实验一 物染色体压片技1

实验一植物染色体压片技术

一、实验原理：

植物染色体压片技术是利用化学或物理的方法，将具有分裂能力的细胞保持原有的分裂状态，并对其染色体进行染色，压片后观察它的染色体分裂的一种方法。

二、实验目的：

植物染色体压片技术是细胞遗传学和细胞分类学等研究中应用最为普遍的基本技术，是其他新技术所不能完全取代的，是从事染色体研究的工作者首先应该掌握的一项基本的实验方法。

三、材料的制备：

黑麦根尖(2n=14)

根尖材料的制备：

1.浸泡：大、油、壳→浸泡24h(23~25℃)；小、裸的不浸泡。

2. 发根：将材料放入具有团粒结构条件的土壤中培养（锯木屑、土壤、砾石、麦杆、谷草)；最适温度(23~32℃)；培养24h→再放入0~4℃冰处理1~7天。目的:(1)使分裂速度减慢，根尖长度整齐一致；

(2)调节工作时间。再将材料从冰箱中取出又放回最适温度条件下培养1~2天；待根尖长度为1.5~2Cm即可处理。

3. 愈伤材料的制备：(适合春、夏两季)用刀片将树杆割去保护组织露出伤口，用75﹪乙醇消毒包裹一天，再用50~75ppm赤霉素处理；几天后长出白色幼嫩的愈伤组织即可固定。

四、预处理：

1. 方法：(化学和物理两种)

(1) 化学方法：(适合所有生物)

a. 秋水仙素0.05~0.2﹪(白色粉末，易溶于水的巨毒药品)；

b. 0.002M 8-羟基喹啉(淡黄色晶体，用少量的乙醇溶解再稀释，

对禾本科植物的随体表现很清楚)；

C.а-溴萘饱和液(淡黄色的乳浊液，易溶于乙醇和苯；难溶于水，

100ml水中倒入1~2滴剧烈的振动5分钟)；

（以上abc三种药剂在15~18℃温度下处理3~5h）

d. 对二氯苯饱和液(淡黄色的晶体，难溶于水；具有强烈的腐蚀

性，只能处理1~1.5h)。

(2) 物理方法：(适合禾本科作物，本次实验所采用)

冰水混合物在0~4℃温度下处理24h。

预处理的目的破坏或抑制纺锤体形成；增加中期图象，改变细胞质的粘度，使染色体缩短变粗，易于染色体的显带及研究。五、固定：

卡诺氏Ⅰ 3︰1 (乙醇︰醋酸);

卡诺氏Ⅱ 6︰3︰1 （5︰3︰2）(乙醇︰氯仿︰醋酸);

固定的目的利用药剂迅速杀死正在分裂的细胞，使之保持细胞中的染色体处于被固定前的原有状态。

六、保存：

冲洗置换，从95﹪~70﹪的乙醇梯度置换；每次置换需停留

20~30min,目的是将固定液中的醋酸从材料中置换掉，最后将材料保存在70﹪的乙醇中备用。

七、解离：(酸解、酶解)

1、1mol/HCl 在60℃水浴中处理5~10min；

2、0.2mol/HCl 在25℃水浴中处理1~1.5h；

3、酶解纤维素酶＋果胶酶。

解离的目的使胞间层的果胶类物质解体，利于细胞分散，有助于压片；同时解离也可适当清除部分细胞质，使细胞质背景趋于透明化，

便于观察染色体。常用的解离方法主要有酸解法和酶解法。

八、染色：

1、0.5﹪的醋酸洋红，5~30min；

2锡夫试剂、减性品红、石炭酸品红。

染色的目的是为了更好的鉴别染色体。本次实验用的染料是0.5﹪的醋酸洋红。

九、制片：

制得10张分裂相好的片子，保存在片盒内，以备显带实验所用。

十、揭片：

将制片在未干燥之前，在－176℃液氮中冷冻50~70秒，取出后迅速地揭片。

实验二植物染色体去壁、低渗、火焰

干燥制片技术

一、实验原理：

用此法可以显著提高染色体的分散程度和平衡性，可以减少染色体的变形、断裂等现象，也可以减轻细胞质对染色体的覆盖。使染色体各组成部分——长臂、短臂、着丝粒、随体、染色单体等都显示得比较清楚，有利于染色体测量和显带的分析。此法也很简单，首先用酶解法去除植物细胞壁，再利用热胀冷缩的原理，将植物细胞在冰片上用火焰烧烤，用力甩片能使细胞膜破裂，不需要特殊设备，同时也省去了繁杂的压片手续，显著提高了制片的效率。

二、实验目的：

学习植物染色体标本制备去臂、低渗法的技术，为染色体显带实验提供了优良的标本。

三、实验步骤：

１、分生组织材料的制备：需要量大，方法与第一次实验相同。

(对于不容易压片技术的材料可用该种方法。比如小染色体或多染色体、以及机械组织含量高的和木本植物的根尖等。而比较珍稀的材料或容易制作的材料可不用此法)。

2、常规处理：分为活体材料和离体材料两类。本实验采用离体材

料，用物理的方法进行预处理。（方法与上次实验相同）。(活体处理：前低渗：加入0.075mkcl前低渗液，在25℃下处理30分钟。

作用：让kcl渗入到细胞中，细胞浓度加大，细胞内的水分渗透出来，便于后面实验步骤的药剂顺利进入细胞。后面的实验步骤与离体材料的相同)。

3、解离：将根放在0.2MHCL中，在25℃下浸泡1h。作用：以软化细胞壁，去除细胞壁之间的果胶质。

4、前低渗：用自来水冲洗材料，再用25℃的蒸馏水浸泡0.5h 作用：可置换出细胞内的HCL，使细胞充分吸水。染色体在细胞内处于游离状态，在制片时便于染色体分散。

5、酶解去壁：倒掉蒸馏水，加入2％的纤维素酶与果胶酶的混合液，在35-37℃下处理1h。作用：对细胞壁所含的纤维素、半纤维素和果胶质进行消化。

6后低渗：用镊子夹住根部抖落分生区，将其它部分丢弃，收集分生区组织，转入指形管，沉淀10min后吸出酶液，加蒸馏水浸泡0.5h。作用：可置换出酶液。使细胞充分吸水膨胀，染色体游离在细胞质中，制片时便于染色体分散，是关键步骤。

7、固定：吸去蒸馏水，加3︰1的甲醇固定液，静置15min。作用：置换出细胞内的水分，便于燃烧。(甲醇固定液作用有：①具有一定的脆性，甩片时容易使细胞膜破裂。2能改善染色，有助于以后实验时的吉姆萨染色)。

8、制备悬浮液：吸去上清液，以1︰10的比例加入新鲜的固定液(即一份细胞，10份固定液)，用吸管不停的吸放以捣碎组织，制成均匀的细胞悬液。