激素性股骨头坏死治疗的新干预策略项目申请书(标书)

激素性股骨头坏死治疗的新干预策略项目申请书

1.项目名称

激素性股骨头坏死治疗的新干预策略

2.研究工作的科学意义

落新妇苷是一种广泛存在于多种植物和功能食品中的二氢黄酮醇苷。近年研究发现其具有多种药理作用，如心血管药理活性、强抗氧化活性、抗炎、免疫抑制及抑制排异反应活性、缺血再灌注损伤保护作用、保肝作用、降尿酸及护肾作用、降血糖、调节脂肪及胆固醇代谢作用、镇痛、抗水肿及抗菌活性、抑菌及杀虫作用、抑制癌细胞增殖和诱导调亡、促进头发生长等，日益引起科学家的注意。但是落新妇苷是否与与激素的作用机制是一样的，过量使用是否会促进股骨头的坏死。近年来，基础和临床研究资料表明，大剂量或过量的激素可直接诱导成骨细胞（osteoblasts）和骨细胞（osteocytes）的凋亡及坏死，是股骨头坏死发生与演变的细胞学基础。成骨细胞在骨的发育、重建、修复中发挥着重要作用，在骨重建系统中主导骨生成，并诱导破骨细胞分化成熟促进骨吸收。此外，成骨细胞还分泌各种生长因子（例如 VEGF 等）调节血管生成[6]。申请者前期研究也证实，地塞米松抑制原代小鼠成骨细胞和MC3T3-E1 成骨细胞株存活，并诱导成骨细胞凋亡。因此，深入研究成骨细胞凋亡的分子机制，将有助于临床干预激素性股骨头坏死

[3-5]。

在体外培养的成骨细胞中（原代小鼠成骨细胞和MC3T3-E1细胞株），添加地塞米松可诱导P53磷酸化，后者转位到线粒体并和线粒体mPTP组成蛋白CyPD耦联，导致细胞mPTP开放，细胞色素C 的释放，从而介导成骨细胞凋亡。而通过药理学或基因学手段抑制线粒体内P53-CyPD耦联或表达则大幅抑制地塞米松诱导的成骨细胞凋亡。因此，我们提出地塞米松诱导P53磷酸化激活及线粒体转位，后者和线粒体内的CyPD耦联，从而介导线粒体mPTP开放。该机制可能是激素性成骨细胞凋亡的核心分子机制；而靶向干预该线粒体凋亡通路可能是防治激素性股骨头坏死的新途径。激活的AMPK 在促成骨细胞存活作用可能和其靶向抑制P53-CyPD线粒体通路有关。而外源性激活AMPK信号通路可减轻甚至预防激素性成骨细胞凋亡。尽管激活AMPK促进细胞存活已得到学术界的广泛论证[16, 17]，但目前已知的AMPK 激动剂（例如AICAR、A769662等）由于所需浓度高、特异性差、毒副作用大等原因，临床应用前景并不乐观。因此，申请者团队致力于开发新型AMPK激活剂二甲双胍来代替从而降低其毒副作用。

3．本项目研究目标，及其与申请者研究工作长期目标的关系【研究目标】

（1）落新妇苷的作用机制是否与糖皮质激素一样，直接诱导成骨细胞和骨细胞的凋亡及坏死。

（2）二甲双胍可以作为新型的AMPK激活剂，可减轻甚至预防

激素性成骨细胞凋亡。

【与研究工作长期目标的关系】

落新妇苷广泛存在于多种植物、水果和功能食品中，具有“药食同源”性，为人们日常生活经常摄入的食品成分。因此，落新妇苷没有毒副作用或者极小。而其同时又有降血糖、调节脂肪代谢、抗氧化、保肝护肾等多种生物活性。但是，目前的活性研究仍限于动物和细胞模型的研究阶段，其选择性免疫抑制，保护缺血再灌注损伤，降糖降脂，抗氧化，抗抑郁，抑菌杀虫，治疗重症肌无力，治疗牛皮癣病，治疗阿尔茨海默病等作用，均未有临床应用支持。落新妇苷作用机制还需进一步研究，本研究为进一步证实其作用机制是否与糖皮质激素相同。落新妇苷有多种药理作用日益引起科学家的注意，它有望做为一种治疗多种疾病的新药开发。

