生化实验课二血浆IgG的分离制备及凝胶层析脱盐
实验三 凝胶层析法脱盐和分离蛋白质(0806)
实验三凝胶层析法脱盐和分离蛋白质(0806)一. 实验简介凝胶层析法是一种分离和纯化生物大分子的常用方法，其主要原理是根据分子大小和形状的差异，利用透明的分离层析介质，如凝胶，将混合样品中不同分子大小的生物大分子分离开来。
凝胶层析法通常用于脱盐、分离蛋白质等。
本实验的目的是学习凝胶层析法脱盐、分离蛋白质的方法。
二. 实验原理凝胶层析法脱盐：混合物中含有大量的低分子量离子和缓冲盐，它们也会进入凝胶层析介质中影响蛋白质分离。
通过凝胶层析法脱盐，可以去除这些离子物质，以得到更加纯净的蛋白质分离物。
凝胶层析分离蛋白质：凝胶层析法可以根据不同蛋白质的分子大小和形状来实现蛋白质的分离。
当样品溶液滴入凝胶层析柱内时，样品中的蛋白质将通过内部凝胶介质进行筛选。
与凝胶介质孔径相同或较小的蛋白质将受到凝胶层析柱中的阻滞作用而滞留在柱中；与凝胶介质孔径较大的蛋白质将通过凝胶层析柱被快速洗出。
三. 实验步骤1. 准备材料实验材料：1) 蛋白质混合物：约 0.5-1.0mg（例如淀粉酶和白蛋白的混合物）2) 已经平衡的蛋白质专用凝胶层析柱3) 凝胶层析缓冲液（一般为去离子水、Tris-HCl缓冲液等）4) 洗脱缓冲液（一般为含有酸或碱的缓冲液制成）5) 1.5mL或2mL离心管6) 滴液瓶7) 称量纸片8) 显微管或小型蛋白尺等实验设备：1) 离心机2) 通透性过滤膜（一般为0.22μm）3) 震荡器2. 脱盐操作1) 用去离子水或Tris-HCl缓冲液质加样品混合物。
3) 打开已经平衡的蛋白质专用凝胶层析柱端盖上的镊子，注意不要触碰凝胶层析床。
4) 将过滤的样品加入柱中，注意不要使样品溢出。
5) 用凝胶层析缓冲液清洗管子，直至清洗液中的OD值降至一定程度；一般要求OD < 0.01。
3. 分离蛋白质操作1) 将缓冲液的 pH 值调整为选择的蛋白质分离介质 pH 值，并将蓝色染料加入。
3) 将处理过的样品，也就是蛋白质混合物缓慢地加入柱中。
生物化学实验 实验五 血清IgG粗品的制备
一、目的：
掌握盐析法分离蛋白质的基本操作。
二、原理：
蛋白质的分离纯化是一项十分重要的实验技术。 盐析法是经典的蛋白质沉淀分离方法之一，其原 理是利用中性盐类能破坏蛋白分子表面的水膜， 从而使蛋白质凝聚，并从溶液中沉淀析出。沉淀 不同蛋白质所需盐类的浓度不同。例如，50%饱 和的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而33%饱 和的硫酸则使γ-球蛋白沉淀。因此，可根据所要 分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进 行盐析。用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某 种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般以饱和度来 表示。实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定 为100％。盐析某种蛋白质组分所需硫酸铵数量 折算成100％饱和度的百分之几，即称为该蛋白 盐析的饱和度。
沉淀用0.4 ml PBS溶解，再滴加饱和硫酸 铵溶液0.4 ml, 冰上静置10 min，使之充分 盐析，以5000 r/min离心5 min，去掉上 清液，沉淀为IgG粗品，加0.5 ml PBS。20℃保存备用。
五、结果及பைடு நூலகம்析
1、盐析沉淀蛋白变性了吗？可以重新溶解 吗？
2、样品为什么放在冰上？
磷酸盐缓冲溶液(Phosphate-buffered saline, PBS)：NaH2PO4-H2O 0.256 g、Na2HPO4-7H2O 2.248 g、NaCl 8.76 g，加蒸馏水至1000 ml，pH7.3。
四、步骤：
取血清0.4 ml，滴加饱和硫酸铵0.4 ml，注 意边加边混合，以防止硫酸铵局部过饱和。 混合时不要过于剧烈，以免导致蛋白质变性。 冰上静置10 min，使之充分盐析，以5000 r/min离心5 min，去掉上清液，沉淀为IgG 及杂蛋白。
IgG的分离、提取与鉴定
IgG分离、纯化与鉴定实验原理操作步骤：1、取2.5ml血清，加pH7.0 PBS 2.5ml，再逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液1.25ml，使成20%（NH4）2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置20min。
2、3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。
3、在上清液中再加（NH4）2SO4饱和溶液3.75ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置20min。
4、3000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。
5、于沉淀中加5ml PBS，使之溶解，再加（NH4）2SO4饱和溶液3.2ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合后，静置20min。
6、3000r/min离心20min，弃上清，以除去其它球蛋白。
