丁酸梭菌C_2菌株对鱼类肠道致病菌体外抑制作用研究

收稿日期:2006-12-11基金项目:浙江省重大科技攻关课题(2004201)通讯作者:吴天星,E -mail:wutx@tianbang .com作者简介:宋增福,1971年生,男,山东蒙阴人,博士,主要从事动物微生态与水产病害防治研究。

丁酸梭菌C 2菌株对鱼类肠道致病菌体外抑制作用研究宋增福1,2,吴天星1,宋会仪3(1浙江大学化学系,杭州　310027;2上海水产大学生命学院　200090;3浙江大学动物学院,杭州　310029)摘要:以枯草芽孢杆菌、硫酸链霉素为对照组,以丁酸梭菌C 2菌株为试验组,运用滤纸片琼脂平板扩散法,研究了丁酸梭菌C 2菌株对鱼类肠道致病菌迟缓爱德华氏菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌的抑制作用。

研究结果表明,丁酸梭菌C 2菌株可以有效抑制这3种病原菌,并且抑制效果要明显优于硫酸链霉素。

关键词:丁酸梭菌;抑菌作用;鱼类肠道致病菌中图分类号:S942.3 文献标识码:A 文章编号:1003-1278(2007)03-0100-02 随着我国水产养殖业的快速发展,水产病害已经成为限制水产业进一步发展的瓶颈因素,而长期使用抗生素和化学药物防治水产病害,会增加药残和病原的耐药性,直接危及到人类健康和生存环境。

因此,控制水产养殖疾病就迫切需要高效无污染、无毒副作用的替代药品,减少甚至禁止使用抗生素。

现代微生态学研究表明,益生菌(Pr obi otics )是一种能够改善宿主肠道菌群平衡并对其有益的微生物,饲料中添加益生菌不仅能避免抗生素的副作用,达到防病治病的效果,而且能促进动物生长。

因此,在现代生产条件下,水产益生菌的研究和开发受到重视,益生菌应用技术获得了前所未有的发展机会。

丁酸梭菌自从被日本研究人员发现以来,一直作为防治肠炎的药物在临床上得到应用,尤其是在日本、韩国等东南亚国家。

丁酸梭菌可以形成芽孢,具有耐高温、耐酸、耐盐和耐挤压等特性,在制粒过程和酸性的动物肠道环境中均能保持高度的稳定性。

试验研究还表明,丁酸梭菌可以有效地抑制出血性大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、霍乱沙门氏菌、霍乱弧菌等人和动物肠道里的有害菌群[1],其抑制作用被认为是起到治疗效果的主要原因之一。

但是该菌对引起鱼肠道疾病的有关致病菌是否有抑制作用,至今没有见到相关报道。

本研究目的是探讨丁酸梭菌C 2菌株对鱼肠道致病菌迟缓爱德华氏菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌的抑制作用,为该菌作为水产类新兽药的研制和开发提供基本数据。

1　材料和方法1.1　实验设计实验设丁酸梭菌C 2为试验组,枯草芽孢杆菌和硫酸链霉素为对照组;每组分迟缓爱德华氏菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌3个处理,每个处理3个重复。

在12、18、24、36、48h 测定各实验组抑菌圈直径。

1.2　材料1.2.1　菌种　丁酸梭菌C 2菌株由浙江大学宁波理工学院分子设计与营养工程实验室保存;迟缓爱德华氏菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌由上海水产大学农业部渔业动植物病源库提供;枯草芽孢杆菌由无锡阿尔保尔生物工程有限公司提供。

1.2.2　培养基　丁酸梭菌培养基:葡萄糖1g,胰蛋白胨1g,酵母粉0.5g,牛肉浸膏0.3g,硫酸铵0.1g,硫酸锰0102g,硫酸镁0.05g,碳酸钙0.1g,氯化钠0.2g,磷酸氢二钾0.4g,水100g,琼脂2g 。

致病菌与枯草芽孢杆菌的培养基为牛肉膏蛋白胨营养培养基,调节pH 值为6.9～716。

1.2.3　主要仪器和设备　医用超净工作台、电热恒温培养箱、自动pH 测定仪、电子天平、电热高压灭菌锅、显微镜、冰箱、培养皿、吸管、试管、烧杯、三角瓶、量筒、酒精灯、滤纸片、二氧化碳厌氧工作站等。

