，称为经典液相色谱法，此方法柱效 低、时间长（常有几个小时）。高效液 相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相 色谱法的基础上，于60年代后期引入了 气相色谱理论而迅速发展起来的。
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开机前的准备工作
1、将试验中要求的流动相配制好。 2、流动相要抽滤除气。 3、安装好试验要求的色谱柱。
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正相色谱法
采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与 腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏 水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷）， 常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯 甲烷等以调节组分的保留时间。常用于 分离中等极性和极性较强的化合物(如酚 类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
3、关上排液（或灌注）旋钮，逐渐将流 速升高。平衡至少30分钟后准备进样。
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进样前准备——样品过滤
一次性注射器
样品瓶
针式（头）过滤器
24
仪器：手动进样器-六通阀/定量环
25
手动进样器工作原理
装填状态
样品注入
26
手动进样器
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28
仪器：检测器
29
仪器：检测器-紫外
ＤＡＤ检测器 流路
UV/Vis双灯，全波长检测
6
色素 玻璃柱
石油醚
碳酸钙颗粒
俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现 的，色谱法(Chromatography)因之得 名。
7
色谱法的分离原理是：
溶于流动相中的各组分经过固定相时， 由于与固定相发生作用（吸附、分配、 离子吸引、排阻、亲和）的大小、强 弱不同，在固定相中滞留时间不同， 从而先后从固定相中流出。又称为色 层法、层析法。
8
色谱分离过程
流动相 Temporal
course
9
液相色谱理论发展简况
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃 管柱在室温和常压下用液位差输送流动 相，称为经典液相色谱法，此方法柱效 低、时间长（常有几个小时）。高效液 相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相 色谱法的基础上，于60年代后期引入了 气相色谱理论而迅速发展起来的。
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当使用粗内径短柱或细内径长柱时，应注意由于柱内体积 减小，由柱外效应引起的峰形扩展不可忽视。此时应对进样 器、检测器和连接接头作特殊设计以减少柱外死体积。这对 仪器和实验技术提出了更高的要求。但这样会降低流动相的 消耗量并提高检测灵敏度。
（二）柱连接方式
柱接头通过过滤片与色谱柱管连接，在色谱柱管的上 下两端要安装过滤片，过滤片一般用多孔不锈钢烧结
③对高分子化合物或粘度大的样品，分析时柱温必须高于室温。
④对一些具有生物活性的生物分子，要求分析时柱温应低于室 温。
⑤对某些组成复杂的样品，在单一色谱柱不能实现完全分离， 需要使用二维色谱技术，利用柱切换，使两根色谱柱在不同柱温 下操作，以实现多组分的完全分离。
一个理想的HPLC柱温控制系统，如HPll00高效液相色谱仪可 以实现从低于室温10℃至80℃柱温的精确控制。对凝胶渗透色谱 仪，其柱温可从室温至150℃实现精确控温。
（三）柱温控制
在高效液相色谱分析中，温度的影响往往容易被忽略，现随分 析样品复杂性和多样性的不断出现；人们对分析结果准确度和精 密度的要求不断提高，柱温的控制日益受到人们的重视。在以下 几种情况需精确控制柱温：
①在一些法定标准分析方法中，要求保留时间具有再现性。
②必须通过改变柱温来提高分离效率。
②溶质性质检测器 此类检测器只检测柱后流出液中溶质的 某一物理或化学性质的变化。例如，紫外吸收检测器(UVD) 和荧光检测器(FD)，它们分别测量溶质对紫外光的吸收和溶 质在紫外光照射下发射的荧光强度。此类检测器灵敏度高， 可单流路或双流路补偿测量，对流动相流量和温度变化不敏 感。但不能使用对紫外线有吸收的流动相。