7、用1ml PBS溶解沉淀，装入透析袋。
8、透析除盐，在蒸馏水中透析过夜，再在pH6.7的磷酸盐缓冲液中于4℃透析24h，中间换液数次。
8、SephadexG50 除盐：用蒸馏水浸泡5小时或在沸水浴中溶胀2小时，倾倒去水，加入磷酸盐缓冲液（0.0175mol/L，pH6.7）搅拌成悬浮液，按下述方法装柱。
9、DEAE-纤维素的活化：称取1g DEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸馏水浸泡过夜，观察溶胀后DEAE的体积。
根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE的用量，称取所需DEAE 用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。
抽干，改用0.5mol/L NaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用无离子水漂洗，使pH至8左右（用pH试纸检查）。
再改用0.5mol/L HCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用无离子水洗至pH6左右。
本实验中在用前应以0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，浸泡平衡后使用。
10、装柱用0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸盐缓冲溶液浸泡已处理好的DEAE-纤维素，并更换1～2次。
然后搅拌均匀，灌入层析柱中，直至纤维素柱床高约11mL处左右为止，在床面上放一张圆形滤纸片。
IgG的分离与提纯-硫酸铵沉淀法.doc
IgG的分离与提纯-硫酸铵沉淀法以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。
但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。
通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。
因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。
γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75％，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。
纯化IgG小量几十ml的话，用protein A或protein G就可以，疏水柱等也可以纯化；大量的话，上百ml，可以使用streamline protein A。
之前根据载量估计一下需要的柱子体积。
实验室中常用硫酸铵沉淀后过DEAE 纤维素柱，比较简便可获较纯的抗体。
下面以此方法为例介绍IgG的分离与提纯。
材料与试剂配制1. 动物血清2. 硫酸铵饱和溶液硫酸铵800g~850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。
注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。
如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。
3. 0.01Mol/L pH7.4PB液A液：0.10Mol/L NaH2PO4液NaH2PO4·2H2O 15.60g加H2O至 1 000.mlB液：0.10Mol/L Na2HPO4液Na2HPO4·12H2O 35.80g加H2O至 1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。
4. 1％BaCl2溶液5. 纳氏液HgI 115.00gKI 80.00g加H2O至500.00ml溶化后过滤，然后再加20％NaOH500.00ml，混合即可。
生物化学实验PPT课件 3蛋白质的盐析分离和凝胶排阻层析脱盐
珠内部反复穿行，缓慢流出。
流 动 相
固 定 相
实验简述
1. 通过盐析法使鸡蛋卵清蛋白和卵球蛋白分离；通过盐溶法 使沉淀析出的卵球蛋白再次溶解 2. 制备葡聚糖凝胶SephadexG-25凝胶排阻层析柱 3. 通过凝胶排阻层析分离卵球蛋白和盐离子 4. 检测层析后收集的各管样品中的盐离子（醋酸钡法） 5. 检测各管样品中的蛋白质含量（UV法）
用移液枪去除上清（含卵清蛋白） 加50%硫酸铵溶液1.5ml 洗涤 3000rpm，离心3分钟 用移液枪去除上清
实验二 凝胶柱的制备和蛋白脱盐
1. 垂直固定层析柱，并安装乳胶管、止水夹
2. 向层析柱中加入1/3体积的水，以平衡、排出基质和乳胶管中的 气泡；若层析柱流水不畅，应反复正反冲洗柱基质！！
实验三 脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1. 硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。 从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀
实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(醋酸钡检测溶液) 用++/+/-记录每管硫酸钡沉淀情况