1.3　方法1.3.1　丁酸梭菌的活化　丁酸梭菌的冻干粉接种于装有液体培养基的小三角瓶,装量90mL,耐热薄膜塑料封口,28℃静止厌氧培养24h,然后转接小三角瓶,接种量为10%。

1.3.2　致病菌和芽孢杆菌的活化　嗜水气单胞菌、鳗弧菌、迟缓爱德华氏菌和芽孢杆菌接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的小三角瓶,装量90mL,耐热薄膜塑料封口,电热恒温箱28℃培养24h,然后转接小三角瓶,接种量为10%。

1.3.3　丁酸梭菌的抑菌作用　参考吴惠仙[2]采用滤纸片琼脂平板扩散法进行,稍作修改。

将丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌活化后,初始接种密度为1.0×108/mL,24h 后稀释各菌液至1.0×109/mL 。

同时,活化摇床培养嗜水气单胞菌、鳗弧菌和迟缓爱德华氏菌,16h 后接种已活化的密度为1.0×109/mL 的各致病菌株0.1mL 到各平皿涂布,并置入含有丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌培养物及硫酸链霉素(1000I U /mL )的药敏试纸进行拮抗实验。

测定前,首先将直径7.2mm 的无菌滤纸片浸没于丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌培养液及硫酸链霉素(1000I U /mL )的溶液中3m in 后贴片。

在28℃培养12、18、24、36、48h 测量抑菌圈直径,每个平皿设3个重复。

1.4　数据统计・001・(总第151期) 水　利　渔　业 2007年第27卷第3期实验数据以平均值±标准差(Mean ±S D )表示,采用M icr os oft Excel 2003处理硫酸链霉素组数据,用t 检验进行显著性检验;用SPSS10.0(US A )处理丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌组,最小显著极差法(LS D )进行显著性的比较。

显著水平均设为α=0.05。

2　结果2.1　丁酸梭菌C 2、枯草芽孢杆菌和硫酸链霉素的抑制作用对致病菌抑制实验结果见图1～图3。

丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌对迟缓爱德华氏菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌都有抑制作用,而硫酸链霉素对迟缓爱德华氏菌没有抑制作用。

在12、18、24、36、48h 5个时间段中,丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌对迟缓爱德华氏菌的抑制作用差异不显著(P >0.05);在12、18、24h 3个时间段里,丁酸梭菌对鳗弧菌的抑制作用大于枯草芽孢杆菌(P <0.05),但是从36h 起两者对鳗弧菌的抑制作用差异不显著。

丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌对嗜水气单胞菌的抑制作用没有差异,而硫酸链霉素对鳗弧菌和嗜水气单胞菌的抑制作用始终低于丁酸梭菌(P<0.05)。

图1　丁酸梭菌C 2、枯草芽孢杆菌和硫酸链霉素对迟缓爱德华氏菌抑制作用图2　丁酸梭菌C 2、枯草芽孢杆菌和硫酸链霉素对鳗弧菌抑制作用2.2　丁酸梭菌C 2、枯草芽孢杆菌和硫酸链霉素抑制作用变化趋势2.2.1　丁酸梭菌C 2　图4显示,丁酸梭菌C 2对迟缓爱德华氏菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌的抑制能力随着时间的延长均呈现先上升后下降的趋势,在24h 达到高峰,随后逐步下降。

图3　丁酸梭菌C 2、枯草芽孢杆菌和硫酸链霉素对嗜水气单胞菌抑制作用图4　丁酸梭菌C 2抑制作用变化趋势2.2.2　枯草芽孢杆菌　图5可以显示枯草芽孢杆菌对迟缓爱德华氏菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌的抑制能力随着时间的延长均呈现先上升后下降的趋势,在24h 达到抑菌的高峰,随后逐步下降。

