以pET-28a表达载体

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以pET-28a表达载体

• 重组蛋白的诱导
（1）挑一个转化重组质粒的单菌落接种于LB液体培养基中（含 100μg/m卡那霉素和），于37℃过夜培养。（2）取1ml过夜培养物，转接于100ml含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃培养1.5～2小时至对数生长期。（3）在培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.2 mM，按照预先建立的最佳表达条件进行诱导表达。（4）1200 rpm，离心2min，收集菌体。（5）弃上清，向沉淀中加入500ml Starting buffer（20mM磷酸缓冲液（Na2HPO4和NaH2PO4），200mM NaCl，10%甘油，pH 7.0），充分悬浮洗涤菌体。（6）12000 rpm，离心2min，收集菌体。（7）向沉淀中加入15ml的starting buffer，重悬菌体。（8）冰浴条件下超声波处理3min，每处理30sec间隔1min使菌液冷却，输出强度为5～6，频率为60～70％，处理时以不发生气泡，不过热为准，以菌液变清晰为终止标准。（9）12000 rpm，4℃离心20min，将上清移到干净灭过菌的50ml离心管。SDS-PAGE分析蛋白的表达情况。若目的蛋白分布在上清中，继续进行下面的纯化操作
12融合蛋白的切割得到靶蛋白化学方法特异性识别特定的氨基酸残基或者一组氨基酸残基例如氰溴化物在met残基后切割甲酸在asppro后切割酶学方法在靶蛋白和运载蛋白连接区设计特异xa因子胰酶肠激酶凝血酶胶原酶tev蛋白酶等等13不溶性形成包涵体蛋白的处理破碎超声压力冻融溶菌酶低温低速离心用含edta变性剂dnase洗涤出去杂蛋白和核酸体外折叠形成有天然或近天然构象恢复活性蛋白质在大肠杆菌中高水平表达时易形成相差显微镜下可见的细胞质颗粒或包涵体包涵体很容易与可溶性的蛋白和膜结合蛋白分离14以pet28a表达载体克隆受体菌为ecolidh5表达宿主为ecolibl21de3为例简单介绍实验过程构建重组表达载体1载体酶切

重组蛋白实验报告

一、实验目的本实验旨在通过基因工程手段，构建表达重组蛋白的载体，并在宿主细胞中进行表达，随后对表达的重组蛋白进行纯化，以获得高纯度的目标蛋白。

二、实验材料1. 实验试剂：- pET-28a载体- 目的基因片段- restriction enzymes (EcoRI, BamHI)- T4 DNA连接酶- DNA聚合酶- 限制性内切酶缓冲液- DNA分子量标准- 质粒提取试剂盒- 诱导剂 (IPTG)- 细胞培养试剂（DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶等）- 纯化柱（Ni柱）2. 实验仪器：- PCR仪- 紫外分光光度计- 凝胶电泳仪- Western Blot系统- 离心机- 流式细胞仪三、实验方法1. 基因克隆：- 使用PCR技术扩增目的基因片段，并使用EcoRI和BamHI进行酶切。

- 将酶切后的目的基因片段与pET-28a载体连接，并转化大肠杆菌感受态细胞。

- 对转化后的细胞进行PCR检测，筛选出含有目的基因的阳性克隆。

2. 重组蛋白表达：- 将阳性克隆接种于含抗生素的培养基中，培养至对数生长期。

- 加入IPTG诱导剂，调节IPTG浓度至0.1 mM，诱导表达重组蛋白。

- 收集细胞裂解物，进行SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的表达情况。

3. 重组蛋白纯化：- 使用Ni柱对细胞裂解物进行亲和纯化。

- 通过梯度洗脱，收集含有重组蛋白的洗脱液。

- 使用Western Blot检测纯化蛋白的纯度。

4. 重组蛋白活性检测：- 使用流式细胞仪检测重组蛋白的活性，以验证其功能。

四、实验结果1. 基因克隆：- 成功构建了含有目的基因的重组质粒，经PCR和酶切验证无误。

2. 重组蛋白表达：- 在IPTG诱导下，成功表达出重组蛋白，SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白条带清晰。

