重组DNA技术
DNA重组技术
MCS——多克隆位点（multiple cloining site， MCS） （1）MCS 是多个限制酶识别的一段DNA顺序， 以便克隆/插入外源基因/DNA片段，与之相关概 念有： （2）多聚接头（polyliker） 有些质粒载体单一 切点少，不能普遍使用。为了扩大使用范围，可 以加一段有许多限制酶识别的单一切点的多聚接 头。 （3）人工接头（linker） 是用若干个bp组成的 dsDNA片段，一般有一个或以上限制酶识别与切 割的顺序。
4、限制性内切酶的类型 限制性内切酶可分为三大类型： • 类型I和类型III ：由于识别位 点并非严格专一，很少被应用。 • 类型II ： 是DNA重组技术最为 常用的工具酶。
类型II 限制性内切酶的特点: • 识别位点严格专一 • 识别序列的碱基数一般为4、6、 8个bp • 识别位点经常是一种回文序列 的DNA
II、沸水浴法 a、菌体浮在含有EDTA的缓冲液中 b、加溶菌酶破细胞壁 c、放入沸水浴中煮40秒 d、离心，用无菌牙签挑去沉淀物 e、乙醇异丙醇沉淀
2、噬菌体载体 • 噬菌体的繁殖方式有两种： ①溶菌性方式（lytic ）： λ DNA先经多次复制合成 许多子代λ DNA，再装配成 许多子代的λ 噬菌体，最 后裂菌，释放出许多新的 λ 噬菌体。
• 稳定性：质粒在宿主细胞 中保持着一定的考贝数 • 寄生性：质粒只能在宿主 的细胞内复制 • 表现型：不同的质粒有不 同的表型，如对抗生素的 抗性等。
复制类型 • 严紧型质粒的复制受到宿主 细胞蛋白质合成的严格控制。
• 松弛型质粒的复制不受宿主 细胞蛋白质合成的严格控制。
（2）质粒DNA的构型 • SC构型:两条核苷酸链均保持着完 整的环形结构，DNA呈现超螺旋。 • oc构型:两条链中只有一条保持着 完整的环形结构，另一条链出现 缺口，称之为开环DNA。 • L构型:DNA的双链均发生断裂而形 成线性分子。
重组dna技术名词解释
重组dna技术名词解释重组DNA技术是一种基因工程技术，也称为基因重组技术或基因工程技术。
它是通过将不同来源的DNA片段进行拆解、重组和重新组装，从而实现对基因组的改造和修饰。
这项技术的出现和发展，为人类研究基因功能、疾病治疗、生物制药、作物改良等领域带来了巨大的变革和突破。
重组DNA技术包括以下几个重要步骤和相关名词：1. DNA提取：从生物体组织或细胞中获得DNA的过程。
可以利用化学方法或机械方法来提取DNA。
2. DNA片段：在重组DNA技术中，DNA通常被切割成较小的片段，以便进行进一步的操作。
这些片段通常由限制性内切酶所切割，生成具有特定序列的片段。
3. PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种在体外扩增DNA序列的方法。
通过选择性提取DNA片段并在合适的条件下进行一系列循环的核酸扩增过程，可以快速地扩增DNA片段。
4. 限制性内切酶：一类能够识别特定DNA序列并在酶切位点上切割DNA的酶。
它们广泛应用于重组DNA技术中，用于切割DNA分子，生成具有限制性内切酶切位点的片段。
5. DNA连接酶：是一类酶，能够通过酶的相关活性将两个DNA分子连接起来，形成一个新的DNA分子。
在重组DNA技术中，DNA连接酶通常与DNA片段一起使用，实现DNA 的重组和重新组装。
6. 基因库：基因库是指以DNA分子形式保留的大量基因信息的储存体系。
它可以是基于细菌或质粒的载体系统，也可以是基于大规模的DNA文库系统。
利用基因库，可以对基因进行检索、扩增和分析。
7. 遗传工程：利用重组DNA技术对生物体进行基因操作，使其获得新的特性或表达更多的有益蛋白质。
遗传工程可以用于农业、医学和工业等领域，以实现对生物体的有目的的改造和利用。
8. 基因敲除：一种通过重组DNA技术将目标基因删除或失活的方法。
通过敲除特定的基因，可以研究和验证其功能，进而深入理解这些基因在生物体中的作用。
重组DNA技术ppt课件
限制性核酸内切酶
切割DNA分子实 质是断开两个核 苷酸之间的磷酸 二酯键。
磷酸二酯键
DNA分子
限制酶的识别序列：
分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修
饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
mRNA 反转录酶
cDNA 复制
双链cDNA 载体
重组DNA分子 受体菌cDNAAAAA逆转录酶AAAA TTTT
碱水解
TTTT
DNA聚合酶Ⅰ
SI核酸酶
目录
（二）克隆载体的选择和构建 （三）外源基因与载体的连接
目的基因
限制性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
T4 DNA连接酶 15ºC
载体自连
目的基因 自连
多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
作为基因工程运载体的条件
①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 ②具多种限制酶切点，以便与外源基因连接。 ③具有某些标记基因，便于进行筛选。 ④载体是安全的，不能对受体细胞有害。 ⑤载体DNA分子大小应合适，以便提取和在体外进行 操作。。
常用的载体：质粒
有标记基因的 存在，可用含 氨苄青霉素的 培养基鉴别
4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)
组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶
基因片断 克隆载体
重组DNA分子 受体菌
含重组分子的转化菌
* 从基因组DN带的所 有基因组DNA核苷酸序列不久即将完成。 但要揭示人类4万个基因功能的任务将更为艰巨。
人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因 的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人 类疾病相关基因提供了参照模板。
DNA重组技术
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② 工具酶
