引物选择的过程和上群体的过程
作物育种学名词解释
作物育种学名词解释作物育种学：研究选育和繁殖作物优良品种的理论与方法的科学。
作物品种：人类在一定生态条件和经济条件下，根据自身需要所选育的某种作物群体。
该群体具有相对稳定的遗传特性（稳定性,Stability ），同时在生物学、形态学及经济性状上具有相对的一致性（一致性，Uniformity），并在这些性状上与同一作物的其他群体有所区别（特异性, Distinctness）种（species）：具有一定的自然分布区和一定的生理化、形态特征的生物群，是分类的基本单位。
种内个体具有相同的遗传性状，可以彼此交配产生后代，种间存在生殖隔离。
亚种(subspecies)：不同分布区的同一种植物，由于生境不同导致两地植物在形态结构或生理功能上存在差异。
变种(variety)：具有相同分布区的同一种植物，由于微生境不同导致植物间具有可遗传的差异。
作物品质：指作物经济器官满足人类需求的程度。
株型：指作物的茎、枝、叶等主要光和器官在植株上的着生态势。
合理的株型可使作物充分利用光能资源，提高有机物的合成，为高产打好基础。
有性繁殖(Sexually propagating)：由雌雄配子结合，经过受精过程形成种子繁衍后代的繁殖类型。
自花授粉（self-pollination ）异花授粉（cross-pollination ）常异花授粉（often-cross pollination ）无性繁殖(Asexually propagating )：不经过两性配子的受精过程繁衍后代的繁殖类型。
自花授粉同一花朵内花粉传到同一朵花的雌蕊柱头，或同一株的花粉传到同株的雌蕊柱头上的授粉方式。
异花授粉雌蕊柱头接受异株花粉受精的授粉方式常异花授粉：同时依靠自花授粉和异花授粉两种方式繁衍后代的授粉方式。
自交不亲和性：具有两性花并可形成正常雌、雄配子的某些植物，缺乏自花授粉结实能力的一种自交不育性。
自交不亲和性是一种受遗传控制的、提高植物自然异交率的特殊适应性。
CR的种类及应用课件
反向PCR (Inverse PCR, IPCR)
原理：扩增引物相反方向DNA 序列的技术。用反向 的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段， 而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段. 实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶 对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端 的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR， 其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知 序进行分析研究. 已知序列
94KDa.其比活性为200000单位
/mg.75～80℃时每个酶分子每秒钟
可延伸约150个核苷 酸，70℃延伸
率大于60个核苷酸/秒，55℃时为
24个核苷酸/秒.温度过高(90℃以
上) 或过低(22℃)都可影响Taq
DNA聚合酶的活性，该酶虽然在
90℃以上几乎无DNA合成， 但确有
良好的热稳定性，在PCR循环的高
多重PCR
一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段， 主要用于单一致病因子等的鉴定.多重PCR(multiplex PCR)， 又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加 上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其 反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同
4. 经PCR扩增产生的主要是 线双链DNA分子，它是由 左侧的序列和右侧序列首位 连接而成，其接点就是限制 酶的识别位点
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2024/5/4
应用：
利用反向PCR可对未知序 列扩增后进行分析，探索邻接 已知DNA片段的序列，并可将 仅知部分序列的全长cDNA进行 分子克隆，建立全长的DNA探 针。
应用于染色体步移、转位 因子和已知序列DNA旁侧病毒 整合位点分析等研究。
引物设计的详细步骤
引物设计是PCR（聚合酶链式反应）技术中的关键步骤，以下是引物设计的详细步骤：选择合适的引物长度：通常选择18-30个核苷酸长度的引物。
引物太短可能降低特异性，
而太长则可能导致非特异性结合。
选择合适的引物GC含量：通常选择40%-60%的GC含量。
GC含量过高或过低都可能
影响PCR的效率。
避免引物二聚体和发夹结构：这些结构可能导致引物自身结合，从而影响PCR的效率。
可以使用软件工具检查引物的这种可能性。
避免引物间的互补：引物之间互补的序列可能导致引物结合，从而影响PCR的效率。
选择合适的引物位置：引物应位于目标基因的特异区域，通常选择基因的编码区。
此外，应避免选择有高突变率的区域，这可能影响引物的特异性。
使用软件进行引物设计：有许多在线和离线软件可以帮助设计PCR引物，如Primer3、Oligo 等。
这些软件可以根据输入的基因序列自动设计和选择最佳的引物。