常用的检测器为紫外吸收检测器(UVD)、折光指数检测器 (RID)、电导检测器(ECD)和荧光检测器(FD)。
在高效液相色谱技术发展中，检测器至今是一个薄弱环节， 它没有相当于气相色谱中使用的热导池检测器和氢火焰离子 化检测器那样的即通用又灵敏的检测器。但近几年出现的蒸 发激光散射检测器(ELSD)有望成为高效液相色谱全新的通用 灵敏的质量检测器。
第五章 高效液相色谱法
高效液相色谱（High Performance Liquide Chromatography）还可称为高压液相色谱 （High Pressure Liquide Chromatography）、高速液相色谱（High Speed Liquide Chromatography）、高分 离度液相色谱（High Resolution Liquide Chromatography）或现代液相色谱 （Modern Liquide Chromatography）。
的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰
面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全
的分析工具。
高效液相色谱仪的组成
1一贮液罐；2一搅拌、超声脱气器；3一梯度淋洗装置；4一 高压输液泵；5一流动相流量显示；6一柱前压力表；7一输液 泵泵头；8一过滤器；9一阻尼器；10一六通进样阀；11一色 谱柱；12一紫外吸收(或折光指数)检测器；13一记录仪(或数 据处理装置)；14一回收废液罐
方法一样，都不可能十全十美，作为使用者在掌握了高效液相
色谱法的特点，应用范围和局限性的前提下，充分利用高效液
相色谱法的特点，就可在解决实际任务中发挥重要的作用。
第四节 高效液相色谱仪简介
高效液相色谱仪可分为分析型和制备型，虽然它们的性能
各异、应用范围不同，但其基本组件是相似的，对分析型商品
仪器可有如下两种组合方式：
①完全紧凑的整体系统。其死体积小，灵敏度高，体现高
效液相色谱仪总体实用的特点。
②独立部件的组合系统。其灵活性高，可根据不同的分析
目的，组装成不同的联接方式。
现在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很
高，即能控制仪器的操作参数(如溶剂梯度洗脱、流动相流量、
柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等)，又能对获得
材料。此烧结片上的孔径小于填料颗粒直径，却可让
流动相顺利通过，并可阻挡流动相中的极小固体颗粒， 柱出、入口的连接管的死体积亦
应愈小愈好，一般常用窄孔
(内径0.13mm)的厚壁(1.5—
2.0mm)不锈钢管，以减少柱
外死体积。所用柱接头，联
接螺帽，密封圈及色谱柱接
头皆为不锈钢材料。
1一柱接头；2一联接柱螺帽；3一接连接管的螺帽； 4—孔径0.45um的纤维素滤膜；5一多孔不锈钢烧结片； 6一柱密封圈(卡套)；7一连接管密封圈(卡套)； 8一色谱柱管；9—连接管
它们可用于痕量分析和梯度洗脱。
(2)按适用性分类
①选择性检测器 它对不同组成的物质响应差别极 大，因此只能选择性的检测某些物质，如紫外吸收检 测器、荧光检测器和电导检测器。
②通用型检测器 它对大多数物质的响应相差不大， 几乎适用于所有物质。折光指数检测器属于通用型检 测器，但它的灵敏度低，受温度影响波动大、使用时 有一定局限性。
(3)离子色谱(Ion Chromatography) 用高效微粒离子 交换剂作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动 相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上 表面带电荷基团进行可逆性离子交换能力的差别而实 现分离。
(4)体积排阻色谱(Size Exclusion Chromatography) 用 化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中 各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。以水溶 液作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶过滤色谱 (Gel Filtration Chromatography)；以有机溶剂作流动 相的体积排阻色谱法，称为凝胶渗透色谱法(Gel Permeation Chromatography)。
第二节 高效液相色谱法的分类
高效液相色谱法可依据溶质(样品)在固定相和流动相 分离过程的物理化学原理分类。