3. 重组蛋白纯化：- 使用Ni柱纯化后，重组蛋白的纯度达到90%以上。

4. 重组蛋白活性检测：- 通过流式细胞仪检测，重组蛋白具有良好的活性。

pet28a通用引物序列

pet28a通用引物序列
Pet28a 是一种常用的原核高效表达载体，通常用于大肠杆菌中表达融合蛋白。

为了在大肠杆菌中克隆 Pet28a 载体上的特定基因，需要使用 Pet28a 的通用引物。

Pet28a 的通用引物是 T7 正向和反向引物。

T7 正向引物通常位于基因的上游区域，用于向载体的 DNA 序列中引入 T7 启动子，以便在宿主细胞中的表达。

T7 反向引物通常位于基因的下游区域，用于向 DNA 序列中引入终止子，以便在表达过程中产生合适的肽链。

Pet28a 通用引物的序列如下:
- T7 正向引物:5"-CTAAGTAACATAAGGAGAAGGAGAA-3"
- T7 反向引物:5"-CTAAGGAAAAAAGAAAAACTGA-3"
请注意，这些引物只能在特定的细菌中使用，并且应该在进行克隆之前进行优化。

pet28a质粒序列

pet28a质粒序列PET28a质粒是一种常用的表达载体，用于在大肠杆菌中高效表达蛋白质。

它是由Novagen公司设计的，具有以下主要特点：1. 载体大小：PET28a质粒的长度为5362bp，包含多个功能区域，如起始子、启动子、多个限制酶切位点和选择标记等。

2. 选择标记：PET28a质粒含有两个选择标记，即抗生素抗性基因和His6标签。

其中，抗生素抗性基因为kanamycin，可以在含有该基因的菌落中生长，而缺少该基因的菌落则会被抑制。

His6标签则可以方便地用于蛋白质纯化和检测。

3. 定向表达：PET28a质粒的启动子和起始子均来自于T7菌噬素，可以实现对目标基因的高水平定向表达。

4. 多克隆位点：PET28a质粒中含有多个限制酶切位点，可以方便地进行多克隆和重组。

PET28a质粒序列具体如下：5' - CCC AAA TAC GGT TTA GAG C - 3' (T7 promoter)5' - GGA TCC CAT ATG GTA GAA CCC GAG GAC GAT GGC - 3' (NdeI site, start codon, His6 tag)5' - GGA TCC TTA AAC CTG GTA CAC CAG GAA GAA GAT G - 3' (BamHI site)5' - GGA TCC TCA GCG TCG GAC CGT CGA GAC TCG AGC - 3' (SalI site)5' - GGA TCC CTC GAG CAT GGA GGT GGA TGA TGC - 3' (XhoI site, stop codon)5' - GGA TCC GAA TTC TTA TTA GCG GCC GCT TAA TTA A - 3' (EcoRI site, T7 terminator)注意：以上序列仅为PET28a质粒的主要部分，不包括所有功能区域。

pET-28b(+)载体

pET-28b（+）载体（基本信息、图谱和多克隆位点信息、简介、序列）1.pET28a载体基本信息：质粒类型：大肠杆菌表达载体表达水平：高克隆方法：多克隆位点，限制性内切酶载体大小：5368bp5' 测序引物及序列: T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'3' 测序引物序列: T7t: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'载体标签: N-His, N-Thrombin, N-T7, C-His载体抗性：Kanamycin (卡那霉素)N端含有凝血酶（Thrombin）蛋白酶位切点；pET28a,b,c的差异主要存在于多克隆位点处病毒类型：非病毒2.pET28a载体质粒图谱和多克隆位点信息：3.pET28a载体简介pET-28a-c(+)载体带有一个N端的His/Thrombin/T7蛋白标签，同时含有一个可以选择的C端His标签。

pET28a载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。

注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。

T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。

质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列(Cat. No. 69337-3)的作用下终止蛋白翻译。

3.pET28a载体简介pET-28a-c(+)载体带有一个N端的His/Thrombin/T7蛋白标签，同时N端含有凝血酶（Thrombin）蛋白酶位切点；pET28a,b,c的差异主要存在于多克隆位点处载体描述：The pET-28a-c(+) vectors carry an N-terminal His•Tag®/ thrombin/ T7•Tag® configuration plus an optional C-terminal His•Tag sequence. Unique sites are shown on the circle map. Note that the sequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymeraseis shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage will produce virions containingsingle-stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, single stranded sequencing should be performed using the T7 terminator primer (Cat. No. 69337-3).PET-28a-c(+) 向量进行 N-末端His•Tag® / 凝血酶/ T7•Tag® 配置再加上可选的 C-末端His•Tag 序列。

