活菌培养计数检验方法
细菌菌落计数
直接法 血球记数板 活菌染色：美蓝、吖啶橙、TTC
01
间接法
02
目录
直接法—血球记数板
细菌计数板和血球计数板都用来侧微生物的总菌数。血球计数板用来测较大微生物如酵母菌和霉菌孢子的总数，细菌计数板用来测细菌的总菌数。两种计数板的构造相似，不同的是细菌计数板的深度仅为血球计数板深度的1/5。
平板菌落计数法(Colony-counting Methods)
一个活菌在合适的培养基表面，逐渐生长成一个 肉眼可见的菌落（菌落形成单位，colony forming unit, CFU），从而得知原始活菌含量。 涂布平板法Spread Plate 浇注平板法Pour Plate
间 接 法
间 接 法—平板l）=某一稀释度的平均菌落数 ×10×稀释度 注意事项见实验讲义
菌落数
1
2
平均
1
2
平均
1
2
平均
每毫升中 总活菌数
1
0.1ml
1
2
3
4
5
6
广泛用于生物制品检验(如活菌制剂)，以及食品、饮料和水(包括水源水)等的含菌指数或污染程度的检测。
疾病诊断 泌尿系感染性疾病的诊断------尿培养
细菌感染及药物治疗效果 临床病人 实验动物
适用领域：
3、菌落计算方法
3、菌落计算方法 （1）菌落计数方法 做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。 （2）菌落计数的报告 ①平板菌落数的选择 选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。
光合菌的检验方法
光合菌活菌数的检验方法①取样：先清洗一个容量为30～50毫升的取样瓶或烧杯。
由于光合细菌在培养液中的分布是不均匀的，尤其是具有强烈运动能力的种类更明显，所以在取样前必须充气或搅拌，待分布均匀后，立即用移液管（移液管应预先进行消毒处理，以免造成污染）取样，取样的量为10～15毫升。
如果取样的密度太大，计数困难，必须加水稀释到适宜浓度后方可计数。
②样品放于计数板：放置前必须将血球计数板和盖玻片清洗干净、擦干，不能有油污染和杂质。
将血球计数板平放在桌子上，盖好盖玻片；然后把样品瓶轻轻摇动几下，使光合细菌分布均匀，并立即用干净的微吸管取样品，迅速把微细吸管放到盖玻片的边缘处，轻压微细吸管的橡皮帽，使样品流入计数板内。
注意控制样品流入量，不能过多，过多则流入到沟内；也不能过少，过少则计数时不准确（计数后的数量一般偏少），应充满画线方格及其周边部分。
还应注意盖玻片下不能有气泡存在，否则会造成计数不准确。
不符合操作要求时，应立即重新开始。
样品吸入血球计数板后，稍停1分钟，待细菌沉降在玻片表面上再在显微镜下进行计数。
③计数：光合细菌的计数，必须使用油镜才能观察清楚。
可以计数中央大格的4个角的中格，每个中格有25个小格，逐一计数，4个中格相加共计数100个小格。
计数时应从计数框一角开始，在计数框边缘的标本应按"计上不计下、计左不计右"的原则，计数出细菌的总量后，按下式计算出每毫升菌液中的细菌数量：细菌数量＝100个小格的细菌数×4×10000×稀释倍数。
注意每个样品最少重复计数两次，然后取其平均值，计算细菌的数量，两次计数结果和平均数之差应不大于其平均数偏差的10％才有效。
因为盖玻片下每个大方格上的空间为0.1立方毫米，故1个大方格内的细菌数量若为n，则细菌密度为每立毫米10n个，将此换算为每毫升的细菌数量，则需乘以10000，因此1个大方格内细菌平均数是多少，则细菌的密度就是每毫升多少万个。
产酸活力及发酵酸度检验方法活菌总数检验方法
产酸活力及发酵酸度检验方法活菌总数检验方法1.实验材料和仪器-pH计-电热水浴器-试管、培养皿和培养基-乳酸菌培养物2.培养基配制-将适量的培养基加入适量的蒸馏水中，混合均匀。
-蒸煮20分钟，冷却到适宜的温度。
-转移到试管或培养皿中。
3.显微观察-取一个培养基试管，将待检测菌株接种到培养基中。
-用无菌技术操作，将试管放入电热水浴中，保持在适宜的温度下。
-在一定时间间隔内，取出试管，用显微镜观察菌株的酸化能力和酸度水平。
4.酸度测定-取一定量的培养基，用pH计测定其初始酸度。
-将菌株接种到培养基中，培养一定的时间。
-每隔一段时间，取一定量的培养基，用pH计测定培养基的酸度变化。
5.数据分析-根据测定的酸度变化数据，计算并比较不同菌株的酸化能力。
-评估菌株的产酸活力和发酵酸度水平。
活菌总数检验是一种常用的微生物检验方法，用于确定菌群的数量和活性水平。
这种方法通常用于食品和医药行业，以评估产品的卫生质量和稳定性。
1.实验材料和仪器-培养基-试管和培养皿-灭菌的吸铬棒或其他工具-电热灭菌器-pH计或比色计2.培养基配制-根据需要，选择适合的培养基，如平板培养基、液体培养基或加入一些选择性物质的培养基。
-按照制定的方案和菌株需求配制培养基。
3.样品处理-将待测样品进行适当的处理，如加热、稀释等。
-可以根据需要，将样品分成不同部分，进行不同的处理。
4.培养和计数-将准备好的培养基加入试管或培养皿中。
-将样品分配到培养基中，用吸铬棒均匀涂布。
-将培养皿密封好，预培养一段时间。
-在一定的时间后，观察并计数菌落的数量。
-根据计数的结果，计算样品中活菌的总数。
5.数据分析-根据计数结果，计算并比较不同样品中的活菌总数。