但是对迟缓爱德华氏菌的抑制作用变化比较大,而对鳗弧菌的抑制变化比较平缓。

图5　枯草芽孢杆菌抑制作用变化趋势2.2.3　硫酸链霉素　如图6所示,硫酸链霉素的抑制作用随时间基本没有变化。

3　讨论大多数水生益生菌能够抑制或者杀死周围异种有害的菌群。

目前,对益生菌抑菌的解释主要集中在以下几种观点:(1)产酸降低了pH 值,所造成的酸性环境致使病原菌无法生存;(2)产生了抗生素或者细菌素,抑制了细菌;(3)产生了过氧化氢等强氧化剂或者溶菌酶,杀死了细菌;(4)肠道内的定植占位或者营养竞争抑制了细菌的增长。

(下转第115页)美和自然美的和谐统一原则,重视旅游产品的非物质开发。

休闲垂钓旅游地的经营从某种意义上可以说是“靠天吃饭”,季节性强的特点决定了休闲垂钓旅游地的开发过程中要改变项目单一的状况,多元化经营,用多种旅游项目吸引游客。

以垂钓为主,进行综合经营,多业并举。

在以垂钓为旅游休闲活动主题进行旅游开发时应力求功能综合化,产品功能设计多样化,加强娱乐因素,加强体验经济,使产品具有较广的市场接受面,多层次与多元化,形成集休息娱乐、健身康体、文化学习、会议展示及特色观光于一体的综合性度假地,全方位地满足客人的多种需求。

应更多考虑女性和儿童游客的旅游需求,争取最大范围的游客,尽量延长旅游地生命周期。

一般男性旅游者比女性旅游者更感兴趣的是垂钓的过程,在笔者的调查过程中发现男性垂钓者的数量也远远高于女性垂钓者。

一般的垂钓地重视的都是开发垂钓爱好者这个客源市场,而忽视了一个家庭的构成中还应该包括女性和儿童。

家庭化已成为我国度假休闲旅游的一个重要特征,少年儿童是现代家庭一个重要组成部分,儿童消费市场潜力巨大,功能设计时应该对儿童进行专门市场定位,注意开发儿童游乐设施和游乐项目,以便能为其父母提供一个良好的度假环境。

不同的人因年龄、性别、经历的不同对同样的产品也会产生不同的体验,因此在产品设计中需要注意区别对待。

要建立良好的公共关系,并加强营销的力度,加大加强客源市场开发。

可采用边开发建设边宣传促销,实行滚动式发展的模式。

形成市场的途径可以通过俱乐部制或会员制。

4　结语休闲垂钓地是我国渔业结构调整过程中出现的新鲜事物,也是具有中国特色的旅游目的地形式,目前尚处在发展的初期阶段,开发历史虽不长,却出现了“遍地开花”式的发展,加强管理和研究迫在眉睫。

在调查访谈阶段,由于时间和人力、物力有限,调查的样本量也较有限,结果有一定的局限性。

如时间上,由于休闲垂钓旅游活动的季节性特点和作者时间精力有限,故一般只抽取双休日和节假日;在调查地点的选取上,由于作者当时身处湖南内陆地区,对于规则比赛型和养殖观光型以及沿海地区的垂钓地涉及得不够全面。

但本研究结果还是基本能代表内陆地区经营性垂钓地的经营状况和普通民众的需求。

(责任编辑　张俊友)(上接第101页)图6　硫酸链霉素抑制作用变化趋势丁酸梭菌抑菌机制目前比较公认的观点,是丁酸梭菌产生大量丁酸、丙酸和乙酸等短链脂肪酸,造成酸性环境,降低了pH 值,致使其它的微生物难以生存。

国内的许多研究报告已证实丁酸梭菌对大肠杆菌、沙门氏菌等常见人体肠道致病菌具有拮抗作用[1,3]。

而唐宝英等[4]研究了丁酸梭菌对动物肠道致病菌的体外拮抗作用,发现丁酸梭菌可以有效的抑制猪大肠杆菌C83902、鸡大肠杆菌C83851、鸡白痢沙门氏菌(Sal m onella gallinarum )Sg9。

本试验对鱼致病菌的研究表明,丁酸梭菌C 2菌株可以有效地抑制鱼肠道致病菌迟缓爱德华氏菌、鳗弧菌和嗜水气单胞菌,并且48h 内比硫酸链霉素抑制效果好。

随着时间的延长,丁酸梭菌C 2抑菌作用下降的趋势要比枯草芽孢杆菌的缓慢。