6. 分析结果：盐析分离蛋白及凝胶排阻层析脱盐是否成功？
实验一 卵球蛋白的盐析分离
0.7ml 卵清 + 0.7ml 饱和硫酸铵溶液 （每组2个EP管） 混合均匀 （避免产生气泡） 静置3-5分钟，蛋白质析出
将两管上清合并， 即为样品 3000rpm, 离心3分钟
1ml水充分溶解 卵球蛋白沉淀
3000rpm，离心3分钟
凝胶排阻层析
(分子筛层析、分子排阻层析、凝胶过滤层析)
固定相：常用交联葡聚糖凝胶，如Sephadex系列，有不同凝胶
IgG的分离
3. DEAE纤维素离子交换层析步骤
(1) 装柱：取层析柱固定于支架上，关紧下端出口， 将处理好的DEAE纤维素搅拌后均匀装入柱内，柱 高约10cm；
(2) 平衡：打开下端出口， 0.0175M pbs (pH6.3) 平衡， 使DEAE纤维素分布均匀后关闭下端出口；
• DEAE-纤维素层析 (磺柳酸试剂检查蛋白质）（样C）
A、B、C样品 • 醋酸纤维薄膜电泳（鉴定γ-球蛋白的纯度）
1. 盐析实验操作步骤
留取血清2滴电泳用(A液). (1) 取血清2ml+生理盐水2ml ， (2) 取4ml饱和(NH４)２SO４溶液缓慢滴入，边加边摇。
饱和度33%-50%时，球蛋白析出；饱和度大于50%时，白蛋白析出。
固定相中溶质浓度 K= 流动相中溶质的浓度
K与溶质和溶剂的性质有关
固定相：多孔性固体支持物（滤纸、硅藻土、纤维 素等）吸附一种溶剂。 流动相：与固定相溶剂不溶的溶剂。
• 离子交换层析
是利用离子交换剂上可解离基团对各种离子的 的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。 离子交换剂：是含有可解离的阳离子或阴离子基团不 溶性高分子化合物，这些基团能与溶液中的其它阳离 子或阴离子进行可逆的交换。
阴离子交换剂中含有的碱性基团，能释放出阴离 子，与样品溶液中的阴离子进行交换。
强碱型阴离子交换剂：季胺 [R-N+(CH3)3-OH-]
弱碱型阴离子交换剂：伯胺 (R-N+HH2-OH-)
仲胺 (R-N+HCH3H-OH-)
基架
+ +
OHOH-
叔胺 活性基团
血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定
实验八血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定为了初步掌握蛋白质的分离纯化技术，选择了从家畜血清中分离纯化免疫球蛋白G （Immunoglobulin G，简称IgG）的实验。
血清中的蛋白质有数十种之多，IgG是球蛋白的一种。
分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质（如在一定条件下带电的情况、分子量、溶解度等）的不同而建立起来的，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳和超速离心等。
在分离纯化时，要根据情况选用几种方法互相配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。
本实验采用硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换及凝胶过滤等方法，提取家畜血清中IgG。
其原理及操作如下：㈠硫酸铵盐析1.试剂饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取（NH4）2SO4760g,加蒸馏水至1000ml，加热至5℃，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。
（内含0.15mol/L NaCl，简称PBS）：取0.2mol/L Na2HPO4磷酸缓冲溶液（0.01mol/L，pH7.0）溶液30.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液19.4ml，加NaCl8.5g，加蒸馏水至1000ml。
磷酸缓冲溶液（0.0175mol/L，pH6.7）（不含NaCl，简称PB）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合，用蒸馏水稀释至1000ml。
2.操作①取家畜血清5ml，加磷酸缓冲溶液（0.1mol/L，pH7.0）5ml，混匀，滴加（边摇边搅拌）饱和硫酸铵4ml（此时溶液硫酸铵饱和度约为20%）。
静置20min，以3000r/min 离心15min，沉淀为纤维蛋白（弃去），上清液中含清蛋白、球蛋白。
②取上清液，再加饱和硫酸铵溶液6ml（方法同前），此时溶液硫酸铵饱和度为50%，静置20min，以3000r/min 离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。
血清免疫球蛋白(Immunoglobulin,IgG)的分离制备―盐析法
血清免疫球蛋白（Immunoglobulin，IgG）的分离制备―盐析法（一）原理IgG是免疫球蛋白（Immunoglobulin，简称IgG）的主要成分之一，分子量约为15万~16万，沉降生活费数约为7s。
IgG是动物和人体血浆的重要成分之一。
血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG，首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG。