-评估样品的卫生质量和稳定性。
总结产酸活力及发酵酸度检验方法和活菌总数检验方法是常用的微生物检验方法，用于评估菌株酸化能力和样品中活菌的数量。
这些方法对于食品和饮料工业以及医药行业中产品质量的评估非常重要。
细菌计数简述
细菌计数【目的要求】1、掌握倾注培养法、活菌计数法和光电比浊计数法。
2、熟悉菌落形成单位（cfu）含义。
【器材和试剂】1、器材无菌平皿（直径90mm）、孵育箱、水浴箱、菌落计数仪、无菌刻度吸管、灭菌空试管、坐标纸。
2、培养基普通营养琼脂（每支15ml）、液体培养基。
3、其他待检样品，如饮用水、饮料、食品、药品、化妆品等。
【步骤和方法】1、倾注培养和活菌计数（1）按食品微生物学检验和医药化妆品检验国家标准（GB）的要求处理样品，如固体标本用无菌研钵研碎制成匀浆、油脂类物品用分散剂Tween-80、医药标本宜加入消除药物作用的中和剂等。
所有操作过程必须严格无菌，防止污染。
（2）将标本用无菌生理盐水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5梯度稀释。
（3）取不同稀释度液体1ml注于直径90mm的无菌平皿，迅速加入已熔化并冷却至50℃的营养琼脂15ml，立即在平面上向同一方向平稳转动，使之混匀，待凝固后翻转平板。
一个稀释度接种两个平板。
（4）置35℃孵育18~24h，计数菌落形成单位（colony forming unit，cfu），求出每毫升或每克标本中所含活菌数。
1ml标本中活菌数=全平板cfu×稀释倍数（5）菌落计数方法：1）平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要使用放大镜检查，以防遗漏。
记下各平板上的菌落数后，应求出同一稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。
2）在求同一稀释度的平均数时，若其中一个平板有较大片状菌落时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。
3）若片状菌落不足平板一半，而其余一半中菌落数分布均匀，则计数后乘2代表全平板菌落数，然后再求该稀释度的平均菌落数。
（6）不同稀释度平均菌落数的确认：1）平均菌落数在30~300之间：①若两个稀释度的比值＜2，报告两个稀释度的平均菌落数，如表1-3-1例2；若比值≥2，应报告两个稀释度中较大菌落数者，如表1-3-1例3、例4.②当只有一个稀释度的平均菌落数在30~300之间时，即以该平均菌落数乘以稀释倍数报告之，如表1-3-1例1。
有效活菌数的测定方法_允许差与判定_李元芳
技术讲座 有效活菌数的测定方法、允许差与判定 李元芳 (农业部微生物肥料质检中心 北京 100081)摘 要 微生物肥料的有效活菌的数量是微生物肥料质量好坏的关键指标。
根据N Y 227-94微生物肥料标准的规定,有效活菌数用平板计数法测定。
该文就平板计数法规范化操作的有关规定作了说明。
又对测定平板上菌落允许差、计算公式及判定规则进行了介绍。
该文有较强的可操作性,对工厂企业按标准提高自检的准确性有重要的参考价值。
关键词 微生物肥料 有效活菌数 平板计数法 允许差 判定 施用微生物肥料,就是把大量有益微生物施入到农作物根际土壤中,并通过它们的活动来提高土壤肥力,刺激作物生长和抑制有害微生物的活动。
因此,1994年公布的NY227-94微生物肥料标准,再次以法制形式规定有效活菌数作为微生物肥料质量的关键指标。
近几年来,我国微生物肥料发展很快,并出现一些新品种和新剂型。
但据我们从市场和厂家收集到一些经企业检测认为质量达标的微生物肥料产品,按N Y 227-94有效活菌数的测定方法进行了检测,有相当一部分产品的有效活菌数达不到标准的要求。
据调查,目前尚有的工厂,仅用血球计数板或显微镜计数法进行样品有效活菌数的测定,这种方法虽然快捷,但有一定局限性,不易区别细菌的细胞和有机颗粒,特别是不能区分活菌或死菌,结果往往使计数量偏高;有的工厂虽也用了菌落平板记数法,但方法不规范,如不设3个稀释度或3个稀释度不成梯度,或菌落不做显微镜观察确认,或平板重复数不做统计分析,只要是平板上出现了菌落就记数计算,如稀释至10-8次平板上出现了一个菌落,就折算成每克样品有1亿个菌,这样的计数结果误差很大,不能反映样品中的实际活菌含量。
为了贯彻执行N Y227-94微生物肥料标准,强化标准意识,加强产品质量标准及检验规范化仍很必要。
本文将有效活菌数的测定方法、允许差与判定的有关规定加以说明。
1 有效活菌数的测定采用平板计数法测定有效活菌数,测定时采样不少于500g ,从中称取10.0g ,加入带玻璃珠的100ml 的无菌水中(液体菌剂取10ml 加入到90ml 的无菌水中),静置20min 后,在旋转式摇床上200r /min 上充分振荡30min ,即制成母液菌悬液。
简要概括菌落总数检验过程
简要概括菌落总数检验过程
菌落总数检验过程主要包括以下步骤：
采样与稀释：首先进行采样，然后对样品进行十倍梯度稀释，得到系列浓度梯度的待检液。
接种：取适宜浓度的待检液1ml，注入培养皿后再倾注降温的卵磷脂-吐温80营养琼脂，同时做空白对照，然后转动培养皿使其混匀。