(1)吸附色谱(Adsorption Chromatography) 用固体 吸附剂作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样 品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。
(2)分配色谱(Partition Chromatography) 用载带在固相基体上 的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各 组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。根据固定相和液 体流动相相对极性的差别，又可分为正相分配色谱和反相分配 色谱。当固定相的极性大于流动相的极性时，可称为正相分配 色谱或简称正相色谱(Normal Phase Chromatography)；若固定 相的极性小于流动相的极性时，可称为反相分配色谱或简称反 相色谱(Reversed Phase Chromatography)。
(5)亲和色谱(Affinity Chromatography) 以 在不同基体上，键合多种不同特性的配位体 作固定相，用具有不同pH值的缓冲溶液作流 动相，依据生物分子(氨基酸、肽、蛋白质、 核碱、核苷、核苷酸、核酸、酶等)与基体上 键联的配位体之间存在的特异性亲和作用能 力的差别，而实现对具有生物活性的生物分 子的分离。
(一)、检测器的分类和响应特性
1．分类
(1)按检测的对象分类
①整体性质检测器 检测从色谱柱中流出的流动相总体物理 性质的变化情况。如折光指数检测器(RID)和电导检测器(CD)， 它们分别测定柱后流出液总体的折射率和电导率。此类检测 器测定灵敏度低，必须用双流路进行补偿测量；易受温度和 流量波动的影响，造成较大的漂移和噪声；不适合于痕量分 析和梯度洗脱。
一、高压输液泵
对高压输液泵的要求是：
①泵体材料能耐化学腐蚀。通常使用普通耐酸不锈钢 （Cr1Ni8Ti9）或优质耐酸不锈钢(Cr18Nil2Mo2)。为防止酸、 碱缓冲溶液的腐蚀，在离子色谱或亲和色谱分析中现已使用 由聚醚醚酮(PEEK)材料制成的高压输液泵。
②能在高压下连续工作。通常要求耐压40~50MPa·cm-2， 能在8～24h连续工作。
③输出流量范围宽。对填充柱：0.1～l0mL／min(分析型)； 1~100mL／min(制备型)。对微孔柱：10～1000uL／min(分析 型)；1~9900uL／min(制备型)。
④输出流量稳定，重复性高。高效液相色谱使用的检测器， 大多数对流量变化敏感，高压输液泵应提供无脉冲流量。这 样可以降低基线噪声并获较好的检测下限。流量控制的精密 度应小于1％，最好为0.5％，重复性最好为0.5％。
高压输液泵可以分为如下两类： 1．恒流泵 恒流泵可输出恒定体积流量的流动相。
2．恒压泵 恒压泵又称气动放大泵，是输出恒定压力
的泵。
二、进样装置
（一）六通阀进样装置
此阀的阀体用不锈钢材料，旋转密封部分由坚硬的 合金陶瓷材料制成，既耐磨、密封性能好。当进样 阀手柄置“取样”位置，用特制的平头注射器(10ul) 吸取比定量管体积(5ul或l0ul)稍多的样品从“6”处 注入定量管，多余的样品由“5”排
法的一种通用型检测器。
第三，高效液相色谱法不能替代气相色谱法，去完成要求
柱效高达10万块理论塔板数以上，必需用毛细管气相色谱法分
析组成复杂的具有多种沸程的石油产品。
第四，高效液相色谱法也不能代替中、低压柱色谱法，在
200kPa至1MPa柱压下去分析受压易分解、变性的具有生物活性
的生化样品。
综上所述可知，高效液相色谱法也和任何一种常用的分析
二、方法的局限性
第—，在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相，
当进行分析时所需成本高于气相色谱法，且易引起环境污染。
当进行梯度洗脱操作时，它比气相色谱法的程序升温操作复杂。
第二，高效液相色谱法中缺少如气相色谱法中使用的通用
型检测器(如热导检测器和氢火焰离子化检测器)。近年来蒸发
激光散射检测器的应用日益增多，有望发展成为高效液相色谱
第三节 高效液相色谱法的应用范围和局限性
一、应用范围
（二）柱连接方式
柱接头通过过滤片与色谱柱管连接，在色谱柱管的上 下两端要安装过滤片，过滤片一般用多孔不锈钢烧结
③对高分子化合物或粘度大的样品，分析时柱温必须高于室温。
④对一些具有生物活性的生物分子，要求分析时柱温应低于室 温。
⑤对某些组成复杂的样品，在单一色谱柱不能实现完全分离， 需要使用二维色谱技术，利用柱切换，使两根色谱柱在不同柱温 下操作，以实现多组分的完全分离。
一个理想的HPLC柱温控制系统，如HPll00高效液相色谱仪可 以实现从低于室温10℃至80℃柱温的精确控制。对凝胶渗透色谱 仪，其柱温可从室温至150℃实现精确控温。
（三）柱温控制