人白介素-2重组基因的T载体和pET28a表达载体的构建

一
步的工作提供了基础．
关键词：人白介素２基因；载体；列鉴定序
中图分类号：３３１Ｑ４．文献标识码：Ａ文章编号：０５８３（０８０ — ４４１０ —０６２０）２０８００
功，其成为临床药物的重要候选因子．使人体Ｉ一Ｌ２与肿瘤、重联合免疫缺陷综合征、ｅｅｆ合征、严Ｎｚｏ综ｌ
ＡＤＩＳ病、型糖尿病、Ｉ肺结核、类风湿关节炎、ｊｒｎ综合征、神分裂症、Ｓｏｅｇ精系统性红斑狼疮、骨髓移植后排斥反应等多种疾病有关．
维普资讯
收稿日期：０ — １９２７１－０２
作者简介：妙英（９８，（古族）内蒙古呼和浩特人，央民族大学生命与环境科学学院，研究员，究方云１６一）女蒙，中副研向：防医学，因工程药物构建．预基
维普资讯
２００８≈ ５ｆｊ
｝央民族大学学报（Ｊ自然科学版）
ＪｕｎｌｆｉＵ（ａｒｃｎｅｄｔｎｏｒａｏｌＣＮＮｔａＳｉｃｓＥｉｏ）ｔｅｕｌｅｉ
Ｍａ２０ｙ，０８Ｖ１１Ｎ２ｏ．７ｏ．
３．圩肃农业大学农学院，｝肃兰州７０７）十３００
摘
要：从人单核细胞中提取总ＲＡ，用ＲＣＮ利ＴＰＲ方法构建ｃＮ — ＲＡ杂交链，后用人白介素一因ＤＡｍＮ然２基

碱裂解法提取表达质粒载体pET

碱裂解法提取表达质粒载体pET-28a及电泳鉴定1. 实验原理可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子叫载体（vector）。

细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。

与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。

大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。

一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单一位点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。

常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。

为表达蛋白质设计的载体称为表达载体(expression vector)。

pET系统是有史以来在大肠杆菌中克隆表达重组蛋白功能最强大的系统之一，有一系列类似的表达载体。

如表达载体pET28a(见图3)，含有：T7噬菌体启动子、核糖体结合位点、乳糖操纵子、乳糖阻遏子序列（lacI）、 His6标签序列、凝血酶切割位点、多克隆位点、T7噬菌体终止子及pBR322复制子、f1噬菌体复制子、卡那霉素筛选标记序列等。

pET表达系统中的受体菌为能够产生T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)。

碱变性法抽提质粒DNA主要包括收集并悬浮细菌菌体、裂解细胞、将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA以纯化质粒DNA。