培养：待培养基冷却后，将平板倒置，置于36°±1°C培养箱内培养48h±2h。
注意不同产品可能需要不同的培养时间和温度。
计数与报告：培养完成后，选择平均菌落数在30~300之间的平皿进行计数。
报告单位为CFU/g或CFU/mL。
如果菌落数不在这个范围内，需要进行适当的稀释或浓缩后再进行计数。
请注意，整个过程需要在无菌环境下进行，并且从采样到倾注最后一个平皿所用的时间不宜超过20min，以防止细菌繁殖影响结果。
同时，为了确保结果的准确性，建议进行多次重复实验。
统计活菌数目的方法
统计活菌数目的方法
统计活菌数目是微生物学研究中的一项重要工作，它可以帮助
我们了解微生物在不同环境条件下的生长繁殖情况，为我们提供科
学依据，指导我们进行微生物的应用和管理。
下面将介绍几种常用
的统计活菌数目的方法。
首先，最常见的方法是平板计数法。
平板计数法是通过将待测
样品均匀涂布在琼脂平板上，然后进行培养，最后根据菌落的形成
情况来进行统计。
这种方法简单易行，可以直接得到微生物的数量，是实验室中常用的一种方法。
其次，滤膜法也是一种常用的统计活菌数目的方法。
滤膜法是
将待测样品过滤到滤膜上，然后将滤膜放置在含有适宜培养基的琼
脂平板上进行培养，最后进行菌落计数。
这种方法适用于含有大量
微生物的样品，可以避免样品中微生物的聚集现象，得到更加准确
的结果。
另外，流式细胞术也是一种现代化的统计活菌数目的方法。
流
式细胞术是通过将待测样品中的微生物染色，然后通过流式细胞仪
进行检测，最后得到微生物数量的统计结果。
这种方法操作简便，
速度快，可以对微生物进行快速准确的检测，适用于大批量样品的统计。
除了上述方法外，还有一些其他的统计活菌数目的方法，如膜过滤法、MPN法等。
这些方法各有特点，可以根据具体的实验要求和样品特点进行选择。
综上所述，统计活菌数目的方法有很多种，每种方法都有其适用的范围和特点。
在进行微生物统计工作时，我们应该根据具体的实验要求和样品特点，选择合适的方法进行统计，以保证结果的准确性和可靠性。
希望本文介绍的方法对大家有所帮助，谢谢阅读！。
细菌计数方法
细菌计数1.计数器测定法：即用血细胞计数器进行计数。
取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。
由于计数室的容积是一定的，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。
本法简便易行，可立即得出结果。
本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。
2、电子计数器计数法:电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。
该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。
因此，要求菌悬液中不含任何碎片。
3、活细胞计数法常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。
取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。
此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。
使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。
广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。
4、比浊法比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。
细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。
此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。
5、测定细胞重量法此法分为湿重法和干重法。
湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。
此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。
简述一种活菌计数方法
简述一种活菌计数方法引言活菌计数是一种常用的微生物实验技术，用于定量检测样品中活着的微生物细胞数量。
活菌计数方法的选择和实施对于食品、医药、环境和农产品等领域的微生物研究和质量控制至关重要。
本文将简要介绍一种常见的活菌计数方法，并对其原理和步骤进行说明。
原理一种常见的活菌计数方法是平板计数法，也称为表面计数法。
该方法基于假设，即每一个菌落抱有着一个活细菌。
该方法的核心步骤是将待测菌液均匀地涂布在培养基平板表面上，经过一定时间后，观察并计数菌落的数量。
计数结果可以通过菌落形态和颜色进行初步鉴定，进一步鉴定需要进行镜检、荧光检测以及生化试验等。
实施步骤以下是平板计数法的一般实施步骤：1. 准备培养基根据待测微生物的特性和需求，选择合适的培养基。
一般情况下，常用的培养基包括琼脂培养基、牛肉膏和肉汤等。