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。
许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Salting in）。
而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐析‘（Salting out）。
这些现象的原理大致是由于蛋白质是亲水胶体，带有羧基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证蛋白质形成溶于水的溶胶状态。
当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性基团，因而增大了蛋白质在水中溶解度，出现“盐溶”现象。
钽当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来；另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互磁撞时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析”现象。
由于各种蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度也各异，盐析所需的最小盐量称做盐析浓度。
盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步“盐析”出来，达到分离目的蛋白质。
盐析法是1878年Hammarster首次使用的，他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、球蛋白两部分。
自那以后曾使用过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐来盐析蛋白质，其中运用最广的是硫酸铵。
因为硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中化学性质稳定；溶解度大，25℃时能达到4.1mol/L的浓度；溶解度的温度系数变化较小，在0~30℃范围内溶解度变化不大，如25℃时饱和溶解度为4.12mol /L，即767g/L，0℃时饱和溶解度为3.9mol/L，即676g/L。
凝胶层析法脱盐和分离蛋白质(附凝胶过滤法原理及基本操作)-1
凝胶层析法脱盐和分离蛋白质（附凝胶过滤法原理及基本操作）-1（一）原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。
脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。
前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。
所以，要根据具体情况选择使用。
前实验中样品体积较小，凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。
（二）试剂与器材（1）Sephadex G-25。
（2）0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液。
（3）奈氏（Nessler）试剂：于500ml锥形瓶内加入碘化钾150g，碘110g，汞150g及蒸馏水100ml。
用力振荡7～15min，至碘的棕色开始转变时，混合液温度升高，将此瓶浸于冷水内继续振荡，直到棕色的碘转变为带绿色的碘化钾汞液为止。
将上清液倾入2000ml量筒内，加蒸馏水至2000ml，混匀备用。
（4）20%（W/V）磺基水杨酸溶液。
（5）1.5cm×20cm层析柱。
（6）黑、白比色磁盘。
（三）操作（1）取层析柱1支（1.5cm×20cm），垂直固定在支架上，关闭下端出口。
将已经溶胀好的Sephadex G-25中的水倾倒出去，加入2倍体积的0. 0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，并搅拌成悬浮液，然后灌注入柱，打开柱的下端出口，继续加入搅匀的Sephadex G-25，使凝胶自然沉降高度到17cm左右，关闭出口。
待凝胶柱形成后，在洗脱瓶中加入0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液以3倍柱体积的磷酸盐缓冲流过凝胶柱，以平衡凝胶。
（2）凝胶平衡后，用皮头滴管除去凝胶柱面的溶液，将盐析所得全部IgG样品加到凝胶柱表面，打开柱下口，控制流速让IgG样品溶液慢慢浸入凝胶内。
血清IgG的分离、鉴定(2011.11)
本上是相同的。
（3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成 正比。
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率 不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取 决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基 分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD—200KD之
