AmpC酶的研究进展

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1 AmpC酶的分类A mpC酶按其产生的方式分为三类:诱导高产酶、持续高产酶和持续低产酶[2]。

(1)诱导高产酶:A mpC酶的合成往往与 内酰胺类抗菌素的存在有关。

绝大部分肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌在正常条件下(即无 内酰胺类抗菌素存在的条件下)只产生少量的AmpC酶,而当有诱导作用的 内酰胺类抗菌素存在条件下,A mpC酶的产量明显增加,增加的范围在100~1000倍之间。

(2)持续高产酶:有一部分产A mpC酶的菌株不论有无 内酰胺类抗菌素存在条件下均可持续高水平产生AmpC酶,其原因为去阻遏突变,即调控基因之一的A mpD酶基因发生突变,产生有缺陷的A mpD蛋白,不能与另一种调控蛋白A mpR蛋白结合形成复合物,AmpR蛋白即以激活子状态发挥激活作用,引起AmpC酶的大量表达。

质粒介导的A mpC酶往往都属于此类AmpC酶。

产生这种AmpC 酶的细菌对临床危害最大,是临床微生物实验室检测的重点。

(3)持续低产酶:有极少部分产AmpC酶的菌株,不论有无 内酰胺类抗菌素存在条件下均持续低水平的产生A mpC酶,其原因可能是另一种调节基因ampR基因发生突变,产生有缺陷的A mpR蛋白,不能在无 内酰胺类抗菌素存在条件下起到抑制子作用,也不能在有 内酰胺类抗菌素存在条件下起到激活子的作用,故A mpC酶得以持续低水平表达。

2 AmpC酶的诱导性根据能否被 内酰胺类抗菌素诱导,AmpC酶以诱导酶和非诱导酶的形式存在于不同细菌中,诱导AmpC酶存在于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、不动杆菌属、粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌中,在缺乏 内酰胺类抗菌素时,只产生少量的 内酰胺酶,当有诱导作用的 内酰胺类抗菌素存在时, 内酰胺酶的产量明显增加。

非诱导性AmpC酶存在于大肠埃希菌、志贺菌属、克雷伯菌属。

通常只产生低水平 内酰胺酶,出现此现象的原因可能是与细菌缺乏调节基因ampR有关,因此认为,AmpC酶的诱导性与菌种有关,此外还受细菌的生长条件和诱导剂的影响。

研究发现[3],不同的培养基 内酰胺酶的诱导量不同:用头孢西丁作为诱导剂在M H肉汤中可使 内酰胺酶的活性从未诱导时的28 3增加到诱导后的2 666。

在营养肉汤中可使酶活性由未诱导时的54增加到诱导后的5723。

而在营养肉汤中加盐(1%N aCl)后,酶活性从32 2仅增加至285。

此外,还发现不同的诱导剂对A mpC酶的诱导能力不同,通常对携带诱导性A mpC酶的所有菌株,亚胺培南、头孢西丁和头孢孟多都是最强的诱导剂[4,5]。

3 AmpC酶的检测近年来,随着头孢菌素的广泛应用于临床,产AmpC酶的革兰阴性杆菌越来越多,尤其是出现了(去阻遏)持续高产AmpC酶和质粒介导的AmpC酶,导致耐药菌株广泛传播和临床对该类细菌感染的治疗困难,已引起临床的高度重视,检测AmpC酶有非常重要的临床意义。

目前检测AmpC酶有多种方法,但是有的方法还不够成熟。

3 1 头孢西丁敏感试验[6] 利用产A mpC酶的菌株对头孢332A nthology of M edicine,A p r 2006,V ol 25,N o 2西丁耐药,而ESBLs等其它 内酰胺酶一般不能分解头孢西丁,即产ESBLs的菌株对头孢西丁敏感的这一特性,可以对产A mpC酶的菌株进行初步筛选。

分纸片扩散法和稀释法两种。

此方法对头孢西丁耐药的菌株,怀疑有产AmpC酶的高度可能,仅仅作为初步筛选,需要做三维试验或纸片协同试验等试验,进一步的确定。

3 2 AmpC酶表型筛选试验[7] 根据A mpC酶对大部分头孢菌素,尤其是三代头孢菌素耐药的特性,选用多种头孢菌素纸片对产AmpC酶的菌株进行表型筛选。

选用亚胺培南、头孢吡肟、头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸5种抗生素纸片进行筛选试验。