实验验证：即使通过软件设计的引物看起来很好，也需要在实验中进行验证，以确保其特异性、有效性和可靠性。
引物浓度和退火温度的优化：引物的浓度和退火温度也是PCR的重要参数，需要针对特定的反应条件进行优化。
请注意，对于具体的实验和目的，可能需要更具体和详细的设计考虑，建议咨询相关领域的专家或具有丰富经验的实验员。
引物的设计流程
引物的设计流程Designing primers for PCR (polymerase chain reaction) is a crucial step in molecular biology research. 引物的设计对于PCR（聚合酶链反应）是分子生物学研究中至关重要的一步。
It involves carefully selecting short, single-stranded DNA sequences that will bind to the target DNA and initiate the amplification process. 这涉及仔细选择短的、单链的DNA序列，这些序列将与目标DNA结合并启动扩增过程。
The design process requires attention to detail to ensure the success of the PCR experiment.设计的过程需要细致入微的关注，以确保PCR实验的成功。
To achieve this, several key considerations must be taken into account.为了达到这一目的，必须考虑几个关键因素。
These include the length and melting temperature of the primers, as well as any potential secondary structures or primer-dimer formations.这些因素包括引物的长度和熔解温度，以及任何潜在的二级结构或引物二聚体形成。
One of the most important aspects of primer design is ensuring that the primers specifically bind to the target DNA sequence. 引物设计最重要的一个方面是确保引物能够特异性地结合到目标DNA序列。
生物技术概论基因工程部分复习重点
1、PCR：一种模拟DNA体内复制过程的体外DNA复制过程，在一个离心管的缓冲液体系中，加入DNA模板，d-NTPs、引物和DNA聚合酶，通过变性、退火、延伸三个温度的不断循环，使目标DNA得到快速大量的复制，需要两条合成的寡核苷酸片断和耐热的DNA聚合酶。
2、启动子：在基因序列中，标志着转录起始的可以被RNA聚合酶识别的位点（DNA区段），一般位于基因的上游。
3、终止子：位于基因的编码序列之外（一般在下游）的一段标志着转录停止的RNA聚合酶识别位点。
4、Ti质粒：根癌农杆菌核外的一种环状双链DNA分子，约200kb，Ti质粒的结构上可分为毒性区、T-DNA区、结合转移区、复制起始区。
5、SD序列：位于起始密码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必须，一般长约3-9bp，位于起始密码子上游3-11碱基的位置，它与16S核糖体RNA的3端互补，控制翻译的起始。
6、反义链：下链或模板链，在基因的DNA双链中，转录时作为mRNA合成模板的那条单链。
7、基因文库：是指汇集了某一生物基因组DNA全部序列的重组体DNA群体（转化子群）。
具体来说，构建基因文库时，首先将代表某一生物类型的全部DNA片段分别插入到特定载体上，然后将重组载体导入到宿主细胞并获得大量的含有重组载体的克隆（一般为单菌落或噬菌斑）。
8、DNA探针：经放射性或非放射性物质标记已知的特定的DNA序列。
9、载体构建：用限制性酶切取目的基因，再用同一种限制酶切开质粒，用连接酶把目的基因和质粒连接起来的过程。
10、转化：将普通的质粒分子导入受体细胞的过程。
11、感受态细胞：经过处理后处于容易接受外源DNA状态的细胞。
12、多克隆位点：克隆载体中的一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。
13、选择标记基因：在基因工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基因，通常是一些抗生素抗性基因，比如对氨苄青霉素、四环素氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有抗性的基因，这样，通过在培养基中加入特定的抗生素就可以选择得到转化的细胞（菌）。
什么是PCR
聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR），是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法，也是分子生物学实验最常用到的一种方法。
根据适用对象的不同，又有荧光实时PCR、逆转录PCR等区别。
本专题详细介绍了PCR实验的基本原理、步骤及常见问题的解决办法。
第一部分:PCR的基础知识第一章:聚合酶链式反应(PCR)的历史和发展本文章内容包括:聚合酶链反应的历史回顾、聚合酶链反应相关技术的发展、其它体外核酸扩增技术、PCR技术的应用举例。
