测定裸大麦中生育酚和生育三烯酚的正相高效液相色谱法

第21卷第2期分析测试学报V ol.21N o.2

2002年3月FENXI CESHI XUE BAO(Journal of Instrum ental Anal y sis)M ar.2002

测定裸大麦中生育酚和生育三烯酚的

正相高效液相色谱法

夏向东1,吕飞杰1,赵环环2,台建祥1,付勤1

(1.中国农业科学院作物育种栽培研究所加工室,北京100081;2.中国农业大学作物学院,北京100094)

摘要:建立了同时测定裸大麦中α-、β-、δ-生育酚和α-、γ-、δ-生育三烯酚以及γ-生育酚+β-生育三烯酚含量的正相高效液相色谱法;采用国产Y WG-S iO2柱(250mm×4mm I D,5μm),V正己烷∶V异丙醇=99∶1体系为流动相,流速为1.2m L/m in,荧光检测器检测,激发波长290nm,发射波长330nm,并采用正交设计法优化样品的皂化工艺。

关键词:高效液相色谱;裸大麦;生育酚;生育三烯酚;皂化

中图分类号:Q949.714.2文献标识码:A文章编号:1004-4957(2002)02-0018-04

维生素E(VE)是生育酚(toco p herol,简写T)和生育三烯酚(tocotrienol,简写T3)以及具有D-α-生育酚生理活性的衍生物(如酯类等)的总称。目前已经从植物资源中分离出4种生育酚(α、β、γ、δ)和4种生育三烯酚(α、β、γ、δ)[1]。由于生育酚研究较早,生理功能也得到认可,并且已经广泛应用,因此通常所说的维生素E就是指生育酚,国家标准中规定的维生素E含量也以α-生育酚为标准[2]。

随着科学研究的逐步深入,已经证明维生素E的上述8种同系物的生理功能及活性是有区别的,尤其近10年来已经有越来越多的证据表明生育三烯酚在抗氧化性能、降低胆固醇、抑制癌症等方面具有独特的生理功能,并且在某些方面具有比生育酚更优越的生理功能[3]。因此,H endrich等[4]认为应当把生育三烯酚和生育酚区分开来,并把生育三烯酚、异黄酮、类胡萝卜素作为人体所需的新营养素。由于生育酚和生育三烯酚结构和性质相近,给分析检测带来难度,目前国内还未见生育三烯酚检测方法的报道,本文报道同时测定生育酚和生育三烯酚的正相高效液相色谱法。

1实验部分

1.1仪器与试剂

美国W aters高效液相色谱仪:W aters600色谱泵,W aters474荧光检测器,M illennium32色谱数据

收稿日期:2001-05-22;修回日期:2002-01-11

基金项目:中国农业科学院西部大开发基金资助项目(2000-24)

作者简介:夏向东(1974-),男,山东邹平人,博士研究生.

(上接17页)

Determ ination of Cam p tothecin in Leaves of

Cam p totheca Acuminata Decne.b y HPLC

Y AN X iu-fen g,W ANG Y an g,Y U T ao,ZHANG Y u-hon g,YIN Li-j un

(O p en Research Laborator y of F orest P lant E colo gy,N ortheast F orestr y Universit y,Haerbin150040,China)

Abstract:A sim p le,ra p id and sensitive m ethod for the determ ination of cam p tothecin in leaves of Cam p totheca acuminata Decne.w as established.Cam p tothecin in the leaves w as ultrasonicall y extracted w ith61%alcohol at50℃for10m in,and determ ined b y hi g h p erform ance li q uid chrom ato g ra p h y.T he cam p tothecin w as se p arated on a T echs p here ODS column(25cm×4.6mm I D,5μm)at25℃,usin g acetonitrile-w ater(4∶6b y v olum e) s y stem w ith1.0m L/m in as the m obile p hase,and detected at254nm.Relative standard deviation of2.5%(n= 6)and avera g e recover y of96%for the m ethod w ere found.