具体操作按NCCLS的K B法进行。

此方法操作简便、快速省时,较三维试验简单,结果基本可靠,与三维试验的符合率达89 58%,普通细菌室可以推广应用。

3 3 氟氯西林双抑制剂扩散协同试验[8,9] 氟氯西林可抑制A mpC酶的活性,使产A mpC酶的菌株不能及时水解和破坏头孢菌素,保留了这些抗生素的抗菌活性。

利用这一特性,选用氟氯西林与其他超广谱头孢菌素(头孢曲松、头孢哌酮、氨曲南、头孢噻肟等)进行双抑制剂扩散协同试验,观察其有无协同作用。

此方法与AmpC酶表型筛选试验相仿,也是采用纸片扩散方法,氟氯西林与上述任何一种头孢菌素协同为阳性,提示产AmpC酶,可快速检测AmpC酶,操作简便、快速省时,结果基本可靠,可以在临床细菌室推广应用。

3 4 三维试验[10] 利用AmpC酶可以水解头孢西丁的原理,先用冻融法或超声粉碎法将待检菌株中的 内胺酰酶提取出来,观察这种酶的粗提物对头孢西丁的抑制情况。

如果粗提物中有AmpC酶存在,可抑制头孢西丁的活性,使其周围对头孢西丁敏感的大肠埃希菌得以生长;反之,大肠埃希菌受头孢西丁的抑制则不能生长。

方法:将大肠埃希菌标准菌株A T CC25922按N CCL S的K B法涂布在M H平板上,在平板的中央贴一张头孢西丁(30mg/片)纸片,从距离纸片5mm处用无菌刀片在平板的琼脂上向外缘方向切一裂隙,在裂隙中加入25~30 l的一种待检菌株的 内胺酰酶粗提物(注意 内胺酰酶粗提物不可溢出裂隙),35!培养18~24h,观察裂隙的内侧端(头孢西丁纸片的抑菌环内)周围有无细菌生长。

结果判断:头孢西丁纸片的抑菌环有缺失者为阳性,提示待检菌株产AmpC酶。

此法是目前公认经典的检测(去阻遏)持续高产AmpC酶的方法,也是目前检测质粒AmpC酶最好的方法,但是操作比较繁琐。

3 5 等电聚焦电泳 一般的A mpC酶的等电聚焦点(pI)偏碱性常大于8(为>9 0,8 9等),通过对待测菌的 内胺酰酶作等电聚焦,并与标准电泳条带相比较,还可确定AmpC酶的型别[11]。

3 6 PCR与DN A测序法 通过扩增ampC基因,即可检测A mpC。

如将P CR产物测序,并与标准序列相比较,还可检测A mpC的型别,此法准确可靠,可用于新型别的发现[12]。

4 AmpC酶的检出情况A mpC酶在常见高产菌株的检出情况:阴沟肠杆菌50 7%[13]、30%[14]、24 31%[7]、19 4%[15]等;大肠埃希菌16 7%[13];肺炎克雷伯菌3 8%[13];粘质沙雷菌14 3%[13];鲍曼不动杆菌16 2%[16]。

5 产AmpC酶菌株感染的治疗由于AmpC酶易于被诱导产生且对 内胺酰抗菌素抑制剂不敏感,给临床抗感染治疗带来了新挑战。

目前对AmpC 酶稳定的药物主要有碳青霉烯类(亚胺培南)和第四代头(头孢吡肟、头孢匹罗)以及某些喹酮类和氨基糖苷类抗生素[20]。

在体外 内胺酰酶抑制剂克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦,与 内胺酰抗生素联合运用实验中发现除克拉维酸外,舒巴坦和三唑巴坦未表现出因诱导而产生的拮抗作用,甚至发现三唑巴坦与哌拉西林联合还可抑制高产AmpC酶的耐药菌。

此外也有实验表明氯唑西林是A mpC酶较好的抑制剂,与头孢他啶联用,氯唑西林明显优于舒巴坦的抑菌效果,这些还需要临床资料的进一步证明[17]。

尽管目前已发现有的细菌同时产生ESBL s和AmpC酶,但临床上并不需要准确测知是否同时产这两种酶,因为两者均首选碳青霉烯抗生素如亚胺培南治疗,重要的是药敏试验是否准确测知其耐药性,以便及时正确地选用抗菌素治疗。