第一节：聚合酶链反应的历史回顾1、核酸体外扩增最早的设想由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基因”。
但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(1970年)Smith等发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们遗忘。
2、聚合酶链反应的发明直到1985年，美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR), 使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。
其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件。
开始是使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段来扩增人基因组中的特异片段。
由于该酶不耐热，因此，每次加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。
在操作多份标本时，这一过程耗时，费力，且易出错。
耐热DNA聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化，继而PE-Cetus公司推出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。
Mullis等因此项技术于1993年获得诺贝尔奖金。
二、聚合酶链反应相关技术的发展PCR及其相关技术的发展速度是惊人的。
国际上分别于1988年和1990年在美国和英国召开了第一届和第二届PCR技术专题研讨会。
引物的设计原则
1、引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不能大于38bp；2、引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5'到3’的下降形状也有利于引物与模板的结合；4、ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，3'端的ΔG值相对要低，且绝对值不要超过9，否则不利于正确引发反应，3'末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，但在-6时只达到40%，-8时少于20%，-10时接近于0；5、错配率一般不要超过100，否则会出现非目的条带。
但对于某些特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。
如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为340以上，而在错误位点的引发效率为110，并且不好找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的；6、Frq曲线为Oligo6软件新引进的一个指标，解释了序列片段存在的重复几率大小，选取引物时，应该用Frq值相对较低的片段；7、引物二聚体及发卡结构的能量的绝对值一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体而且会降低引物浓度从而导致PCR不能正常发生；8、3'端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3'端最后一个碱基最好不要是A或T，若是，会导致错配；9、以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5计算Tm值，也就是退火温度。
选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度，最好保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范围内；10、模板与稳定性较小的引物之间的Tm的差异越小，PCR的效率越高。
因为解链温度也取决于它的长度，如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用端的引物（16-18bp），如果产物长5kb，则用24bp的引物；11、在DNA测序和PCR中最好用5'末端稳定（GC含量多），而3'端不稳定（AT含量多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应；12、引物和产物之间的Tm值相差别太大，20摄氏度范围内最好。
微生物 通用引物设计-概述说明以及解释
微生物通用引物设计-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分的内容可以包括对微生物和引物设计的简要介绍。
以下是一个例子:引言部分会对微生物和引物设计进行概述。
微生物是一类单细胞或多细胞的微小生物，包括细菌、真菌、病毒和藻类等。
这些微生物广泛存在于地球上的各个环境中，包括土壤、水体、大气等。
微生物在生态系统中起着至关重要的作用，如参与养分循环、有机物降解、生物防治等。
此外，微生物还对人类和动植物的健康具有重要影响，既可以致病也可以为人类提供有益的功能。
引物是在分子生物学研究中常用的工具，用于扩增特定基因片段或序列。