2. 涂布培养基使用酒精灯或火种，将培养皿和不锈钢镊子进行消毒。
取出培养皿，将待测菌液均匀地涂布在培养基平板表面上。
可以使用吸管、针筒或震荡器等工具来实现均匀涂布，确保菌液分布均匀、培养基平整。
3. 培养将涂布好的培养基放置在适宜的温度和湿度下，让细菌进行生长。
通常情况下，细菌培养需要在恒温培养箱内进行，温度和时间根据目标菌株的特性选择。
4. 计数经过一段时间，通常为24-48小时，观察培养皿表面的菌落。
使用放大镜、计数器或计数盘等工具，对菌落进行计数。
注意避免重复计数和遗漏计数，以提高准确性。
5. 数据分析根据计数结果，可以计算得到待测样品中的活菌数。
通过统计学方法，可以计算出可信的活菌数量区间，以反映样品中的微生物负载水平。
结论平板计数法是一种常见且易于实施的活菌计数方法。
该方法在微生物研究和质量控制中具有广泛应用，可用于食品安全、医药研发、环境监测等领域。
但该方法也存在一些局限性，例如不适用于复杂样品的计数（如含有大量细菌的食品），以及可能导致细菌聚集和均匀性差异等问题。
因此，在实践中，需要根据具体情况选择合适的活菌计数方法，并结合其他技术手段进行验证和补充，以得到准确可靠的活菌计数结果。
微生物检测菌落总数测定方法
微生物学检验菌落总数的测定1 原理微生物活体数量的测定方法，常用平板培养计数法。
它是通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液，再取一定的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克（或mL ）样品中的活菌数量。
2 材料和仪器2.1 平皿：φ90mm 。
2.2 无菌锥形瓶：容量250mL ，500 mL 。
2.3 无菌吸管：1mL （具0.01mL 个度）,10mL （具0.1mL 刻度）或微量移液器及吸头。
2.4 灭菌锅。
2.5 恒温培养箱2.6 涂棒。
2.7 酒精灯。
2.8 超净工作台。
2.9 磁力搅拌器。
2.10 漩涡振荡器3 检验程序菌落总数的检验程序见下图。
方法①↙ ↘方法②↘ ↙4 操作步骤4.1 培养基和试剂的配制4.1.1 平板计数琼脂培养基：LB培养基（最常用）牛肉膏5g蛋白胨10g氯化钠5g琼脂20g蒸馏水1LpH 7.0～7.2将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值，分装锥形瓶中，121℃高压灭菌30分钟。
4.1.2 无菌生理盐水的配制：称取8.5g氯化钠溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌30分钟。
4.2 样品的稀释：4.2.1 固体样品：称取10g固体样品置于盛有90mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中（内装数粒无菌玻璃珠），在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，制成1：10的样品均液，即10-1稀释液。
4.2.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品均液1mL（吸取前需要摇匀1：10稀释液），缓慢加入盛有9mL无菌生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不能触及稀释液面），用漩涡振荡器振荡，混合均匀，制成1：100的样品稀释均液。
4.2.3按照4.2.2操作程序，制备10倍系列样品稀释液，每递增稀释一次，换用一次1mL无菌吸管或吸头。
4.2.4 根据对样品活菌数量的估计，选择3~4个适宜稀释度的样品均液（比如10-6，10-7，10-8，10-9稀释液）。
菌落总数检验操作规程
菌落总数检验操作规程目的：该操作规程用于规范公司产品及原料的活菌数量检验操作。
范围：该操作规程适用于公司要求检查该项的产品和原料的菌落总数检验责任人：微生物检验员，QC主管内容：1 技术依据及原理菌落总数计数采用平板菌落计数法，这是活菌计数方法之一。
该方法以在琼脂平板上，样品经过处理在一定条件下培养后，所得1ml（或1g）检样中形成菌落的总数。
测定结果只反映在规定条件下，只包括一群在平板计数琼脂生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。
在进行本法测定时，必须严格按本法规定的条件操作，以免产生实验误差。
2 材料、仪器、试剂的准备及基本要求2.1 无菌室2.1.1 结构和要求无菌室面积不超过10m2，高度不超过2.4m，应采光良好、避免潮湿、远离厕所所及污染区，有缓冲间（2个）、操作间组成。
操作间与缓冲间之间应有样品传递窗（箱），出入操作间和缓冲间的门不应直对。
无菌室应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。
墙与地面及墙壁、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。
操作间内不得安装下水道。
无菌室照明灯应嵌装在天花板内，室内光照分布均匀，光照度不低于300勒克斯。
缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯（2～2.5W/m3）, 紫外线杀菌灯距实验台面高度不超过1 m，并定期检查其辐射强度，辐射强度不低于70µW·cm-2（1 m距离），不符合要求的紫外线杀菌灯应即使更换。
2.1.2 温度、湿度无菌室内温度和相对湿度直接影响紫外线杀菌灯的杀菌效果，故应控制温度18～26℃，相对湿度40～60%。
操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，压差不低于4.9Pa。
2.1.3 操作间操作间应安装空气除菌过滤层流装置。
洁净度应不低于10000级，局部净化度100级，或放置同等级净化工作台，并准备药物天平，乙醇灯、打火机、大小橡皮乳头等。
2.1.4 缓冲间缓冲间应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。
实验一酸奶中乳酸菌总活菌数的检验
实验一酸奶中乳酸菌总活菌数的检验一、实验目的（一）学习酸奶中乳酸菌的组成，以及储藏条件对酸乳中乳酸菌总活菌数的影响。
通过对酸奶中乳酸菌总活菌数的检测，包括培养基的制备，样品的处理，梯度稀释样品和倒平板等内容，综合训练食品卫生检验的基本技能。
（二）掌握酸奶中乳酸菌总活菌数的检测方法。
二、实验原理活性酸奶需要控制各种乳酸菌的比例，有些国家将乳酸菌的活菌数含量作为区分产品品种和质量的依据。
由于乳酸菌对营养有复杂的要求，生长需要碳水化合物、氨基酸、肽类、脂肪酸、酯类、核酸衍生物、维生素和矿物质等，一般的肉汤培养基难以满足其要求。
测定乳酸菌时必须尽量将试样中所有活的乳酸菌检测出来。
要提高检出率，关键是选用特定良好的培养基。
采用稀释平板菌落计数法，检测酸奶中的各种乳酸菌可获得满意的结果。
三、实验器材生化培养箱、恒温水浴锅、超净工作台、微量移液器（1mL、100μL）、高压蒸汽灭菌锅、酸度计、天平、酒精灯、三角瓶、烧杯、量筒、培养皿、试管（20-30mL）四、实验试剂蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、K2HPO4、柠檬酸二铵、乙酸钠、葡萄糖、蒸馏水、吐温80、NaCl 五、实验内容（一）操作步骤酸奶→稀释→制平板→培养→检查计数（二）配制生理盐水生理盐水（0.9%）：称取0.9克NaCl，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100mL，121℃高压灭菌15min，备用。
（三）培养基的配置按照MRS固体培养基的配方（见表1）称取相应的试剂于烧杯或三角瓶中，加少量蒸馏水溶解后，用量筒定容至相应刻度，分装于小三角瓶中，用高压灭菌锅121℃高压灭菌15min。
灭菌完后，将其至于60℃的恒温水浴箱中，备用。
表1 1000mLMRS培养基配方（四）酸奶样品的稀释、制平板1.样品选择酸奶样品分两类，一类是室温放置一周的酸奶，一类是4℃存放的酸奶。
对两类酸奶的样品处理均一致。
2.样品稀释先将酸奶样品搅拌均匀，用移液器取1mL酸奶样品于9mL的灭菌生理盐水试管中，充分摇匀，务必使样品均匀分散，即为10-1的样品稀释液，连续稀释至10-9。
乳酸菌活菌数量检测方法--菌落计数法
乳酸菌活菌数量检测方法--菌落计数法本方法适用于乳酸菌制剂及配合饲料中有效活菌数和杂菌率的测定。
按照国家标准GB/T 14699.1进行抽样，获得样品200g，分装于两个无菌、干燥的玻璃瓶中，贴上标签，注明产品名称、批号、取样日期等信息。
一瓶供检验用，一瓶密封保，以备复查。
一、测定原理：乳酸肠球菌用肠球菌琼脂培养基，杂菌用营养琼脂培养基；培养后利用平板菌落计数法进行计数。
二、培养基与缓冲液配方：（1）营养琼脂培养基，每L蛋白胨 10.0g 牛肉膏 3.0g 氯化钠 5.0g 琼脂 18.0g 水稀释至1000ml PH 7.0~7.4（2）肠球菌琼脂培养基，每L蛋白胨 20.0g蔗糖 5.0g 葡萄糖 5.0g 乳糖 5.0g 酵母膏 5.0g氯化钠 4.0g 乙酸钠 1.5gVc 0.5g 琼脂 17.0g 水稀释至1000mlPH 6.5~7.0（3）PH6.8磷酸缓冲液配制方法取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀即得。
三、样品处理：（1）乳酸菌纯品制剂样品测定乳酸菌纯品制剂时，取样量为1g，溶解到100ml缓冲液中，缓冲液与样品的比例为100:1。
（2）配合饲料样品测定饲料样品时，取样量为25g，溶解到225ml缓冲液中，缓冲液与样品的比例为10:1。
四、有效活菌数、杂菌数的测定：（1）本方法采用平板菌落计数法（2）操作方法：1．取磁力搅拌棒装入500ml三角瓶中，再量225ml PH6.8的磷酸缓冲液一并装入三角瓶中灭菌备用。
纯品制剂量取缓冲液100ml。
2．取25g饲料样品放入三角瓶中，在磁力搅拌器中震荡混匀5min后，再放到摇床上37℃，150转/分，充分震荡45min，混匀成1：10稀释液。
纯品制剂样品量为1g，混匀成1：100稀释液。
3．在超净工作台内用灭菌的1.5ml离心管，按10倍比稀释法稀释。
