FDA药品审评和研究中心 (CDER)

For personal use only in study and research; not for commercial use

FDA药品审评和研究中心 (CDER)

色谱方法验证审评指南

1994.11 CMC 3

For personal use only in study and research; not for commercial use

目录

. 绪言

.色谱分类

A.高效液相色谱 (HPLC)

1.手性液相色谱

2.离子交换色谱

3.离子对/亲和色谱

4.正相色谱

5.反相色谱

6.分子排阻色谱

B.气相色谱 (GC)

C.薄层色谱 (TLC)

.参考标准

.药物及其制剂HPLC方法验证的参数

A.准确性

B.检出限和定量限

C.线性

D.精密度

1.重复性

a.进样重复性

b.分析重复性

2.组间精密度

3.重现性

E.范围

F.回收率

G.耐久性

H.供试品溶液的稳定性

I.专属性/选择性

J.系统适用性规定和试验

1.容量因子

2.精密度/进样重复性

3.相对保留时间

4.分离度

5.拖尾因子

6.理论塔板数

K.要点

.注解和结论

.致谢

.参考文献

色谱方法验证审评指南

. 绪言

本技术指南的目的是给审评人员审评验证色谱方法的, 该文件讨论色谱方法的要点和不足, 以便CDER的审评人员能够保证方法的良好性能，也使化学工作者了解为通过审评应给出的足够的信息。国际协调会议（ICH）1993年定义的分析术语，已在这一指南中运用。

色谱方法通常用于原料、药物、药物制剂和生物体液中化合物的定性和定量。涉及的成分包括手性的或非手性的药物、过程杂质、残留溶媒、附加剂如防腐剂、分解产物、从容器和密闭包装或制造过程中带入的可提取和可过滤的杂质、植物药中的农药和代谢物等。

试验方法的目的是得到可信赖的和准确的数据，无论是用于验收、出厂、稳定性或药物动力学研究。得到的数据用于药品开发或批准后的定性和定量，试验包括原料的验收、药物和药物制剂的出厂、过程检验(In- process testing)的质

量保证和失效期的建立。

方法的验证是由药品的开发者或使用者来检验其方法是否达到预期的可靠性、准确度和精密度的过程。得到的数据成为方法的验证资料的一部分交给CDER.。

方法的验证对于完成机构满足档案要求不是一次性的,开发者和使用者都应验证其方法的耐用度或耐久性（ruggedness or robustness.），其他的分析者、用其它相当的仪器，在其它的日期或地点，在药品生产期限(有效期)全过程，方法都应能够重现。如果产生数据的方法是可靠的，那么所得到的验收、出厂、稳定性或药物动力学的数据就是可信赖的。验证的过程和方法的设计应在开发过程中重要的数据产生之前，如果方法改变了，还应该再验证。

. 色谱类型

色谱是一种技术，通过该技术，样品中的组分载入液相或气相中，通过在固定相上由吸附—解吸附来完成。

A. 高效液相色谱 (HPLC)

HPLC分离是基于在样品在流动相液体和固定相之间的不同分配。一般地说HPLC大体分为以下几种(未考虑其重要性顺序)

1. 手性液相色谱

2. 离子交换色谱

3. 离子对/亲和色谱

4. 正相色谱

5. 反相色谱

6. 分子排阻色谱

1. 手性液相色谱

分离光学异构体可在手性固定相上，用衍生化试剂或在非手性固定相上用流动相添加剂形成非对对映体来实现。用作杂质试验方法时，如果光学异构体杂质在光学异构体药物之前洗脱,要增加灵敏度。

2. 离子交换色谱

分离基于荷电功能团，样品负离子(X - )为阴离子，样品正离子((X + )为阳离子，一般用pH程序洗脱。

3. 离子对/亲和色谱

分离基于与目标样品的专一的化学相互作用。更普遍的反相型用缓冲液和加入的对离子(与被分离的样品荷相反电荷)分离。分离受pH、离子强度、温度、浓度和共存的有机溶剂类型的影响。亲和色谱，一般用于大分子,使用配合体（共

价结合在固体基质上的生物活性分子)，与其同类的抗原(分析介质)反应，生成可逆转的复合物,通过改变缓冲条件洗脱。

4. 正相色谱

正相色谱为用有机溶剂为流动相和极性的固定相。此时较小极性的组分比较大极性组分更快地洗脱。

5. 反相色谱

报给CDER的最通常的实验方法是反相HPLC方法，最通常用紫外检测器。反相色谱,一种键合相的色谱技术，用水作基本溶剂,选择性也受溶剂强度、柱温和pH的影响，一般来说较大极性比较小极性组分洗脱更快。

紫外检测器可以用于所有色谱，这类检测器要注意的是灯老化后的灵敏度降低，其灵敏度因(仪器)的设计和/或者制造厂家的不同有小的变异。需要指出,用紫外检检测器和反相HPLC组合得到的色谱图不一定能真实的反映事实，原因是：

·极性比目标化合物大得多的化合物可能被掩盖(在溶剂前沿或死体积时同时洗脱)。

·极性比目标化合物小得多的化合物洗脱出来晚,甚至保留在柱上。

·紫外吸收系数较低和最大吸收不同的化合物在检测相对较低浓度的目标分析物时不能被检出,因为通常只有一个检测波长。

6. 排阻色谱

也叫凝胶渗漉(permeation)或滤过,分离基于化合物分子大小或水动力学(hydrodynamic)容积。比多孔柱填料孔径大得多的分子最先洗脱，小分子进入孔隙洗脱晚，其余的洗脱速率取决于其分子的相对大小。

B. 气相色谱（GC）

气相色谱基于挥发性样品由作为流动相的载气运载，通过色谱柱内的固定相时发生吸附和解吸附过程进行分离。

通常气相色谱分析的样品是低分子量化合物，这些化合物是易挥发的和高温时稳定的。在这一方面，药物和药物制剂中的残留溶剂适于气相色谱分析。生成化学衍生物可达到易挥发和热稳定的目的。

常用的检测器是用于含碳化合物的火焰离子化检测器（FID），用于卤代化合物的电子捕获式检测器（ECD），用于含硫和含磷化合物的火焰光度检测器（FPD），以及用于含氮或磷化合物的氮磷检测器（NPD）。气相色谱也能实现手性分离。填充柱迅速被毛细管取代来改进分离度和分析时间，在气相色谱上分析物位置与HPLC一样,用保留时间（R t）表示。