引物的设计是进行分子生物学实验的关键步骤之一。
引物必须具有与目标序列互补的碱基序列，以便能够特异性地结合并扩增目标序列。
引物设计的好坏直接关系到实验结果的准确性和可靠性。
在本文中，我们将探讨微生物的重要性以及引物设计的意义和原则。
深入了解这些内容将有助于我们更好地理解微生物世界，加强对微生物的研究和应用。
在接下来的章节中，我们将详细讨论微生物的重要性和引物设计的意义，以及引物设计的一些基本原则。
通过阅读本文，读者将能够更好地理解微生物的重要性和引物设计的关键作用。
1.2 文章结构文章结构部分的内容如下：文章结构部分旨在介绍本篇长文的整体架构和章节划分，以及每个章节的内容安排。
本文共包括引言、正文和结论三个部分。
引言部分将在开始时对微生物通用引物设计进行概述，介绍其背景和相关概念。
接着，将详细说明文章的结构，列举各个章节的标题和内容，以让读者了解全文的组织结构。
正文部分是本篇长文的核心部分，将涵盖微生物的重要性、引物设计的意义以及引物设计的原则三个小节。
在微生物的重要性一节中，将介绍微生物在自然界和人类生活中的重要作用，以引起读者对微生物的关注。
在引物设计的意义一节中，将阐述设计合适的引物对于微生物研究的重要性，以及有效引物设计的意义。
在引物设计的原则一节中，将详细解释引物设计中需要考虑的因素和原则，并介绍一些常用的引物设计方法。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相别离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中参加0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心精品文档，你值得期待15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时参加的TRIZOL 试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中参加至少1ml的75%乙醇〔75%乙醇用DEPCH2O配制〕，清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm 离心5分钟。
⑤RNA枯燥小心吸去大局部乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中枯燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先参加无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA质量检测1〕紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释〔1:100〕后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定A260下读值为1表示40 µg RNA/ml。
样品RNA浓度(µg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数×40 µg/ml。
具体计算如下：RNA溶于40 µl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495µl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或0.84 µg/µl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 µl，剩余RNA总量为：35 µl ×0.84 µg/µl = 29.4 µg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值围1.8到2.1。
PCR技术原理实验步骤和应用
PCR技术原理实验步骤和应用PCR(聚合酶链式反应)是一种体外复制DNA的技术。
它是通过复制DNA片段的方式，将少量的DNA扩增成数百万份，以供后续实验使用。
PCR技术的原理、实验步骤和应用如下所述。
一、PCR技术原理：1.变性：在这一步骤中，DNA样本被加热至高温（95-98°C），使双链DNA变为单链DNA。
这一步将断裂氢键，使双链分离。
2.退火：在这一步骤中，PCR反应混液降温至适宜的温度（55-72°C），引入一对特异性引物。
引物是短的DNA片段，它们被设计成与所要扩增的DNA片段的两个互补序列相匹配。
3.延伸：在这一步骤中，混合物再次升温至酶的最佳工作温度（72°C），以便DNA聚合酶可以结合到引物的3'末端，并以引物作为模板合成其互补链。
这个步骤会在每个引物上生成新的DNA链，并将引物的3'末端作为延伸的起始位点。
通过重复这个循环，PCR可以迅速和大量地复制DNA片段。
每周期（cycle）都会形成一倍的DNA数目。
根据PCR循环数的增加，DNA的数量呈指数性增加。
这种复制DNA的方式使得科学家能够扩增特定的DNA片段。
二、PCR技术实验步骤：PCR实验的主要步骤包括：2.准备PCR反应混合液：PCR反应混合液包括模板DNA、引物、DNA 聚合酶、缓冲液、MgCl2、dNTPs等。
这些成分的比例需要根据具体实验的要求进行调整，以确保最佳的反应条件。
3.设置PCR反应程序：根据所需的PCR循环数和反应条件，设置PCR 反应程序。