用移液器吸取上述混悬液100ul，注入含有900ul缓冲液的离心管内，并在液体中反复吹打5次，在漩涡振荡器上震荡30s混匀（注意每次稀释时更换枪头及充分震荡混匀）。
细菌计数方法
细菌计数1、计数器测定法:即用血细胞计数器进行计数。
取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内,用显微镜观察计数。
由于计数室的容积就是一定的(O、1mm3),因而根据计数器刻度内的细菌数,可计算样品中的含菌数。
本法简便易行,可立即得出结果。
本法不仅适于细菌计数,也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。
2、电子计数器计数法:电子计数器的工作原理就是测定小孔中液体的电阻变化,小孔仅能通过一个细胞,当一个细胞通过这个小孔时,电阻明显增加,形成一个脉冲,自动记录在电子记录装置上。
该法测定结果较准确,但它只识别颗粒大小,而不能区分就是否为细菌。
因此,要求菌悬液中不含任何碎片。
3、活细胞计数法常用的有平板菌落计数法,就是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。
取一定容量的菌悬液,作一系列的倍比稀释,然后将定量的稀释液进行平板培养,根据培养出的菌落数,可算出培养物中的活菌数。
此法灵敏度高,就是一种检测污染活菌数的方法,也就是目前国际上许多国家所采用的方法。
使用该法应注意:①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数,过多或过少均不准确;②为了防止菌落蔓延,影响计数,可在培养基中加入O.001％2,3,5一氯化三苯基四氮唑(TTC);③本法限用于形成菌落的微生物。
广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验,就是最常用的活菌计数法。
4、比浊法比浊法就是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。
细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比,与光密度成正比,所以,可用光电比色计测定菌液,用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。
此法简便快捷,但只能检测含有大量细菌的悬浮液,得出相对的细菌数目,对颜色太深的样品,不能用此法测定。
5、测定细胞重量法此法分为湿重法与干重法。
湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重;干重法系单位体积培养物经离心后,以清水洗净放人干燥器加热烘干,使之失去水分然后称重。
此法适于菌体浓度较高的样品,就是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。
生物产品中粪肠球菌活菌数的检验
粪肠球菌活菌数的检测1、设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。
1.1恒温培养箱和恒温厌氧培养箱：37℃±1℃。
1.2冰箱：2℃～5℃。
1.3天平：感量为0.1g。
1.4均质器及无菌均质袋、均质杯。
1.5振荡器。
1.6无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
1.7无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。
1.8无菌培养皿：直径90mm。
1.9显微镜：10倍～100倍。
1.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2、培养基和试剂2.1 KF链球菌琼脂培养基2.1.1 KF链球菌琼脂培养基成分月示蛋白胨10.0g 麦芽糖20.0g 酵母浸膏10.0g 甘油磷酸钠10.0g 氯化钠5.0g 乳糖1.0g 琼脂13.0g 溴甲酚紫0.015g叠氮化钠0.4g 2，3，5-氯化三苯四氮唑 0.1g 蒸馏水1000mL2.1.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL，于25℃时调节pH至7.2±0.2，分装于适宜容器中，煮沸5min，冷至50℃左右，倾入无菌平皿，备用。
2.2肠球菌肉汤2.2.1肠球菌肉汤成分蛋白胨17.0g 牛肉浸膏3.0g 酵母浸膏5.0g 牛胆粉10.0g氯化钠5.0g 柠檬酸钠1.0g 七叶苷1.0g 柠檬酸铁铵0.5g叠氮化钠0.25g 蒸馏水1000mL2.2.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL，于25℃时调节pH至7.1±0.2，分装于适宜容器中，121℃灭菌30min。
2.3无菌生理盐水2.3.1成分氯化钠8.5g 蒸馏水1000mL2.3.2制法称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
