重组DNA技术

（β-Gal）N端的α-肽链，该α-肽与宿主细胞(如E.coli JM109）中F´
因子上的LacZ´△M15基因（α-肽缺陷型）的产物互补，产生完整的、 有活性的β-半乳糖苷酶，分解生色底物（X-gal）形成蓝色菌落。当 外源基因插入MCS后，LacZ´α-肽基因的读码框被破坏，不能合成完 整的β-半乳糖苷酶分解底物X-gal，菌落呈白色。称为“蓝白斑”筛 选。
二、DNA连接酶(基因工程的“缝纫针”) ：
1. T4噬菌体DNA连接酶：两个不同片段双链DNA存在 互补粘性末端（Km=0.6µmol/L)或平末端(Km=50µmol/L)。 DNA连接反应都是由T4DNA连接酶介导 2. 大肠杆菌DNA连接酶:不能催化平末端DNA分子的 连接
三、DNA聚合酶
同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端， 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍未端(compatible end)。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
G + GATCC CCTAG G
A +GATCT A TCTAG
DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段
反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
一.限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 定义： 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其 周围切割双链DNA的一类内切酶。
Ⅱ型限制性核酸内切酶的作用特点—— 回文结构(palindrome)
大部分Ⅱ型限制酶能够识别由4个～8个核苷酸组成的特定序列。 Ⅱ型酶识别具有回文结构的核苷酸序列（图2-2）。“回文”意 为顺读和倒读都一样的词语
GGATCC CCTAGG 切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ
Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶 工程、细胞工程等 基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克
隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学 或重组DNA技术(recombination DNA technique)，基因操作 (gene manipulation)、遗传工程(genedc engineering)。
Hae Ⅱ 5’…PuGCGC▼Py...3’ Kpn Ⅰ 5’…GGTAC▼C...3’ Pst Ⅰ 5’…CTGCA▼G...3’ Sph Ⅰ 5’…GCATG▼C...3’ 切割后产生平末端: Alu Ⅰ 5’…AG▼CT...3’ EcoR Ⅴ 5’…GAT▼ATC...3’ Hae Ⅲ 5’…GG▼CC...3’ Pvu Ⅱ 5’…CAG▼CTG...3’ Sma Ⅰ 5’…CCC▼GGG...3’
限制性内切核酸酶
名 称 识别序列及切割位点 名 称 识别序列及切割点
切割后产生５’突出末端: BamHⅠ 5’…G▼GATCC...3’ Bgl Ⅱ 5’…A▼GATCT...3’ EcoR Ⅰ 5’…G▼AATTC...3’ Hind Ⅲ 5’…A▼AGCTT...3’ Hpa Ⅱ 5’…C▼CGG...3’ Mbo Ⅰ 5’…▼GATC...3’ Nde Ⅰ 5’…GA▼TATG...3’ 切割后产生3’突出末端: Apa Ⅰ 5’…GGGCC▼C...3’
GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平端切口
粘端切口
同功异源酶：
来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G +GATCC CCTAG G
BstⅠ
GGATCC CCTAGG
GATCC G + G CCTAG
(三)载体
一.表达载体(expression vector): 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多 肽链而特意设计的载体称为表达载体。 二.克隆载体(Cloning vector): 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设 计的载体称为克隆载体。
第二节 基本原理
重组DNA技术操作的基本过程
重组DNA技术操作过程可形象归纳为：
分
切 接
分离目的基因 限制酶切目的基因与载体 拼接重组体 转入受体细胞 筛选重组体
转 筛
分
目的基因 基因载体
切 接
重组体
总 体 技 术 路 线
转 筛 表
以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程
第二节
重要的工具酶
限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ
第四节
定义
常用载体
载体是携带目的基因进入宿主细胞扩增和表达的工具。具备的条件: ①具有自主复制能力 ②有多个单一限制性内切酶的酶切位点（MCS） ③具有选择性遗传标记 ④分子量小 ⑤拷贝数高（10个～200个/细胞） ⑥具有较高的遗传稳定性。
常用载体:
质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA
1.质粒 (plasmid):是细菌内携带的染色体外的小型双链环状DNA，
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
G + GATCC CCTAG G
分类： Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名：
Hin dⅢ
属 系 株
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。

(二)目的基因
• 进行DNA重组的目的主要有两方面：
① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
这些使我们感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因(target DNA)。