在高效液相色谱分析中，温度的影响往往容易被忽略，现随分 析样品复杂性和多样性的不断出现；人们对分析结果准确度和精 密度的要求不断提高，柱温的控制日益受到人们的重视。在以下 几种情况需精确控制柱温：
①在一些法定标准分析方法中，要求保留时间具有再现性。
②必须通过改变柱温来提高分离效率。
②溶质性质检测器 此类检测器只检测柱后流出液中溶质的 某一物理或化学性质的变化。例如，紫外吸收检测器(UVD) 和荧光检测器(FD)，它们分别测量溶质对紫外光的吸收和溶 质在紫外光照射下发射的荧光强度。此类检测器灵敏度高， 可单流路或双流路补偿测量，对流动相流量和温度变化不敏 感。但不能使用对紫外线有吸收的流动相。
常用的检测器为紫外吸收检测器(UVD)、折光指数检测器 (RID)、电导检测器(ECD)和荧光检测器(FD)。
在高效液相色谱技术发展中，检测器至今是一个薄弱环节， 它没有相当于气相色谱中使用的热导池检测器和氢火焰离子 化检测器那样的即通用又灵敏的检测器。但近几年出现的蒸 发激光散射检测器(ELSD)有望成为高效液相色谱全新的通用 灵敏的质量检测器。
第五章 高效液相色谱法
高效液相色谱（High Performance Liquide Chromatography）还可称为高压液相色谱 （High Pressure Liquide Chromatography）、高速液相色谱（High Speed Liquide Chromatography）、高分 离度液相色谱（High Resolution Liquide Chromatography）或现代液相色谱 （Modern Liquide Chromatography）。
的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰
面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全
的分析工具。
高效液相色谱仪的组成
1一贮液罐；2一搅拌、超声脱气器；3一梯度淋洗装置；4一 高压输液泵；5一流动相流量显示；6一柱前压力表；7一输液 泵泵头；8一过滤器；9一阻尼器；10一六通进样阀；11一色 谱柱；12一紫外吸收(或折光指数)检测器；13一记录仪(或数 据处理装置)；14一回收废液罐
方法一样，都不可能十全十美，作为使用者在掌握了高效液相
色谱法的特点，应用范围和局限性的前提下，充分利用高效液
相色谱法的特点，就可在解决实际任务中发挥重要的作用。
第四节 高效液相色谱仪简介
高效液相色谱仪可分为分析型和制备型，虽然它们的性能
各异、应用范围不同，但其基本组件是相似的，对分析型商品
仪器可有如下两种组合方式：
①完全紧凑的整体系统。其死体积小，灵敏度高，体现高
效液相色谱仪总体实用的特点。
②独立部件的组合系统。其灵活性高，可根据不同的分析
目的，组装成不同的联接方式。
现在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很
高，即能控制仪器的操作参数(如溶剂梯度洗脱、流动相流量、
柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等)，又能对获得
材料。此烧结片上的孔径小于填料颗粒直径，却可让
流动相顺利通过，并可阻挡流动相中的极小固体颗粒， 柱出、入口的连接管的死体积亦
应愈小愈好，一般常用窄孔
(内径0.13mm)的厚壁(1.5—
2.0mm)不锈钢管，以减少柱
外死体积。所用柱接头，联
接螺帽，密封圈及色谱柱接
头皆为不锈钢材料。
1一柱接头；2一联接柱螺帽；3一接连接管的螺帽； 4—孔径0.45um的纤维素滤膜；5一多孔不锈钢烧结片； 6一柱密封圈(卡套)；7一连接管密封圈(卡套)； 8一色谱柱管；9—连接管
它们可用于痕量分析和梯度洗脱。
(2)按适用性分类
①选择性检测器 它对不同组成的物质响应差别极 大，因此只能选择性的检测某些物质，如紫外吸收检 测器、荧光检测器和电导检测器。
②通用型检测器 它对大多数物质的响应相差不大， 几乎适用于所有物质。折光指数检测器属于通用型检 测器，但它的灵敏度低，受温度影响波动大、使用时 有一定局限性。
(3)离子色谱(Ion Chromatography) 用高效微粒离子 交换剂作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动 相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上 表面带电荷基团进行可逆性离子交换能力的差别而实 现分离。