（四）凝胶浓度的选择
由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质 的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的选 择会直接影响分辨率。 不同分子量范围的蛋白质应选用不
带有烷基化作用的还原SDS处理： 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护 SH基团，而得到窄的电泳带。
（三）三大效应
A浓缩效应
•缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲 液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液，样品 及凝胶中缓冲液为pH6.7 Tris-HCL缓冲液。 电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有 效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离 子完全电离，有效迁移率大，称为快离子； 蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始 后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区， 产生高电位梯度（电位与电导率成反比）， 使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间 而被压缩。1cm厚样品层可以压缩0.25μm的 厚度。
1. 标准曲线的制作及样品测定
在20～200µ g/ml范围内其峰值与RNA含量成正比 RNA标准溶液：40ug/mL
试管 标准RNA 蒸馏水 浓度 （ug/mL） 1 0 2.0 2 0.4 1.6 3 0.8 1.2 4 1.2 0.8 5 1.6 0.4 6
mL
样品 样品 1 2 2.0 2.0 2.0 0
40/1.1980
分离血浆蛋白的方法
分离血浆蛋白的方法介绍血浆蛋白是血液中重要的组成部分之一，对于维持人体正常生理功能和免疫防御至关重要。
血浆蛋白的分离和纯化是生物技术和医学研究中常见的实验技术，以下是一些常用的血浆蛋白分离和纯化方法：1. 盐析法：盐析法是一种常用的血浆蛋白分离和纯化方法。
它基于蛋白质在不同浓度的盐溶液中的溶解度差异，通过向血浆中加入一定浓度的盐（如硫酸铵、硫酸钠等），使血浆蛋白在盐溶液中溶解度降低而沉淀出来，从而实现血浆蛋白的分离。
2. 凝胶过滤法：凝胶过滤法是一种基于分子筛效应的分离方法。
它利用凝胶颗粒的孔径大小和电荷分布特性，将不同大小和电荷的分子分开。
凝胶过滤法适用于分离分子量相差较大的蛋白质，如血浆蛋白中的白蛋白和球蛋白等。
3. 离子交换层析法：离子交换层析法是一种基于离子交换原理的分离方法。
它利用阳离子交换剂或阴离子交换剂与血浆蛋白中的离子进行交换，从而将不同电荷的血浆蛋白分离。
离子交换层析法适用于分离电荷差异较大的蛋白质，如血浆蛋白中的免疫球蛋白等。
4. 疏水层析法：疏水层析法是一种基于蛋白质表面疏水性差异的分离方法。
它利用疏水性层析介质与血浆蛋白中的疏水性氨基酸结合，从而将不同疏水性的血浆蛋白分离。
疏水层析法适用于分离疏水性差异较大的蛋白质，如血浆蛋白中的凝血因子等。
5. 亲和层析法：亲和层析法是一种基于蛋白质之间特异性相互作用的分离方法。
它利用血浆蛋白与特定的配体（如抗体、配体等）之间的特异性结合，从而将血浆蛋白分离。
亲和层析法适用于分离具有特定相互作用的蛋白质，如血浆蛋白中的免疫球蛋白等。
综上所述，血浆蛋白的分离和纯化方法有很多种，每种方法都有其适用范围和优缺点。
在实际应用中，需要根据待分离蛋白质的特性和实验目的选择合适的分离方法。
实验亲和层析纯化IgG
实验步骤 1. Protein A纯化：
3）冲洗：加2倍柱体积冲洗缓冲液，打开止水夹，控制流出
速度为2ml/min，并用试管收集流出液(记为W)，在床表面仅 有1毫米左右液层时，关止水夹，再加入2倍柱体积平衡缓冲
液冲洗填料，床表面仅有1毫米左右液层时，关止水夹， 。
4）洗脱收集：取刻度试管2支编号，柱床上面加3倍柱体积 洗脱缓冲液，控制止水夹流出1倍柱体积洗脱液后，关止水 夹，室温下柱料与洗脱液孵育15min，打开止水夹控制流出 速度为1ml/min收集2倍柱体积（记为E1），待床表面仅有1 毫米左右液层时再加入3倍柱体积洗脱缓冲液， 收集2倍柱体 积记为E2。 5）收集结束后，加入清洗液（6M NaOH）洗涤2cv，平衡 液5cv。
三、实验材料——SDS-PAGE