我们购买的质粒提取试剂盒的原理也是碱解法裂解细菌，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。

pet28a原核表达载体的表达原理

pet28a原核表达载体的表达原理Pet28a原核表达载体是一种常用于原核生物中蛋白质表达的载体。

它的表达原理基于其构建的特点和作用机制。

Pet28a原核表达载体的构建特点是将多个功能元件组合在一起，以实现高效的蛋白质表达。

主要包括启动子、编码序列、标签序列和终止子等。

Pet28a的启动子是一段能够识别并与细菌RNA聚合酶结合的序列，用来启动基因的转录。

细菌RNA聚合酶在启动子的识别下，能够将DNA的信息转录成mRNA，作为蛋白质合成的模板。

编码序列是Pet28a中最重要的部分，它包含了目标蛋白质的编码信息。

编码序列是由一串三个核苷酸组成的密码子序列，每个密码子对应一个氨基酸。

在细胞内，mRNA会被核糖体识别并通过翻译作用将其转化为氨基酸序列，从而合成出目标蛋白质。

Pet28a载体中还包含了标签序列，用于方便对目标蛋白质进行检测和纯化。

常用的标签序列有His标签和GST标签。

His标签是一段连续的组氨酸序列，能够与金属离子亲和层析柱结合，实现目标蛋白质的纯化。

GST标签是谷胱甘肽S-转移酶标签，能够与谷胱甘肽结合，实现目标蛋白质的纯化。

Pet28a载体的终止子是一段能够识别并终止转录的序列。

在RNA聚合酶到达终止子时，转录过程会终止，mRNA链被释放出来，进一步被核糖体翻译为蛋白质。

总结起来，Pet28a原核表达载体的表达原理是通过启动子识别和RNA聚合酶的转录作用，将编码序列转录为mRNA。

然后，mRNA通过核糖体的翻译作用，合成目标蛋白质。

最后，通过标签序列的存在，可以对目标蛋白质进行检测和纯化。

Pet28a原核表达载体的表达原理使其成为研究人员在原核生物中高效表达蛋白质的重要工具。

它的构建特点和作用机制为研究人员提供了方便、快捷和可靠的蛋白质表达平台。

通过对Pet28a载体的合理设计和选择，可以实现目标蛋白质的高效表达，为生物学研究和工业生产提供了有力支持。

载体pET28a map

Eag I
thrombin
BamH I EcoR I Sac I Sal I Hind III Not I Xho I
His•Tag
ATGGGTCGCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC pET-28a(+)
BbvI
27
BccI
14
Bce83I 6
21 1937 2107 3315 3613
3854
BcefI
6
642 983 1610 3726 4745
5153
BcgI
9
160 194 228 1415 1449
1949 1983 2801 2835
BclI
1
1137
BfaI
7
70 232 336 2238 3719
DdeI
11
DpnI
21
DraIII 1
5127
DrdI
3
2917 3332 5082
DrdII 2
846 5132
DsaI
3
296 560 2196
EaeI
4
166 431 563 1797
EagI
1
166
EarI
3
741 3108 4239
EciI
3
900 3298 3444
Eco47III 3
pET-28a(+) sequence landmarks T7 promoter T7 transcription start His•Tag coding sequence T7•Tag coding sequence Multiple cloning sites (BamH I - Xho I) His•Tag coding sequence T7 terminator lacI coding sequence pBR322 origin Kan coding sequence f1 origin

以pET-28a表达载体

基因治疗载体
pet-28a表达载体可以作为基因治疗的载体之一，将治疗基因插入表达载体中，通过注射等方式导入患者体内，实现治疗目的。
VS
基因敲除和敲入
利用pet-28a表达载体可以实现基因敲除和敲入，通过将特定基因插入表达载体中，在细菌细胞内表达出具有特定功能的蛋白，实现基因敲除或敲入的目的。
pet-28a表达载体的表达机制
T7启动子
pet-28a表达载体中的T7启动子是一种RNA聚合酶的识别位点，能够高效转录基因。
翻译机制
在pet-28a表达载体中，外源基因被转录成mRNA，然后在核糖体上进行翻译，形成蛋白质。
蛋白质纯化
通过融合蛋白标签，使用亲和层析等方法对表达的蛋白质进行纯化。
以pet-28a表达载体为主题的PPT大纲
目录
• 介绍 • pet-28a表达载体的原理 • pet-28a表达载体的构建与优化 • pet-28a表达载体的应用实例 • 展望与未来发展方向
01
介绍
pet-28a表达载体的定义
01
02
03
pet-28a表达载体是一种常用的原核表达载体，属于pET系列载体。
05
展望与未来发展方向
pet-28a表达载体的改进与优化方向
1 2
提高表达效率
通过基因工程技术手段，优化pet-28a表达载体的启动子、增强子和终止子等元件，提高目的基因的表达水平。
扩大应用范围
针对不同物种和细胞类型，对pet-28a表达载体进行改造和优化，以适应更广泛的应用场景。
3
安全性提升
生物科学研究领域
pet-28a表达载体作为一种重要的基因操作工具，在生物科学研究领域具有广泛的应用前景。例如，可用于研究基因功能、细胞信号转导、组织器官发育等生物学过程。

融合蛋白分析实验报告

一、实验目的本研究旨在分析融合蛋白的表达、纯化及其生物学活性，为后续研究融合蛋白的应用提供基础数据。

二、实验材料1. 融合蛋白表达载体：pET-28a（含目的基因融合蛋白）2. 菌株：BL21（DE3）大肠杆菌3. 试剂：IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、DNase I、蛋白酶K、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、Western Blot试剂盒、小鼠抗目的蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗等4. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、Western Blot系统、紫外分光光度计等三、实验方法1. 融合蛋白表达将pET-28a表达载体转化至BL21（DE3）大肠杆菌中，挑选阳性克隆，在含IPTG 的LB培养基中培养至对数生长期，诱导表达融合蛋白。