这涉及到变性、退火和延伸步骤的温度和时间等参数。
4.进行PCR扩增：将PCR反应混合液加载到热循环仪中，进行PCR扩增反应。
热循环仪会自动进行循环升温和降温操作，以完成PCR循环的过程。
5.分析PCR产物：通过凝胶电泳、实时荧光PCR或测序等方法，分析PCR反应产物的大小、纯度和数量等。
6.保存PCR产物：PCR产物可以储存以备后续实验使用，如测序、克隆、表达等。
人教版高中生物选择性必修第3册 (基因工程) 基因工程(2)教案
联系实际案例，思考PCR在多方面的应用。
教案
教学基本信息
课题
PCR技术及其应用
学科
生物学
学段：高中
年级
二年级
教材
书名：《选修3现代生物科技专题》出版社：人民教育出版社
出版日期：2月
教学目标及教学重点、难点
教学目标：
1.通过分析实验室中进行PCR操作加入的各种成分，总结说出PCR所需要的引物、模板、酶、能量、原料和产物，能分析说明PCR成功的关键在于设计特异性引物，渗透科学思维。
教学过程(表格描述)
教学环节
主要教学活动
设置意图
导入：催生PCR技术的科研背景
简单介绍PCR的发明者，卡尔·穆利斯（Kary Mullis，1944-）生平。
很多生化学家都认为，PCR技术的获奖，大大地提高了诺奖本身的含金量。生物学可以分为两个时代，一个是没有PCR，一个是有PCR。
通过发明者的故事引入，简单明了，引发兴趣。
2.能根据视频直观体会并能概述出PCR的操作过程，并自主画出三个循环的示意图，进一步培养科学素养和科学思维。
3.分析具体的案例或例题，能够举例说明PCR的应用，并体会PCR发明者及应用中人类的智慧，体会PCR技术在现代分子生物学中的重要地位，体现社会责任感和生命观念的教育。
教学重点：PCR的过程。
教学难点：1.特异性引物的设计。2.PCR的过程。
一个循环：变性-退火-延伸。
请同学们观看视频，尝试画出PCR的三个循环过程。同时思考并回答下列问题：
1.几个循环后会出现一个目的基因的短片段？2.理论上讲，n个循环后，会出现多少个DNA分子？
例题2：引物的选择。
例题3：PCR的基本操作。
PCR技术的过程和意义
PCR技术的过程和意义一、PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应,将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火-—引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加,从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。
在环境检测中，靶核酸序列往往存在于—个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。
使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。
二、PCR技术的步骤PCR由变性—-退火-—延伸三个基本反应步骤构成：1、模板DNA的变性模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链,以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2、模板DNA与引物的退火(复性）模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3、引物的延伸DNA模板—-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性——退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
到达平台期(Plateau）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
三、PCR技术的意义1、特异性强PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。
微卫星引物筛选步骤
1．进行酶切用Vs pⅠ对四种鱼（GC、GS、NL和ZZ）基因组DNA（需基因组DNA浓度较高）进行酶切。
反应体系为：ddH2O 15µLVs pⅠbuffer 2µLVs pⅠ酶1µLDNA 2µL总体积20µL酶切在37℃反应3～4h即可，但是为了提高酶切效率可切4～6h。
PCR反应程序为：94℃ 5min，（94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 1min）×30，72℃ 10min，4℃ hold。
Vs pⅠ酶即（AseⅠ酶）：酶切识别位点为：5’A T↓T A A T 3’5’T A A T↑T A 3’AseⅠ酶的接头为：A1：5’CTC GTA GAC TGC GTA CC 3’A2：5’TAG GTA CGC AGT C 3’AseⅠ酶用的预扩增产物为：A3：5’CTC GTA GAC TGC GTA CCT AAT 3’2．接头制备用10µL A1（200µM）和10µL A2（200µM）混合，94℃ 3min后室温放置30min。
3．酶切片段与接头连接接头为A1和A2制备的接头，命名为AE。
连接反应体系如下：ddH2O 5µLT4 ligation酶0.5µLT4 buffer4µL酶切产物20µLA TP（10mM）0.3µLAE 1µL总体积30.8µL上述混合体系在16℃连接过夜。