(4)体积排阻色谱(Size Exclusion Chromatography) 用 化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中 各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。以水溶 液作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶过滤色谱 (Gel Filtration Chromatography)；以有机溶剂作流动 相的体积排阻色谱法，称为凝胶渗透色谱法(Gel Permeation Chromatography)。
第二节 高效液相色谱法的分类
高效液相色谱法可依据溶质(样品)在固定相和流动相 分离过程的物理化学原理分类。
(1)吸附色谱(Adsorption Chromatography) 用固体 吸附剂作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样 品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。
(2)分配色谱(Partition Chromatography) 用载带在固相基体上 的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各 组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。根据固定相和液 体流动相相对极性的差别，又可分为正相分配色谱和反相分配 色谱。当固定相的极性大于流动相的极性时，可称为正相分配 色谱或简称正相色谱(Normal Phase Chromatography)；若固定 相的极性小于流动相的极性时，可称为反相分配色谱或简称反 相色谱(Reversed Phase Chromatography)。
(5)亲和色谱(Affinity Chromatography) 以 在不同基体上，键合多种不同特性的配位体 作固定相，用具有不同pH值的缓冲溶液作流 动相，依据生物分子(氨基酸、肽、蛋白质、 核碱、核苷、核苷酸、核酸、酶等)与基体上 键联的配位体之间存在的特异性亲和作用能 力的差别，而实现对具有生物活性的生物分 子的分离。
(一)、检测器的分类和响应特性
1．分类
(1)按检测的对象分类
①整体性质检测器 检测从色谱柱中流出的流动相总体物理 性质的变化情况。如折光指数检测器(RID)和电导检测器(CD)， 它们分别测定柱后流出液总体的折射率和电导率。此类检测 器测定灵敏度低，必须用双流路进行补偿测量；易受温度和 流量波动的影响，造成较大的漂移和噪声；不适合于痕量分 析和梯度洗脱。
一、高压输液泵
对高压输液泵的要求是：
①泵体材料能耐化学腐蚀。通常使用普通耐酸不锈钢 （Cr1Ni8Ti9）或优质耐酸不锈钢(Cr18Nil2Mo2)。为防止酸、 碱缓冲溶液的腐蚀，在离子色谱或亲和色谱分析中现已使用 由聚醚醚酮(PEEK)材料制成的高压输液泵。
②能在高压下连续工作。通常要求耐压40~50MPa·cm-2， 能在8～24h连续工作。
③输出流量范围宽。对填充柱：0.1～l0mL／min(分析型)； 1~100mL／min(制备型)。对微孔柱：10～1000uL／min(分析 型)；1~9900uL／min(制备型)。
④输出流量稳定，重复性高。高效液相色谱使用的检测器， 大多数对流量变化敏感，高压输液泵应提供无脉冲流量。这 样可以降低基线噪声并获较好的检测下限。流量控制的精密 度应小于1％，最好为0.5％，重复性最好为0.5％。
高压输液泵可以分为如下两类： 1．恒流泵 恒流泵可输出恒定体积流量的流动相。
2．恒压泵 恒压泵又称气动放大泵，是输出恒定压力
的泵。
二、进样装置
（一）六通阀进样装置
此阀的阀体用不锈钢材料，旋转密封部分由坚硬的 合金陶瓷材料制成，既耐磨、密封性能好。当进样 阀手柄置“取样”位置，用特制的平头注射器(10ul) 吸取比定量管体积(5ul或l0ul)稍多的样品从“6”处 注入定量管，多余的样品由“5”排
法的一种通用型检测器。
第三，高效液相色谱法不能替代气相色谱法，去完成要求
柱效高达10万块理论塔板数以上，必需用毛细管气相色谱法分
析组成复杂的具有多种沸程的石油产品。
第四，高效液相色谱法也不能代替中、低压柱色谱法，在
200kPa至1MPa柱压下去分析受压易分解、变性的具有生物活性
的生化样品。
综上所述可知，高效液相色谱法也和任何一种常用的分析
二、方法的局限性
第—，在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相，
当进行分析时所需成本高于气相色谱法，且易引起环境污染。
当进行梯度洗脱操作时，它比气相色谱法的程序升温操作复杂。
第二，高效液相色谱法中缺少如气相色谱法中使用的通用
型检测器(如热导检测器和氢火焰离子化检测器)。近年来蒸发
激光散射检测器的应用日益增多，有望发展成为高效液相色谱
第三节 高效液相色谱法的应用范围和局限性
一、应用范围