2. 融合蛋白纯化收集诱导后的菌体，进行超声破碎，离心收集上清。

使用Ni柱亲和纯化上清中的融合蛋白，收集洗脱液，进行SDS-PAGE分析。

3. 融合蛋白鉴定将纯化的融合蛋白进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，观察目的蛋白条带。

使用Western Blot方法，将融合蛋白与小鼠抗目的蛋白单克隆抗体进行反应，检测目的蛋白的表达。

4. 融合蛋白生物学活性检测通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测融合蛋白的生物学活性。

四、实验结果1. 融合蛋白表达在IPTG诱导下，目的蛋白在BL21（DE3）大肠杆菌中成功表达，分子量约为50kDa，与预期相符。

2. 融合蛋白纯化使用Ni柱亲和纯化目的蛋白，纯度达到90%以上。

3. 融合蛋白鉴定SDS-PAGE电泳结果显示，目的蛋白条带清晰，与预期分子量相符。

Western Blot检测结果进一步验证了目的蛋白的表达。

4. 融合蛋白生物学活性检测ELISA实验结果显示，融合蛋白具有生物学活性。

五、实验讨论1. 融合蛋白表达本研究成功在BL21（DE3）大肠杆菌中表达了目的蛋白，表达水平较高，为后续研究提供了丰富的蛋白材料。

重组pET28α-X基因构建与表达实验

重组pET28α-X基因构建与表达一、 DNA的连接1、原理本实验将表达载体和PCR产物X进行双酶切，经琼脂糖凝胶后，割胶分离纯化的目的基因和线性化质粒，用T4DNA连接酶连接成表达融合蛋白的重组质粒。

（1）灭菌双蒸水（2）DNA：双酶切后的基因片段及线性质粒（3）T4DNA连接酶：350U/μL（4）10×连接酶缓冲液：660mmol/L Tris-HCl(pH7.6)66 mmol/L MgCl2100 mmol/L DTT1mmol/L ATP2、方法（1）5mL离心管中加入以下成分：ddH2O 12μLX-DNA 3μLpET28a-DNA 2μL10×Buffer 2μLT4 ligase 1μL（2）14-16℃水浴中过夜。

（3）65℃水浴10min，灭活连接酶。

二、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化1、原理经氯化钙处理的大肠杆菌，受短暂的热激后，可形成易于接受环状质粒DNA的感受态细胞。

由于不同的质粒可带有不同的抗生素抗性基因，应根据转化菌的耐药特性进行筛选。

2、材料（1） LB培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母粉，5gNaCl加水至950mL，用1mol/L NaOH调节pH至7.0，定容至1000mL，高压灭菌。

（2）LK培养基：在LB培养基中加入终浓度50μg/mL的卡那霉素。

（3）LK平皿：1.5g琼脂，100mL LB培养基，高压灭菌，待其降温至55℃时，加卡那霉素至50μg/mL，倾倒平皿，置室温一天，使水分吸收，4℃保存。

（4）100mmol/L CaCl2,用双蒸水配制，高压灭菌，4℃保存。

3、小量制备大肠杆菌感受态细胞（1）接种大肠杆菌DH5α和BL21单菌落于2mL LB培养基，37℃振荡培养过夜。

（2）转种1 mL过夜培养菌液于20mL LB培养基中。

（3）37℃培养至细菌密度OD600为0.4（约2.5h）。

（4）取1 mL菌液至1.5 mL离心管，4000rpm，2min,弃上清液。

重组pET28α-X基因构建与表达实验

（3）65℃水浴10min，灭活连接酶。

二、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化1、原理经氯化钙处理的大肠杆菌，受短暂的热激后，可形成易于接受环状质粒DNA的感受态细胞。

由于不同的质粒可带有不同的抗生素抗性基因，应根据转化菌的耐药特性进行筛选。

2、材料（1） LB培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母粉，5gNaCl加水至950mL，用1mol/L NaOH调节pH至7.0，定容至1000mL，高压灭菌。