试剂： 1. 2x样品缓冲液 2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺 0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml，过滤。 3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重 蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。 4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重 蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。 5. TEMED（四乙基乙二胺）原液 6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制） 7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g， 加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃ 保存，临用前稀释10倍（减半配制）。 8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于 200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到 250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。 器材： 电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。
凝胶层析脱盐实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶层析法的原理及操作步骤。
2. 掌握凝胶层析脱盐实验的基本操作，学会使用凝胶层析柱进行蛋白质的脱盐纯化。
3. 通过实验验证凝胶层析法在脱盐过程中的效果。
二、实验原理凝胶层析法是一种利用凝胶的分子筛作用，将混合物中的组分按分子大小进行分离的方法。
凝胶层析脱盐实验主要是通过凝胶的分子筛作用，将含有盐的蛋白质溶液中的盐分与蛋白质分离，从而达到脱盐的目的。
三、实验材料与仪器1. 材料：- 凝胶层析柱（1.5cm×20cm）- Sephadex G-25凝胶- 0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液- 样品（含盐蛋白质溶液）2. 仪器：- 电子天平- 移液器- 烧杯- 漏斗- 铁架台- 铅笔四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：- 将凝胶层析柱垂直固定在支架上，关闭下端出口。
- 将Sephadex G-25凝胶用0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液充分溶胀，然后倾倒至层析柱中，使其自然沉淀至柱底。
2. 准备样品：- 用移液器准确吸取一定量的含盐蛋白质溶液，加入适量的0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液进行稀释，使其浓度适宜。
3. 加样：- 将准备好的样品沿层析柱的上端缓慢加入，注意不要扰动凝胶层。
4. 层析：- 打开层析柱下端出口，用0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。
5. 收集与鉴定：- 收集洗脱液，观察洗脱液的颜色变化，判断脱盐效果。
- 取一定量的洗脱液进行SDS-PAGE电泳分析，观察蛋白质的迁移情况，进一步验证脱盐效果。
五、实验结果与分析1. 观察洗脱液的颜色变化：- 在凝胶层析脱盐实验过程中，随着洗脱液的收集，洗脱液的颜色逐渐变浅，说明盐分逐渐被洗脱。
2. SDS-PAGE电泳分析：- 通过SDS-PAGE电泳分析，观察蛋白质的迁移情况，发现脱盐后的蛋白质样品中，目标蛋白质的条带明显，说明脱盐效果良好。
六、实验结论通过凝胶层析脱盐实验，我们成功地将含盐蛋白质溶液中的盐分与蛋白质分离，实现了脱盐的目的。
IgG纯化指南
抗体的提取与纯化精制免疫球蛋白的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法1.取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
4℃，3h以上，使其充分沉淀。
2.离心（3000rpm）,20min,充上清，以x ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
置4℃3h以上（此时硫酸铵的饱和度为33%）。
3.重复上述第二步过程1～2次。
末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以 pH7.4 PBS溶解至x ml装入透析袋。
4.对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
5.取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。
（1）蛋白质的浓度盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。
蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。
故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。
（2）离子强度各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。
例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33％时γ球蛋白析出。
（3）盐的性质最有效的盐是多电荷阴离子。
（4）PH值一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。