10h左右。
4．连接产物PCR扩增对连接产物进行PCR扩增，每个样本做4管。
扩增引物为A3。
反应体系如下：ddH2O 14µL10×buffer 2.5µLMg2＋2µLdNTPs（10mM）0.5µLA3 1µLDNA（连接产物）5µLTaqE（2.5U/µL）0.2µL总体积25.2µLPCR反应程序为：（94℃ 30sec，56℃ 1min，72℃ 1min）×20，72℃ 10min，4℃ hold。
高中生物学选择性必修3基因工程的基本操作程序
行筛选。
②认识基因结构和功能的技术方法：___D_N_A__测__序____技术、___遗__传__序__列____
数据库、___序__列__比__对____工具。
3．获取目的基因的途径
新教材·生物（RJ） 选择性必修3
(1)___人__工__合__成转录
目的基因
转录
3．将目的基因导入受体细胞
新教材·生物（RJ） 选择性必修3
(1)导入植物细胞
①___花__粉__管__通__道__法____
a．用微量注射器将含目的基因的 DNA 溶液___直__接__注__入____子房中。
b．在植物受粉后的一段时间内，剪去柱头，将___D_N_A__溶__液____滴加在花
梳理教材
新教材·生物（RJ） 选择性必修3
1．构建基因表达载体的目的 (1)使目的基因在受体细胞中___稳__定__存__在____，并且可以_____遗__传______给 下一代。 (2)使目的基因能够_____表__达______和发挥作用。
2．基因表达载体的组成 启动子 终止子 标记
新教材·生物（RJ） 选择性必修3
2．(科学思维)判断 PCR 是否需要解旋酶和 DNA 聚合酶两种酶，并说明 判断的理由。
提示：不需要解旋酶。理由：PCR 中解旋是通过控制温度实现的，当 温度上升到 90 ℃以上时，DNA 的双螺旋结构被打开。需要 DNA 聚合酶。 理由：能将单个核苷酸加到已有的单链片段的 3′端上，但该酶需耐高温。
合的___2_种__引__物_____、4 种脱氧核苷酸和______耐_高__温__的___D_N__A__聚__合_____酶。
(4)每次循环的过程：变性→复性→延伸。
新教材·生物（RJ） 选择性必修3
PCR原理ppt课件
酶与模板DNA的趋近和接合变得困难 （5）错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发
4）PCR 反应液的配制 最后加入 DNA 聚合酶。
早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆 盖一层矿物油，防止水分蒸发。
热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决非特异性 扩增的问题。
5、反应体系
总体积
50-100 l
①缓冲液
②dNTP（底物）
③引物
④模板
⑤DNA聚合酶
①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂 10mM Tris·HCl （ pH8.3-9.0），1.5mM MgCl2， 50mM K+
⑤DNA聚合酶： 最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度75℃。
Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3‘-5’ 外切
活性的 PCR 酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
6.PCR技术的特点 1）高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍 30轮循环
2）随机扩增多态性（random ampification polymorphic DNA,RAPD ）
使用随机选择的核苷酸作为PCR反应体系中的引物，在较低 的复性温度下(36℃)进行PCR。由于非特异性引物与模板上的多 个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，因此经过PCR 扩增反应后可以产生多个PCR产物。经凝胶电泳可以将上述多个 PCR反应产物分离，这样多态性的产物通常称为随机扩增多态性 DNA(random ampification polymorphic DNA,RAPD)
pcr的基本原理及操作流程
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第十八章 分子标记辅助选择育种
二、分子标记辅助选择育种的遗传基础 1.分子标记辅助选择的根据
借助分子标记对目标性状的基因型进行选择，主要是
根据与目标基因的紧密连锁的对分子标记基因型的检测来
推测、获知目标基因的基因型。
2.应具备的主要条件
（1）与目标基因紧密连锁的分子标记。 （2）进行分子标记辅助育种需要建立饱和的分子标记图谱 并把目标基因定位于分子图谱上。 （3）简便快捷的标记检测方法。
第十八章 分子标记辅助选择育种
选择：是指在一个群体中选择符合育种目标要 求的基因型
我们还记得作物育种的任务吗？
按照人们的预定目标，采取相应的育种 程序和方法，诱发、创造和重组遗传变异， 选育出适应当地自然气候条件，符合社会、 生产需要，在遗传组成上相对稳定一致的优 良基因型，并繁育出足够数量个体（种子苗 木）供生产上应用。