（2）LK培养基：在LB培养基中加入终浓度50μg/mL的卡那霉素。

（3）LK平皿：1.5g琼脂，100mL LB培养基，高压灭菌，待其降温至55℃时，加卡那霉素至50μg/mL，倾倒平皿，置室温一天，使水分吸收，4℃保存。

（4）100mmol/L CaCl2,用双蒸水配制，高压灭菌，4℃保存。

3、小量制备大肠杆菌感受态细胞（1）接种大肠杆菌DH5α和BL21单菌落于2mL LB培养基，37℃振荡培养过夜。

（2）转种1 mL过夜培养菌液于20mL LB培养基中。

（3）37℃培养至细菌密度OD600为0.4（约2.5h）。

（4）取1 mL菌液至1.5 mL离心管，4000rpm，2min,弃上清液。

pet28a 摩尔质量

pet28a 摩尔质量Pet28a是目前科研领域比较常用的载体之一，主要用于表达酵母、真核及大肠杆菌等不同类型的重组蛋白。

作为一个常用载体，pet28a 摩尔质量也是研究人员亟待了解的内容。

1、概念介绍摩尔质量是指物质的相对分子质量或相对原子质量，单位为g/mol。

相对分子质量是物质的分子质量与单位质量比水分子的质量之比，远居生物学和化学实验中使用，以帮助研究人员了解化学反应的数量关系及为计算重量和浓度提供指导。

2、Pet28a分子量测定方法分子量测定是一项比较重要的研究技术，对于鉴定pet28a的分子量，当前有以下两种常用方法：（1）SDS-PAGE法SDS-PAGE法是一种以聚丙烯酰胺凝胶为载体，通过电泳对样品进行分离的方法。

在这种方法中，待测样品与SDS（吐温20）混合后，可以将样品上下两端浸入电泳缓冲液中，并经过一定电压电泳移动，进而实现分子的分离。

之后使用共染色法，将凝胶上的蛋白染色，最后通过色谱图可以确定pet28a的分子量。

（2）质谱法质谱法是一个利用分子重量或比质量对样品进行鉴定的技术。

在此方法中，研究人员通过质谱仪对目标样品进行质量分析，进而测定pet28a的分子重量。

质谱法通常为需要同时分析许多蛋白质的实验室所用的高通量方法。

3、Pet28a分子量约为584磅/分子根据已有的研究，pet28a分子量约为584磅/分子，换算成摩尔质量为超过60,000g/mol。

这意味着，当研究人员使用pet28a表达重组蛋白时，可能需要调整蛋白的表达和纯化方式，以避免影响实验效果。

总之，pet28a 作为研究领域中常用的载体之一，了解其摩尔量具有非常重要的意义。

通过对这一参数的确定，研究人员可以为更准确地安排实验提供指导。

同时，为了更好地支持研究工作，值得大家在平时的实验中深入了解摩尔质量及如何进行分子量测定。

pET28a-OFP使用说明

pET28a-OFP使⽤说明pET28a-OFPpET28a-OFP pET 系列表达载体基本信息：启动⼦:T7/lac 复制⼦:ColE1 ori ，F1 ori 终⽌⼦:T7 terminator 质粒分类:⼤肠杆菌载体；PET 系列表达质粒原核抗性:卡那霉素Kan 克隆菌株:DH5α培养条件:37℃，有氧，LB 表达宿主:⼤肠杆菌诱导⽅式:IPTG 或乳糖及其类似物 5'测序引物:T7:TAATACGACTCACTATAGGG 3'测序引物:T7-ter:TGCTAGTTATTGCTCAGCGG 备注: 可⽤GST 亲和柱纯化重组蛋⽩pET28a-OFP 载体质粒图谱和多克隆位点信息 pET28a-OFP 载体简介pET28a-OFP 载体序列pET28a-OFP 其他相关pET 系列表达载体： pProEX HTCpET-24 pProEX HTApET-23d pMBP-PpET-23c pMBP-CpET-23b pLLP-STII/Plpp-STIIpET-23 pETM-30pET22b-EBFP pET303/CT-HispET22b-EGFP pET302/NT-HispET-22b pET-52bpET-21d pET-51bpET-21b pET-50bpET-21a pET-48bpET-21 pET-47b pET-20bpET-44c pET-19bpET-44b pET-17bpET-44a ⾮空（BamHI-XhoI）pET-14bpET-43.1c pET-12cpET-43.1b pET-12bpET-43.1a pET-12apET-42c pET-11dpET-42b pET-11cpET-42a pET-11bpET-41c pET-5apET-41b pET-5bpET-41a pET-3dpET-39b pET-3cpET-37b pET-3bpET-35b pET-3apET-33b pTrc-CKSpET-32c pLpp-OmpApET-32b pET28a-OFP pET-32a pET28a-ECFP pET30a-EcoRV pET28a-EBFP pET-30c pProEX HTB pET-30b pET-Trx pET28a-SUMO pETM-11pET28a-EYFP pET-HispET28a-DsRed2 pET-GSTpET28a-EGFP pET-DsbApET-29c pETBlue-2pET-29b pET-40bpET-29a pET-31bpET-28c pET-30apET-28b pET28a-mCherry pET-28a pET-25bpET-27b pET-24apET-26b pET-23apET-24d pET-15bpET-24c pET-21cpET-24b pET-16bpET-11a。

pET-28a(+)质粒载体说明书-pet-28a.