改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。
（5）温度盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。
血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。
但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。
（6）蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。
实验三 凝胶层析法脱盐和分离蛋白质(0806)
实验三Sephadex G-25凝胶层析法脱盐和离子交换柱层析分离菠萝蛋白酶一、Sephadex G-25凝胶层析法脱盐（一）目的和要求掌握凝胶层析法的原理及操作技术。
（二）原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。
脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。
前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。
凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatography）、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。
它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。
其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。
网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。
人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。
凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。
分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。
这样被分离物质即被按分子的大小分开。
凝胶层脱盐实验报告
一、实验目的1. 掌握凝胶层析法的原理和操作步骤。
2. 学习利用凝胶层析法对蛋白质进行脱盐处理。
二、实验原理凝胶层析法是一种利用凝胶对分子进行分离的技术。
凝胶是一种具有多孔结构的物质，分子在凝胶中的移动速度取决于其分子大小和凝胶孔径。
通过选择合适的凝胶和层析条件，可以将不同分子大小的物质分离。
在凝胶层析脱盐实验中，蛋白质分子与盐分子在凝胶层析柱中的移动速度不同，从而使蛋白质与盐分离。
蛋白质分子较大，无法进入凝胶的微孔，移动速度较快；而盐分子较小，可以进入凝胶的微孔，移动速度较慢。
三、实验材料与试剂1. 材料：蛋白质样品、盐溶液、葡聚糖凝胶G-252. 试剂：蒸馏水、缓冲液、洗脱液、洗脱液储备液、盐检测试剂、蛋白质检测试剂四、实验步骤1. 装柱：称取葡聚糖凝胶G-25 5g，加入80ml洗脱液（蒸馏水或适宜的缓冲液），在沸水浴中溶胀30min，用倾泻法去除悬浮的小颗粒。
然后装进内径1.2cm，高30cm的玻璃柱内，注意装填均匀，无气泡和裂纹存在，并保持液面在凝胶表面以上。
2. 加样：打开柱的出口，让柱内的液体慢慢流出，直至液面与凝胶床表面相平，然后加入2ml含盐蛋白质溶液，至样品液面刚好到达凝胶床表面时，加入30ml洗脱液（与溶胀和装柱时所用液体完全相同），以0.5ml/min的流速洗脱，每5ml收集一管。
3. 收集样品：将收集的样品液进行盐和蛋白质检测。
4. 盐检测：根据具体盐的种类选择合适的检测方法，如火焰原子吸收光谱法、离子色谱法等。
5. 蛋白质检测：将分步收集的样品液于280nm处的紫外光吸收法检测，也可用福林酚测定。
五、实验结果与分析1. 盐检测：通过盐检测方法，可以确定脱盐效果。
实验结果显示，脱盐效果良好，盐浓度明显降低。
2. 蛋白质检测：通过紫外光吸收法或福林酚法，可以确定蛋白质的纯度和浓度。
实验结果显示，蛋白质的纯度较高，浓度符合预期。
六、实验讨论1. 凝胶层析法是一种简单、有效的蛋白质脱盐方法。
生物化学与分子生物学基本试验试验一蛋白质的盐析与透析试验
生物化学与分子生物学基本实验实验一蛋白质的盐析与透析实验目的了解蛋白质的盐析与透析的原理和意义实验原理血清中的蛋白质，用盐析的方法，可以分离出清蛋白、α、β球蛋白和γ-球蛋白三种。
详情见盐析技术。
另选择适宜孔径的半透膜，使蛋白质分子被截留，小分子的中性盐透出而达分离的目的。
但透析时正负离子透过半透膜的速度不同，如硫酸铵中的NH4+的透出较快，膜内SO42-剩余而生成H2SO4，其酸度足以使蛋白质变性，因此，除盐时开始应对0.14 mol·L-1的NH4OH透析。
本实验分别用双缩脲试剂和Nessler试剂检验蛋白质和NH4+的存在。
仪器材料和试剂药品仪器材料：（1）离心管、试管及试管架。
（2）2m1刻度吸管、玻璃棒、小烧杯。
（3）透析袋。
（4）离心机。
试剂药品：（1）饱和硫酸铵溶液。
（2）硫酸铵粉末。
（3）双缩脲试剂称取CuSO4·5H2O 2.5g，加蒸溜水少许，微热溶解后稀释至100ml。