2.4 革兰氏染色2.4.1结晶紫染色液2.4.1.1 成分结晶紫1g 95%乙醇20 mL 1%草酸铵水溶液80 mL2.4.1.2制法将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
实验1.细菌总菌落数的测定
六、说明
为了保证实验结果能准确反映被检样品的真实情 况，检验时必须注意以下一些要求和规定： （1）检验中所用的所有器具都必须洗净、烘干、灭 菌，即不能存在活菌，也不能残留有抑菌物质。 （2） 应注意采样的代表性，如系固体样品，取样 时不应集中在一点，宜多采几个部位。固体检样 在加入稀释液后，最好置于均质器中，以800～ 在加入稀释液后，最好置于均质器中，以800～ 1000r/min的速度处理1min，以获得均匀的稀释 1000r/min的速度处理1min，以获得均匀的稀释 液。
（3）为减少样品在稀释时造成的误差，在连续递次稀释时， 每个稀释液应充分振荡，使其均匀（最好采用漩涡混合 器），同时每变化1个稀释倍数应更换1 器），同时每变化1个稀释倍数应更换1支吸管。在进行 连续稀释时，应使吸管内的液体沿壁流入生理盐水中， 勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部附着的检液 溶于其内，造成误差。 （4）样品稀释液大多采用生理盐水，有时也用磷酸缓冲液 或0.1﹪的蛋白胨水。如果检样的含盐较高（如酱制品）， 0.1﹪ 稀释液也可采用无菌蒸馏水。用做样品稀释的液体，每 批都要做空白催找，以判断培养基、培养皿、吸管及空 气可能存在的污染。
（5）为了控制培养基的硬度适合细菌的生长，琼脂 含量选为1.5﹪ 含量选为1.5﹪。为了便于操作，有时在灭菌前， 就把培养基分装到不同的试管内，一般1 就把培养基分装到不同的试管内，一般1支试管 内的分装量是15ml营养琼脂底部带有沉淀的部 内的分装量是15ml营养琼脂底部带有沉淀的部 分应弃去，以免与菌落混淆而影响观察计数。 （6）为使菌落能在平板上均匀分布，将检液加入平 皿后，应在20min内倾入培养基并旋转混匀。可 皿后，应在20min内倾入培养基并旋转混匀。可 将平皿放在平面上，先前后左右地摆动，然后 按顺、逆时针的方向转动。混合时应多加小心， 不要使其溅到皿边和皿盖上。
细菌计数方法
细菌计数-基本资料细菌计数counting of bacteria 指测计酵母、细菌等的细胞数。
有总菌计数和活菌计数两种计数法。
后者是测计试样中的活细菌数。
二者都是先把试样稀释成适于测计的浓度，再用种种方法进行细胞数的测计。
一般认为用细胞计数器测计更为精确。
有的方法是把细胞用血球容量计进行离心沉淀，从其刻度的容积进行换算；还有一种方法是比浊法。
在测计固氮细菌时，可用凯氏定氮法测定有机氮（或是蛋白态氮），然后换算成细菌数。
进行活菌计数时，先把样品稀释，然后将一定量稀释样品混入依菌性质制成的溶融状态的琼脂培养基中进行平面培养，再根据菌落数进行统计。
对已鉴别过的菌种或具有某种特定性质的细菌来说，活菌计数比较简单，但对土壤微生物区系量的分析就比较复杂了。
细菌计数-各种计数1、计数器测定法即用血细胞计数器进行计数。
取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。
由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。
本法简便易行，可立即得出结果。
本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。
2、电子计数器计数法电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。
该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。
因此，要求菌悬液中不含任何碎片。
3、活细胞计数法常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。
取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。
此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。
使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。
产酸活力及发酵酸度检验方法活菌总数检验方法
产酸活力及发酵酸度检验方法活菌总数检验方法产酸活力是指其中一种微生物在特定条件下产生酸的能力。
这个能力主要与微生物代谢产物中的有机酸有关，包括乳酸、醋酸、丙酮酸等。
产酸活力的检验方法可以通过以下步骤进行：1.微生物培养：将待检测微生物接种到含有特定培养基的培养基中，根据所需的酸度和产酸菌的特性选择适宜的培养基。
培养条件包括温度、pH值、氧气浓度等。
2.培养基酸度调节：根据需测定的酸度范围，调整培养基的初始pH 值。
通常情况下，酸度的测定范围是从3.5-5.0之间。
3. 培养基平板接种：将经过培养的微生物涂布在含有酸度指示剂的培养基平板上，用细细的光洁锥取一次菌体，在平板上画一条10mm宽的线。
然后在培养箱中进行培养。