K e y words:HP LC;Cam p totheca acuminata Decne.;Leaves;Cam p tothecin

图1标准品(A )和裸大麦样品(B )的色谱图

F i g .1

Chrom ato g rams of standard sam p le (A )and hull-less

barle y sam p le (B )

1.α-生育酚(α-T );

2.α-生育三烯酚(α-T 3);

3.β-生育酚(β-T );

4.β-生育三烯酚+γ-生育酚(β-T 3+γ-T );

5.γ-生育三烯酚(γ-T 3);

6.δ-生育酚(δ-T );

7.δ-生育三烯酚(δ-T 3)R ○

处理系统;旋转蒸发器;小型粉碎机;正己烷为色谱纯(F isher 公司),实验用水为蒸馏水,其它试剂

均为分析纯;α-、β-、γ-、δ-生育酚和α-、β-、γ-、δ-生育三烯酚标准品购自M erck 公司,纯度在95%以上;裸大麦样品由西藏农牧科学院提供。

1.2色谱条件

北京分析仪器厂产Y WG -S iO 2柱(250mm ×4mm I D ,5μm );V 正己烷∶V 异丙醇=99∶1体系为流动相,流速1.2m L/m in ;荧光检测器,激发波长290nm ,发射波长330nm;进样量10μL 。

1.3

标准溶液的配制

将标样50.0m g 用正己烷溶解并转移至50m L 棕色容量瓶中,正己烷定容,混匀,充N 2(纯度为99.999%),封口,在-30℃保存。贮备液中相应标样的含量为1.0g /L 。

根据需要用正己烷将标准贮备液稀释至适宜含量,得到标准工作液和混合标准工作液。1.4样品制备方法

1.4.1实验设计采用L 9(34

)正交表,进行无水乙醇加入量、600g /L K OH 溶液加入量、抗坏血酸加入量及皂化时间4因素3水平正交实验。

1.4.2制备步骤称取5.0g 磨碎的均匀裸大麦粉(精确到0.001g ),置于圆底烧瓶中,按照实验设计加入一定量的抗坏血酸和无水乙醇,装上冷凝管并通入N 2(纯度为99.999%),于80℃水浴加热5m in ,然后加入一定量的600g /L K OH 溶液,混合均匀,在N 2保护下皂化一定时间;皂化结束时加入无水乙酸中和至中性,迅速用水冷却;向圆底烧瓶中加入10m L 蒸馏水和20m L 石油醚,振荡,转移入离心管中,3000g 下离心15m in ,将上清液转移入250m L 分液漏斗中,收集石油醚相,水相再用石油醚提取2次,每次用20m L ,合并3次提取的石油醚。石油醚提取液用5.0g 无水硫酸钠脱水,

50℃水浴减压浓缩,用正己烷转移浓缩液至10m L 棕色容量瓶中,并用正己烷定容至刻度,充N 2,封

口,在-30℃保存待测。测定前提取液经0.45μm 微孔滤膜过滤。

2

结果与分析

2.1

检测波长的选择

参照文献[5,6],同时比较了激发波长290nm 、295nm ,发射波长325nm 、330nm 等几个不同波长的测定效果,结果表明:在激发波长290nm 、发射波长330nm 下检测灵敏度较高,对同时测定生育酚和生育三烯酚较合适,因此选用激发波长290

nm ,发射波长330nm 为检测波长。2.2

色谱柱的选择

采用N ova-p ak silica (150mm ×3.9mm )短柱同时测定生育酚和生育三烯酚分离不理想,色谱峰严重重叠;改用国产Y WG -S iO 2长柱(250mm ×4mm ),除β-生育三烯酚和γ-生育酚色谱峰完全重叠外,α-、β

-、δ-生育酚和α-、γ-、δ-生育三烯酚可以分开,分离效果较好,故采用此柱。2.3

流速的选择

选用0.6、0.8、1.0、1.2m L/m in 不同流速进行实验,在此范围内,流速的变化对分离效果影响不大,考虑到分离时间,选用1.2m L/m in ,在此色谱条件下各种标样的保留时间见表1。2.4标准曲线的建立

精密配制0～20m g /L 的生育酚和生育三烯酚的混合标准溶液,按上述色谱条件进样,以峰面积Y 为纵坐标,以质量浓度X (m g /L )为横坐标,得7条标准曲线,曲线的线性回归方程列于表1。2.5精密度实验与加标回收率实验

向已知生育酚和生育三烯酚含量的样品中添加相同含量的混合标准溶液,按照1.4方法制备裸大麦样品(n =6),各自进样10μL ,根据测得样品中各成分的质量浓度分别计算相应的精密度和加标回收率,结果列于表2。

第2期夏向东等:测定裸大麦中生育酚和生育三烯酚的正相高效液相色谱法

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