另取酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·H2O）10g和KI 5g，溶于500ml蒸馏水中，再加入20％氢氧化钠300ml，混匀后，慢慢加入硫酸铜溶液中，加蒸馏水至1000ml。
此液可长期储存。
（4）Nessler试剂称取150g碘化钾置于三角烧瓶中，加蒸馏水100ml使之溶解，再加入110g碘，待完全溶解后加140g～150g汞，用力振摇10分钟左右，此时产生高热，须将三角烧瓶放入水中继续摇动，直至棕红色的碘转变成带绿色的碘化汞钾为止。
将上清液倾入2000ml容量瓶中，并用蒸馏水洗涤瓶内的沉淀数次，将洗涤液一并倒入容量瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，此为贮存液，储于棕色瓶中备用。
取贮存液150ml，加10％氢氧化钠700ml，混匀后加蒸馏水150ml，混匀，此为应用液，储于棕色瓶中，如混浊可过滤或静止数天后取上清液使用。
本试剂需有适宜的pH值，调节至用1 mol/L盐酸20ml滴定时，需本试剂11.0ml～11.5ml时为宜。
血浆IgG的分离_纯化及鉴定实验报告
血浆IgG的分离，纯化及鉴定实验报告一、实验目的掌握盐析法的原理及盐析法分离制备血浆IgG的基本过程。
二、实验原理1.血浆IgG是免疫球蛋白（简称Ig）的主要成分之一，相对分子质量为15~16万。
要从身姿中分离出血浆IgG，首先要尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使血浆IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得血浆IgG。
2.盐析法是粗分离蛋白质的重要方法，许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶液度低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象为盐溶。
而当盐浓度继续继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为盐析。
这现象的原理大致是由于蛋白质带有羟基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证了蛋白质不溶于水，当加入少量盐后，破坏水膜结构，增多了蛋白质的极性基团，蛋白质的溶解度增大，出现盐溶的现象，另一方面加入的盐离子中和蛋白质表面电荷，蛋白质分子相互蛋白质混合溶液中的各个成分分步盐析出来，达到分离目的蛋白质。
3.用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般饱和度来表示。
实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度为100%或1。
盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1的百分之几。
即称为该蛋白质盐析的饱和度。
4.饱和度可以用饱和硫酸铵溶液法计算：在蛋白质要求达到50%以下时采用：V＝V0*（C2－C1）/（1－C2）V0－－蛋白质溶液的原始体积C1－－所要达到硫酸铵饱和度C2－－原来溶液的硫酸铵饱和度三、试剂与仪器饱和硫酸铵溶液，0.01mol/l,PH7.0的磷酸盐缓冲溶液，0.0175mol/L,PH6.7的磷酸盐缓冲溶液四、实验步骤1.取1支离心管，向其中加入5ml血浆和5ml0.01mol/l,PH7.0的磷酸盐缓冲溶液，混合。
向其中加入2.5ml饱和硫酸铵溶液，使其饱和度为20%（加入过滴加边搅拌），加完后，应在4度放置15min，使之充分盐析，然后以3000r/min离心10min，弃去沉淀（沉淀为纤维蛋白）2.量取10ml清液体积，置于另一离心管，用滴管加入6ml饱和硫酸铵溶液，使其饱和度达到50%，加完后，4度放置15min，以3000r/min离心10min，弃去溶液，留下沉淀。
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三. 实验报告的格式及要求：
1. 分段盐析原理； 2. 凝胶过滤层析原理； 3. 盐析操作用流程图； 4. 层析操作用简洁的文字叙述； 5. 报告层析结果； 6. 分析总结实验成败的关键环节。
四. 思考题
1. 盐析时为什么要防止局部浓度过高？ 2. 列举蛋白质初级纯化还有哪些方法？ 3. 凝胶过滤层析与凝胶电泳中的分子筛效应 4. 有什么不同？为什么？
葡聚糖凝胶层析原理
层析操作：
1. 3个组成部分； 2. 开机，开夹洗柱； 3. 检查至无盐； 4. 停止洗脱； 5. 待洗脱接近柱面； 6. 夹住出口。
层析操作：
7. 提前清洁15支小试管，各加奈氏试剂1滴； 8. 约1mL滤液上样，开夹至样液接近胶面，开始洗脱； 9. 至磺基水杨酸检查蛋白出现起开始用试管收集； 10. 每管收集2滴，至磺基水杨酸检查没有蛋白出现止。
血浆IgG的分离制备及凝胶层析脱盐
教学目的：
1. 掌握蛋白质分段盐析的原理及操作； 2. 掌握凝胶层析脱盐的原理； 3. 掌握柱层析操作方法。
重点难点：
1. 分段盐析的原理及操作； 2. 凝胶过滤层析原理以及层析过程中几个关键 3. 环节的把握。
离心机的使用：
1. 2支离心管在台秤上平衡； 2. 对称放入离心机； 3. 盖盖，开电源，定时； 4. 转速逐步达到设定； 5. 待完全停