二甲双胍是一安全有效的抗糖尿病药物，已被广泛推荐为治疗2型糖尿病的一线用药。随着对二甲双胍研究的深入，发现其作用不仅局限于降低糖尿病患者血糖，且对多囊卵巢综合征和非酒精性脂肪肝病等也有一定益处。此外，二甲双胍可通过激活腺苷酸活化蛋白激酶，抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路等阻滞癌症细胞生长。近年来，其抗动脉粥样硬化、改善血管内皮功能等对心血管的保护作用也成为研究的热点。二甲双胍也被称为“神药”，我国厦门大学生命科学院林圣彩教授揭开了二甲双胍降血糖作用背后的机制：二甲双胍通过AXIN/ LKB1-v-ATPase-Ragulator通路不仅激活了AMPK，还抑制了mTORC1，为理解二甲双胍能够产生无数“益处”背

后的机制提供了有价值的分子见解。本研究用二甲双胍由于其毒副作用较小作为新型的AMPK激活剂，是否可减轻甚至预防激素性成骨细胞凋亡。

4．项目研究内容、研究方案和进度安排

【研究内容】

（1）落新妇苷直接诱导成骨细胞和骨细胞的凋亡及坏死。

落新妇苷诱导成骨细胞P53 线粒体转位，后者和线粒体mPTP 组成蛋白CyPD 耦联，从而介导线粒体mPTP 开放，细胞色素 C 释放。该机制可能是激素诱导成骨细胞凋亡及股骨头坏死的的核心分子机制。而激活成骨细胞AMPK，靶向调节该线粒体P53-CyPD 通路而抑制激素诱导的成骨细胞凋亡（见本项目的信号通路图）。本课题中，申请者将首先建立小鼠股骨头坏死模型，在体研究P53-CyPD 介导的线粒体凋亡通路诱导成骨细胞凋亡中的作用及机制。

（2）二甲双胍可以作为新型的AMPK激活剂，可减轻甚至预防激素性成骨细胞凋亡

AMPK是存在于所有真核细胞中进化上非常保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，是一个调控能量稳态的重要激酶, 并参与许多细胞信号传导通路[15]。（AMP-activated protein kinase, AMPK）可能参与调节该线粒体凋亡通路。包括我们在内的多个课题组[16, 17]均证实激活AMPK促细胞存活作用。例如：2012年研究人员在Nature上发表论文证实AMPK通过直接调控烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸

（NADPH）的稳态而促进细胞的存活[16]。激活AMPK还抑制应激诱导的细胞ATP的消耗，维持ATP/A DP的平衡，达到保护细胞的目的[16]。此外，AMPK通过抑制mTOR复合物1（mTORC1）或直接磷酸化Ulk1而介导激活细胞保护性自噬[18, 19]。我们前期研究证实，在体外培养的成骨细胞中，激活的AMPK通过活化NADPH而发挥抗氧化和抑制成骨细胞凋亡的作用。申请者研究还发现，激活的AMPK信号通路通过激活保护性自噬而促进骨肉瘤细胞存活，而AMPK抑制剂能显著增加骨肉瘤细胞的凋亡。上述研究均证实了激活AMPK在促成骨细胞存活中重要作用。此外，申请者研究发现，磷酸化的AMPK在人坏死股骨头组织中呈高表达[16]，提示其可能参与了股骨头坏死的病理过程。在此基础上，预实验结果进一步显示：在培养的成骨细胞中，AMPK激动剂（二甲双胍）激活AMPK，后者转位到线粒体和P53结合，并抑制后者和CyPD的结合，从而抑制线粒体膜电位的丢失和细胞色素Ｃ的释放，减轻落新妇苷诱导的成骨细胞坏死和凋亡。因此，激活的AMPK在促成骨细胞存活作用可能和其靶向抑制P53-CyPD线粒体通路有关。而外源性激活AMPK信号通路可减轻甚至预防激素性成骨细胞凋亡。

【研究方案】

（1）建立小鼠股骨头坏死模型，在体研究线粒体 P53-CyPD 通路在落新妇苷诱导成骨细胞凋亡中所起的作用及分子机制。

小鼠股骨头坏死模型的建立：

选取 SPF 级 8 周龄健康 C57BL/6J 小鼠，体重 20g 左右，饲养在