pET-28a(+)质粒载体说明书-pet-28a.
1、增加收菌次数,相对提高了质粒的量5261,这样的话裂解液的量可以适当增加。

2、裂解要充分,变性和复性按说明应该是不超过5分钟,合理控制时间,一般在3分到4分半的时4102间都是可以的。

3、过柱子时,吸附的时间尽量长一些,可以在这期间做做其他实验或者吃个饭什么的。

4、如果没有必要,不使用去蛋白液,因为每过一遍柱子,其损耗越大1653,不过这得根据说明的菌种而定；
4、最后洗脱回收的时候,要单方面提高浓度,就要适当减少洗脱液的量,我一般都是回收到40~50μL的,同时要增加洗专脱次数,一般两三次足矣。

利用Gateway技术改造原核表达载体pGEX—4T—1、pET—28a

利用Gateway技术改造原核表达载体pGEX—4T—1、pET—28a作者：胡丽松邬华松郝朝运谭乐和范睿吴刚来源：《热带作物学报》2015年第08期摘 ;要 ;质粒载体是基因工程研究中不可或缺的工具。

为提高载体构建效率，进一步满足基因工程研究在构建表达载体时的需要，本文提供了一种重组型载体的改造策略。

基本流程如下：利用带BglⅡ、XhoⅠ酶切位点以及attB重组序列的引物，从Gateway的入门载体pDONR Zeo中克隆到“BglⅡ-attB1-ccdB-attB2-XhoⅠ”片段。

通过酶切连接的方法，将该片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1以及pET-28a的多克隆位点，构建具有重组位点以及ccdB致死基因的原核表达载体。

以胡椒High mobility group protein（HMGB）基因的开放读码框为目标片段，通过重组反应将目的基因构建到改造后的原核表达载体上，经检测体外诱导表达出大小正确的HMGB蛋白，验证本研究中改造载体的正确性。

该载体的成功构建，为基因工程科研工作提供了一个高效的蛋白表达载体以及载体改造的新策略。

关键词 ;Gateway技术;载体改造;胡椒PnHMGB;原核表达中图分类号 ;Q936 ; ; ; ; ;文献标识码 ;AModification of Prokaryotic Expression VectorpGEX-4T-1， pET-28a by UsingGateway TechnologyHU Lisong1，2， WU Huasong1，2 *， HAO Chaoyun1，2， TAN Lehe1，2， FANRui1，2， WU Gang1，21 Spice and Beverage Research Institute，CATAS， Wanning， Hainan 571533， China2 Ministry of Agriculture Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops / Hainan ProvincialKey Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulatioin for Tropical Spice and Beverage Crops，Wanning， Hainan 571533， ChinaAbstract ;Plasmid vector is a necessary tools for gene engineering. In order to improve the efficiency of vector construction， a strategy for recombinant vector modification was presented. The process as follows：A“BglⅡ-attB1-ccdB-attB2-XhoⅠ”sequence was cloned with 5`-BglⅡ-attB1 and 3`-XhoⅠ-attB2 extension primers from Gateway entry vector pDONR Zeo. Then the sequence was inserted into the multiple cloning site of pGEX-4T-1 and pET-28a to construct the new recombinant ccdB-selection E. coli expression vector. The open read frame（ORF）sequence of PnHMGB was cloned to the new pGEX-4T-1 and pET-28a vector by recombinant reaction. The results of PnHMGB expression in vitro verifies the correctness of vector modification. The successful vector modification supply an efficient E. coli expression vector and a new strategy for recombinant vector modification.Key words ;Gateway technology; Vector modification; PnHMGB; Prokaryotic expressiondoi ;10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.014天然质粒是存在于受体细胞染色体外的一种裸露的小型环状双链DNA分子，广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞，是寄主染色体以外的非必要组成部分，随着细胞的自我复制而分配到后代中。