4.酸度检测：根据培养时间的不同，酸度指示剂会有不同程度的变化。
通常情况下，培养24小时后使用酸度计进行测定。
将酸度计放在液体培养基上方，记录酸度计显示的酸度指示剂值。
5.酸度分析：根据酸度指示剂的不同颜色来确定培养物产酸活力的强弱。
颜色越浅表示酸度越低，颜色越深表示酸度越高。
根据标准曲线确定具体的酸度值。
活菌总数是指其中一种微生物在其中一样本中存活的菌落数量。
活菌总数检验方法主要有以下几种：1.平板计数法：将待检测样品经稀释后接种在含有营养培养基的平板上，将样品均匀涂布在平板上，然后在适宜的温度下进行培养。
培养一段时间后，对每个培养基进行菌落计数，将每个培养基上的菌落数量相加即可得到活菌总数。
2.膜过滤法：将待检测样品通过0.45微米的滤膜，然后将滤膜放在含有营养培养基的平板上进行培养。
培养一段时间后，对每个平板上的菌落进行计数，将每个平板上的菌落数量相加即可得到活菌总数。
3.表面播种法：将待检测样品直接涂布在含有营养培养基的平板上，然后在适宜的温度下进行培养。
培养一段时间后，对每个平板上的菌落进行计数，将每个平板上的菌落数量相加即可得到活菌总数。
4.量法：使用涂布法将待检测样品涂布在传统的涂片上，然后使用显微镜对涂片上的菌落进行计数。
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3.2.5用无菌刻度吸管从 管内吸取1ml混匀后的菌液样本，加至 管内。
3.2.6将 管依照前面方法在手掌上用力振敲80次混匀，再吸取出1ml加入 管内，依照此方法，直至最后一管。
3.2.7选择适稀释度试管，以吸取其中混合均匀的菌液1ml加入无菌平皿中，每一稀释度接种3个平皿，需接种3个不同稀释度，平皿加样前，应先按组编号，以免弄混。
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3.3.3到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0~4℃，但不得超过24小时。
3.3.4计数时应选取菌落数在30~300之间的平板。
3.3.4.1若有两个稀释度均在30~300之间时，应以二者的比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）决定，比值小于或等于2时，以两个稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；当出现比值大于5时或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查。
3.2.8将冷至40℃～45℃的熔化营养基倒入已加入样液的平皿中，每平皿15～20ml。
3.2.9将平皿盖好立刻轻轻摇动均匀，平放于台上，待琼脂凝固后，翻转平皿，使底朝上，置35±2℃恒温箱内培养。
3.3观察、计数和报告
3.3.1每日观察细菌生长情况，培养至48小时计算最终结果的菌落数。
3.3.2培养到时间后，计数每个平板上的菌落数，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏，在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算出原始样品中每片中的菌落数，进行报告。
3.3.4.2若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则取最低稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告。
3.3.4.3若所有稀释度的平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
3.3.5若所有稀释度的平板菌落数均不在30~300之间，其中一部分小于30或大于300时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
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1．目的
规范及指导生物指示剂（枯草芽孢杆菌菌片）样本中含有的活菌数量的测定。
2．适用范围
适用于菌片活菌数确认。
3．内容
3.1仪器设备
净化工作台、恒温培养箱、刻度吸管(1ml)、PBS(磷酸盐缓冲液)、琼脂培养基
3.2操作步骤
3.2.1每批菌片抽取8个菌片样品试验。
3.3.6若阴性对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
3.3.7菌落总数的报告以10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
3.3.审核：
日期：
批准：
日期：
3.2.2按要求对检验操作用具进行制备及灭菌，以下操作严格按无菌要求进行。
3.2.3将菌片投入10.0ml PBS无菌试管中，每管一份样品，然后在手掌上用力振敲80次，将菌洗下形成1:10的菌液，作为 管。
3.2.4按稀释级别（次数）需要，准备相应数量的试管，将试管分别排列在试管架上，每管加入9ml PBS，从左到右在试管上标上序号。