广义而言，分子标记辅助选择不仅包括利用分 子标记进行优异种质的鉴定筛选、（自交系）亲本 间的亲缘关系分析、遗传多样性的保持和利用，而 且包括利用分子标记选择、转移、聚合目标基因等 育种的其它诸多环节，如植物系统发育关系分析、 品种注册、专利保护、体细胞杂种鉴定、新品种权 保护等。
二、分子标记辅助选择的优越性
（1）克服性状表现型鉴定的困难：有些性状的表现型鉴定 相当麻烦，在度量技术上难度较大、程序繁琐或因需要特 定的仪器和设备，费用太高。 （2）允许早期选择：在育种中，某些性状表现出来需要特
定的生长环境和一定生长周期。因此，在对这些性状鉴定
时必须考虑其表达的环境和等待一定生长时期，有时需要 异地加代和特异的环境条件等。用标记鉴定基因型，将不 需考虑（或等待）植株生长状况或环境条件，可以在早期 对幼苗（甚至对种子）进行检测。
就两个序列的比较而言，可指同一位点的不同等位基因之间个 别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等； 就遗传群体而言，指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种 不同的核苷酸且其出现频率大于1%（若出现频率低于1%， 则视为点突变，是不可能作为标记的）。 它又被称为第三代新型多态性标记。通常我们所说的 SNPs包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失（Indel） 目前，检测SNP的最佳方法是新近发展起来的DNA芯片技术。 DNA芯片又称生物集成模片、DNA阵列或寡核苷酸微芯片。
PCR技术的过程和意义
P C R技术的过程和意义-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KIIPCR技术的过程和意义一、PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。
在环境检测中，靶核酸序列往往存在于—个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。
使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。
二、PCR技术的步骤PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：1、模板DNA的变性模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2、模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3、引物的延伸DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
三、PCR技术的意义1、特异性强PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。
植物分子育种复习题纲加答案
永久性分离群体特点：RIL、DH、BIL群体等.群体中分离单位是株系，不同株系间存在基因型的差异，而株系内个体间的基因 型是相同且纯合的，是自交不分离的。
暂时性分离群体构建方法1）亲本的选配2)分离群体类型的选择暂时性分离群体：F2、F3、F4、BC、三交群体等3)群体大小 的确定
永久性分离群体构建方法1）亲本的选配2)分离群体类型的选择永久性分离群体：RIL、DH、BIL群体等3)群体大小的确定
分子育种的研究内容
1、标记辅助选择（MAS）育种：通过DNA标记技术来对某些重要农艺性状座位直接进行选择改良，由于可以考虑到多个生产 性状座位（目标性状，背景基因型选择），也有称为基因组扫描选择育种或基因组育种。
2、转基因育种（Transgenic Breeding）：通过基因转移技术将外源基因导入到某种植物的基因组上，从而达到改良重要农艺 性状（产量、品质、抗性）或非常规育种性状的目标。非常规育种性状（如生产人类药用蛋白，工业用酶等）
2、QTL定位的基本原理（基于标记的分析方法和基于性状的分析方法） 基于标记的分析法原理:通过检验标记的不同QTL基因型之间的差异来推知标记是否与QTL连锁。 基于性状的分析法原理:利用极端类型个体分析，将大多数的中间类型淘汰，则高值和低值两种极端表型的个体就可以明确地 区分开来，分成两组。
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1.2 采用酚-氯仿提取法提取模板DNA
1) 取固定的闭壳肌肉0.1g,在装有ddH 2O 的烧杯中漂洗。
置于装有670µl抽提/消化液【每管加
600µl STE+60-65µl 10% SDS+10µl 蛋白酶K （+2µl ß 巯基乙醇）】的1.5ml eppendorf 管中,用小剪刀剪成细末,颠倒混匀, 用2B 铅笔在管盖编号标记,封口膜封盖口,置水浴架上,于55℃恒温消化至看不到固体组分方为止。
然后取管，拆膜。
2) 往每管中加入终浓度约20µg/ml的RNA 酶,置于水浴锅中(55℃),关掉电源,放置30min,以
去掉RNA 。
3) 每管中加入饱和NaCl 溶液150µl,1100rpm,15min后,取上清液。
4) 每管加入700µl等体积酚(将酚和事先配好的氯仿异戊醇等体积混合,终比为 酚:氯仿:
异戊醇=25:24:1)。