DNA重组技术中对DNA的“精雕细刻”主要用酶作 为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多 都用作工具，所以称在核酸及有关研究中像基本 工具一样不可缺少的酶类为工具酶。这类酶包括 限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、末 端修饰酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。
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限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
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PCR 的特点及应用： PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和 量要求低。因此，广泛应用于许多领域。 1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外 获得突变体、提供大量DNA用于测序等； 2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
限制性核酸内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶， 可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀； 是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。 是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚 合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶； 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且 与电泳技术相结合还可以用于基因组酶切图谱的鉴定 以及法医鉴定等。 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 13
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6 重组体的转化及鉴定
转化 转化过程是指将DNA重组体或质粒转到适宜的宿主细 胞中。通过这个过程，使目的基因片段得到大量扩 增、或产生需要的基因表达产物、或使宿主生物具 备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳 定遗传。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对 转化的大肠杆菌进行扩大培养使目的基因大量表达 和积累。通过对表达产物分离纯化便可获得想要的 产品。
重组DNA技术
一、定义
是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。
克隆载体：用于在宿主细胞中克隆和扩增外源DNA片段。
表达载体：用于在宿主细胞中获得外源基因表达产物。
二、特点
1、具备复制能力。 2、具备一个或多个筛选标志。 3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。 4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多克隆位
• 4.诊断疾病 基因诊断是一种使用DNA分析技术来检测和鉴定出疾病的方法。利用重组DNA技术，可以制造出一 些特定的探针或引物，用于检测和分析DNA序列的异常和变异。例如，肿瘤细胞或乳腺癌细胞中常常伴随着某些基 因的改变，可以利用重组DNA技术制备出一些与变异基因相对应的探针或引物，用于检测和诊断疾病。
ACG-OH TACTTAA-P
P-AATTCGT OH-GCA
-ACGAATTCGT-TGCTTAAGCA
3、DNA聚合酶
具有5`→3`聚合活性、5`→3`外切酶活性、3`→5`外切酶活性。 可用于合成双链cDNA分子或片断连接，探针制备，序列分析等。
4、碱性磷酸酶
去除DNA、RNA、dNTP和NTP 5ˊ端的磷酸根。 （1）5’端标记 （2）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身 连接， 提高重组效率。
2.来源：原核生物
3.分类：根据结构、作用特点不同，分为三类。 Ⅰ型酶、Ⅲ型酶：具有限制切割与甲基化修饰活性，都没有多大的实用价值。 Ⅱ型酶：应用广泛，能在DNA分子内部的特异位点，识别和切割双链DNA，其切割位点 的序列可知、固定。
通常所说的限制性内切酶就是指Ⅱ型酶。
2、DNA连接酶
催化DNA中相邻的5ˊ端磷酸基和3ˊ-OH末端之间形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键。 大肠杆菌连接酶，只能连接粘性末端，T4噬菌体连接酶不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
重组DNA-分子克隆技术
重组DNA技术 Recombinant DNA Techniques
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主要内容
CONTENTS
基本知识
实验流程
实验操作
01
相关问题
02
03
04
克隆与克隆化
01
克隆：指同一副本或拷贝的集合
02
克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。
03
分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。
粘端连接
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CGG C
C GGC
CGG C
C GGC
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上幸存并形成菌落。
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标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌
01
表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷
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互补，那么就可以利用营养突变菌株进
03
行筛选，这就是标志补救筛选。
04
01
挑取单菌落，于液体培养基中培养；
03
对质粒进行限制性内切酶酶切；
05
根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。
02
收集菌体，提取纯化质粒；
在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向
DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚
合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环
自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合
成，使目的基因按指数增长。
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互
补部位相配对和结合
04
琼脂糖凝胶电泳检测；
酶切和电泳
挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；
dna重组技术名词解释
dna重组技术名词解释
DNA重组技术是指通过将不同来源的DNA分子进行拼接、融合或交换,创造出新的基因或基因组的过程。
以下是与该标题相关的一些名词解释:
1. 重组DNA:指从不同来源的DNA分子中获取的DNA片段,这些DNA片段可以来自于同一物种的不同细胞、不同组织或不同来源。
2. 基因重组:指在基因组中发生的基因组合或序列替换,导致新的基因产生或改变生物的性状。
3. 基因编辑:指使用CRISPR等技术手段,对基因进行精确地剪切、删除、替换等操作,以调节或改变生物的性状。
4. 基因组重组:指不同物种之间的基因组重组,可能导致新物种的产生。
5. 非同源重组:指重组DNA中不同的DNA片段之间的非同源性结合,这种结合可能会导致新的基因产生或改变生物的性状。
6. 同源重组:指两个DNA分子中的相同序列之间的结合,这种结合通常不会导致新的基因产生或改变生物的性状。
7. 基因表达:指DNA信息被转化为蛋白质信息的过程,是生物学中非常重要的一个过程。
8. 基因敲除:指通过基因工程技术,去除目标基因的表达,以达到特定目的的过程。
9. 基因修饰:指对目标基因进行修饰,以改变其表达水平、稳定性或活性等特性。
10. 基因转移:指将从父或母物种中获得的DNA片段转移至另一个物种中的过程,通常用于改良植物、动物或微生物的遗传特性。
DNA重组技术在生物学、医学、工程学等领域都有广泛的应用,例如基因编辑、基因敲除、基因修饰、基因转移等。
这些技术的应用可以帮助人们更好地理解生命的基本原理,探究生命的奥秘,推动人类健康和社会进步。
DNA重组技术
第五章DNA重组技术DNA重组技术是指在体外将目的DNA片段与质粒（plasmid）等能够自主复制的载体（vector）连接形成重组DNA分子，再导入合适的受体细胞。
由于重组DNA可以在受体细胞中复制，目的DNA片段同时也可以扩增获得大量拷贝，因此这项技术也被称为分子克隆（molecluar cloning）。
与PCR技术相比，通过分子克隆得到的拷贝错误率更低，并且获得重组DNA的受体细胞可以无限传代，目的片段可以更长久的保存，并能进行筛选、突变、融合、序列分析等一系列基因操作。
此外，如果载体在插入目的基因的区域具有合适的启动子、核糖体结合位点、转录终止子等序列，目的DNA片段所含基因还有可能能在受体细胞中大量表达，获得目的蛋白或其它表达产物。
通过DNA重组技术表达的蛋白又称为重组蛋白。
目前，DNA重组技术在基础研究、基因诊断、生物制药、基因治疗等方面都得到广泛的应用。
第一节DNA重组技术的常用工具酶在DNA重组技术中，需要利用一些酶来对基因进行操作，我们可以把这些酶称为工具酶。
工具酶的用途涵盖DNA重组技术的各个方面，包括目的DNA的获得、DNA的切割、片段的连接等。
一、目的DNA获得相关工具酶在DNA重组技术中，目的DNA的获得有多种方法。
其中通过酶扩增来获得是重要的一类方法，其中需要多种工具酶。
（一）Klenow片段Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，是DNA聚合酶I通过木瓜蛋白酶部分水解得到的大片段，保留了DNA聚合酶I的5’-3’的聚合和3’-5’的核酸外切酶的活性，去除了5’-3’的核酸外切酶活性。
Klenow片段可用于在体外扩增DNA片段。
由于其具有3’-5’的核酸外切酶活性，因此可以校正聚合中可能出现的错误，具有一定的保真性。
但由于其不耐热，聚合活性弱，在体外合成DNA的效率较低，随着PCR技术的发展，Klenow片段的应用已日趋减少。
现主要用于DNA双链末端的补齐和标记操作。
重组DNA技术
重组DNA技术
1 重组DNA技术的基本概念 2 重组DNA技术的基本原理 3 重组DNA技术所需的基本条件
1 重组DNA技术与基因工程的基本概念
A 重组DNA技术的基本定义
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与
载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受
体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键 nick
OH P
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … P OH nick 5’
DNA连接酶
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G …
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：
BamHI SmaI
5‘ 3‘ …GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’ CGATGTACCTAGGGCCC AAGCGTA…5’ 5‘… … GCTACATG GATCCCGGG TTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA…5’ 5‘ …GCTACATGGATCCC 3‘ …CGATGTACCTAGGG GGGTTCGCAT…3’ CCCAAGCGTA…5’