目的基因有两种类型： cDNA(complementary DNA):在体外经反转录合 成的．与mRNA互补的DNA。 基因组DNA(Genomic DNA):代表一个细胞或生物 体整套遗传信息的所有DNA序列。
（一） DNA克隆
克隆(clone):是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一
群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的群体
获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。
技术水平：分子克隆(molecular clone)
（即DNA 克隆）
细Baidu Nhomakorabea克隆
个体克隆（动物或植物）
DNA克隆 是在体外将不同来源的特异基因或DNA片 段插入病毒、质粒或其它载体分子，构建重组 DNA分子，然后将重组DNA导入到合适的受体细 胞中，使其在细胞中扩增和繁殖（称之为“克 隆”），筛选出含有目的基因的转化子细胞， 再 进 行 扩 增 、 提 取 获 得 大 量 同 一 DNA 分 子 (recombinant DNA, chimera DNA） ，即DNA克 隆 ， 因 此 DNA 重 组 技 术 又 称 为 DNA 克 隆 （ DNA cloning）。
（1）含有复制起始点和复制调节信号；
（2）有单个EcoRI酶切位点，可切开插入目的基因；
（3）有抗四环素基因Ter+和抗氨苄青霉素基因 Amp+，便 于重组体细胞的筛选。
（二） pUC系列载体:
由pBR质粒与M13噬菌体构建而成，长度为2.674kb，特点：
①具有更小的分子量和更高的拷贝数。 ② “蓝白斑”筛选: pUC载体中的LacZ´基因可编码β-半乳糖苷酶
目的基因的获取
克隆载体的选择和构建 DNA导入受体细胞
外源基因与载体的连接 重组体的筛选
克隆基因的表达
重组DNA技术操作的主要步骤 载体
质粒 噬菌体 病毒
目的基因（外源基因）
基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物
开环载体DNA
限制酶消化
目的基因
转化 体外包装，转染
重组体
连接酶
带重组体的宿主
筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交
Ampr
LacZ´ pUC19 (2 686bp)
Ori
ori
EcoRⅠ SacⅠ KpnⅠ SmaⅠ BamHⅠ XbaⅠ SalⅠ PstⅠ SphⅠ Hind Ⅲ
pUC19质粒载体图
（三）其它质粒载体
1．能在体外转录克隆基因的质粒载体: T7、SP6的启动子(RNA聚合酶附着位点) 2．穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）: 具有两种不同复制起点和选择标记,在原核和真核 细胞之间往返穿梭.
1.大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段): 大 肠杆菌DNA聚合酶I具有三种酶活性。 Klenow片段具有二 种酶活性（去除5’ 3’外切酶活性）。 2. Taq DNA聚合酶: 耐热（75-80℃），分子量65kD, 也具5’ 3’外切酶活性。 反转录酶(RDDP):多功能酶，无3’ 5’DNA外切酶活 性，具有3’ 5’RNA外切酶活性。
能独立进行复制。
特点: 1.分子量相对较小能在细菌内稳定存在，能在宿主细胞内独立自
主复制；有较高的拷贝数。 2.具有一个以上的遗传标志，便于在宿主细胞进行选择。 3.具有多个限制性酶的单一切口，称为多克隆位点。便于外源基因的插入。
常用质粒载体
（一） pBR322质粒：由一系列大肠杆菌质粒DNA
通过重组技术构建成，长度为4.36kb，特点：
逆转录酶
T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶
重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶 功 能
限制性核酸内切酶
DNA连接酶
识别特异序列，切割DNA
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 ①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等 ①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基
重组DNA技术的发展史
1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。 O. T. Avery（1944年）证明，遗传信息的携带者是DNA； J. D. Watson和F. H. C. Crick提出了DNA分子的双螺旋结构模型 （1953年） M. Meselson和F. W. Stahl证实了DNA的半保留复制（1958年） F. H. C. Crick提出遗传信息传递的“中心法则”（1958年） F. Jacob和J. Monod提出了调节基因表达的操纵子模型（1961年） M. W. Nirenberg等人破译了氨基酸的64个遗传密码（1966年） 1972年，P. Berg等率先完成了DNA体外重组(1980年诺贝尔化学奖) 1973年，S. Cohen等进一步实现了重组DNA的转化 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程 公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。 1982年，美国食品与药物管理局批准首例基因工程产品--人胰岛素 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。
第五章
重组DNA技术
重组DNA技术 又称DNA克隆或分子克隆
DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone
1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验:
从S型细菌中分别抽提出DNA、蛋白质和荚膜物质，并把每一种成分同活的R型细菌混 合，悬浮在合成培养液中。结果发现只有DNA组分能够把R型细菌转变成S型细菌
抑制和调节多 种激素的作用
人体生长激素释放激素(SS) 9升大肠杆菌 培养液 基因工程
从动物脑中提取: 5mg---50万只羊脑
主要内容：
相关概念
– DNA克隆 – 工具酶 – 目的基因 – 基因载体
基本原理
重组DNA技术与医学的关系
第一节、重组DNA技术相关概念 Concept Associated to Recombinant DNA Technology