5) 颠倒混匀10min,冷冻离心(4℃,12000rpm,10min)取上清。
6) 每管加入700µl氯仿异戊醇(氯仿:异戊醇=24:1),颠倒混匀5min,冷冻离心(4℃, 12000rpm,
10min )。
7) 取上清液于新的管中,每管快速悬空加入2倍体积冰
冻无水
乙醇(一般900-950µl),常温沉淀30min 后,冷冻离心(4℃,12000rpm,10min),弃上清。
8) 每管加入500µl 70% 乙醇溶液,用手摇动洗涤沉淀,
冷冻离
心(4℃, 12000rpm,10min),弃上清。
9) 将带有DNA 沉淀的 eppendorf 管倒置于新滤纸上,
室温干燥20min 。
每管加入150-200µl ddH 2O ,置4℃过夜,以溶解
DNA 沉淀。
DNA 模板的检测:取6µl ddH 2O +1µl 溴酚蓝+1µl 待测DNA 模板,于1．0%琼脂糖凝胶下电泳(电压120V,30min),用扫胶仪观察提取的DNA 的分子量并根据样品亮度和Marker 亮度的对比,估计的浓度进行稀释的样品。
最后调整到的DNA 浓度为20ng/µl。
1．3．2 引物处理
将上海生工合成的粉末状引物，离心后，按合成单的表注量分别加入0.1倍的TE 溶解，配成5uM 的工作液。
置于-20℃冰箱保存。
引物资料如表1。
1.4 引物的筛选
1.4.1 Mix-DNA 琼脂糖初筛选
图1 DNA 原始浓度图
随机选取三亚野生贝4个个体与印度养殖贝4个个体。
把每种贝4个个体的DNA 混合成Mix-DNA 作为模板用于所设计引物对的PCR 扩增，PCR 反应体系为15μl,其中包括20ng 的基因组DNA ，60pmol 的引物，1×Buffer,1.5mM MgCl 2 ,0.2mM dNTPs ，0.6U Taq DNA 聚合酶，最后ddH 2O 补至15μl 。
初始反应条件为94℃ 4min;94℃ 30s;60℃ 45s;72℃ 1min 30s;30cycles;72℃ 5min;4℃保存。
对于60℃退火温度下无扩增的引物采取梯度降温,条件依次为:57℃ 1.5mM MgCl 2→55℃ 1.5mMMgCl 2 → 50℃1.5mM MgCl 2→ 50℃ 2.0mM MgCl 2. PCR 产物于1.2%的琼脂糖下电泳检测，挑选能够扩增的引物对。
如图2所示。
筛选出的引物信息表参照我前面给你们的资料
1.4.2 单个个体DNA 琼脂糖第二次筛选
将Mix-DNA 下有扩增的引物对挑出,以上述4个三亚野生贝+4个印度养殖贝8个个体再次
进行PCR 条件的优化。
对于扩增条带过多引物对采取升高温度与降 低Mg 2+含量的方式进行优化;而对于无扩增或是扩增不完全的引物对采取降低温度与升高Mg 2+含量的方式进行优化。
PCR 产物于1.2%的琼脂糖下电泳检测，挑选出在8个体中均能够稳定扩增出条带并具有多态性的引物对。
如左图三所示。
1.4.3 非变性聚丙烯酰胺（PAGE ）第三次筛选 将琼脂糖下明确有扩增产物并出现多态性的引物(如右图三所示)进行PCR 扩增。
产物通过12%(ｗ/ｖ)聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）(配方见下表2),然后用 Gold View 染色检测其多态性，淘汰单态性微卫星引物，选取如右图所示肯有多态性的引物。
对多态性微卫星引物的电泳图谱使用Tanon 凝胶成像系统拍摄并存档记
录。
表2 12% PAGE 配方/100ml
1.5 引物在家
系中的PCR 扩增与电泳
29%丙烯酰胺+1%亚甲双丙烯酰胺
水 5×TBE 10%过硫酸铵(APS)
TEMED 40ml
39.3ml
20ml
0.7ml
66μl
图2 初筛结果图
图4 引物筛选PAGE
图
图3 8
个个体筛选图
经过三次筛选之后,我们得到59个具有多态性的微卫星位点。
选取其中的10个用于扩增杂交家系的父母本及子代。
PCR 反应条件为:94℃ 4min;94℃ 30s;退火45s;72℃
1min30s;28cycles;72℃ 5min;4℃保存。
各引物退火温度详见表1。
反应体系为15μl,其中包括20ngDNA ，3pmol 的上游引物加3pmol 的下游引物;1×Buffer,1.5mM MgCl 2 ,0.2mM dNTPs ；0.6U Taq DNA 聚合酶，最后ddH 2O 补至15μl 。
PCR 扩增的产物用12%非变性的聚丙烯酰胺电泳(PAGE)(配方如上表2),Gold View 核酸染液进行染色15min,Tanon 凝胶成像系统进行拍照存档。
1.6 数据统计方法
为了获得微卫星位点和群体的多态性变化情况，我们利用以下软件分析:
(1) GENEPOP 3.4（Raymond and Rousser,1995）分析Hardy-Weinberg 平衡(Hardy-Weinberg
equilibrium, HWE)。
(2) 用Arlequin 3.01软件统计观测杂合度（observed heterozygosities,Ho ）和期望杂
合度（expected heterozygosities,He ）;
(3) 用Fstat for windows v2.9.3软件分析等位基因丰度Rs 值与固定指数Fis 值。
(4) PopGen 软件 统计各群体内多态位点数和多态位点比例以及Shannon's Information
index [Lewontin (1972)]香农多态信息指数及群体间的遗传距离
图5 引物在家系中扩增的PAGE 图。