MgCl2
NaCl DTT Volume TT
10 mM
0 - 150 mM 1 mM 20 - 100 ml 37 ℃ 1 - 1.5 hr
0 - 50 mM 低盐酶
100 mM 中盐酶
重组DNA技术
限制性核酸内切酶三种切口
❖ 产生5′突出粘性末端（cohesive end):以EcoR I为例：
5′---G AATTC---3′ 3′---CTTAA G---5′ EcoR I
（五）DNA聚合酶（DNA polymerase）
重组DNA技术概述
❖重组DNA技术的基本概念 ❖重组DNA技术的基本步骤 ❖重组DNA技术中应用的重要工具 酶
一、重组DNA技术的基本概念
❖ 重组DNA技术(recombinant DNA technology) ：
是按人类的意愿，在体外对DNA分子进行重组， 再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和 繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。
代完全相同的子代群体。
二、重组DNA技术的基本步骤
❖ 分—载体和目的基因的分离 ❖ 切—限制性内切酶 ❖ 接—载体与目的基因连接成重组体 ❖ 转—基因序列转入细胞 ❖ 筛—目的基因序列克隆的筛选和鉴定
以及表达产物的检测
. Plasmid vectors containing a polylinker, or multiple-cloning-site sequence, commonly are used to produce recombinant plasmids carrying exogenous DNA fragments. (a) Sequence of a polylinker that includes one copy of the recognition site, indicated by brackets, for each of the 10 restriction enzymes indicated. Polylinkers are chemically synthesized and then are inserted into a plasmid vector. Only one strand is shown. (b) Insertion of genomic restriction fragments into the pUC19 plasmid vector, which contains the polylinker shown in (a). (The length of the polylinker in relation to the rest of the plasmid is greatly exaggerated here.) One of the restriction enzymes whose recognition site is in the polylinker is used to cut both the plasmid molecules and genomic DNA, generating singly-cut plasmids and restriction fragments with complementary sticky ends (letters at ends of green fragments). By use of appropriate reaction conditions, insertion of a single restriction fragment per plasmid can be maximized. Note that the restriction sites are reconstituted in the recombinant plasmid.
DNA重组技术概述
DNA重组技术概述DNA重组技术（DNA recombinant technology）是利用DNA序列的组合、修饰和重排等方法来获得特定目的的DNA分子的一种技术。
该技术被广泛应用于基因工程、生物医药、农业、食品工业等领域，并在科研、生产和临床医学中产生了重要的影响。
DNA重组技术的主要原理是通过DNA分子的切割、粘接、合成等操作，改变DNA序列的结构和组合关系。
这样一来，就可以将不同来源的DNA片段进行组合，重组为新的DNA分子，从而实现对DNA序列的改变和修饰。
DNA重组技术的核心技术包括PCR扩增、限制酶切割、DNA连接、酶体定向克隆、DNA测序等。
PCR扩增是一种常用的DNA重组技术，它可以在短时间内扩增出目标DNA片段。
PCR的原理是通过DNA聚合酶酶作用下的连续循环体系，将目标DNA片段从少量模板DNA中扩增出来。
这种方法简单、高效，广泛应用于分子生物学研究、基因克隆、医学诊断等领域。
限制酶切割是DNA重组技术中常用的一种手段。
限制酶能识别并切割DNA特定的序列，从而产生特定的DNA片段。
通过选择不同的限制酶，可以将DNA分子切割为具有不同片段和末端特性的DNA片段，从而实现希望的DNA重组效果。
限制酶的切割操作常用于基因克隆、DNA分析和重组等实验中。
DNA连接是DNA重组技术的另一个核心环节。
DNA连接是将两条DNA片段的末端通过DNA连接酶的作用连接在一起，形成一个新的DNA分子。
DNA连接的方法有多种，如末端连接、中间连接等。
不同的连接方式和连接酶的选择，可以实现不同的DNA重组目的。
通过DNA连接技术，可以将来自不同源的DNA片段进行连接，从而构建出具有特定功能的DNA分子。
酶体定向克隆是DNA重组技术中的一种重要方法。
它通过酶体（vector）的选择和DNA片段的连接来实现目标DNA片段的克隆和表达。
常用的酶体有质粒、噬菌体和人工染色体等。
酶体定向克隆技术常用于基因工程研究，用于将外源基因导入到宿主细胞中，并在宿主细胞中表达和复制。
重组DNA技术
重组DNA技术指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
基因工程指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
基因工程的两个基本特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。
基因工程的意义：⑴大规模生产生物活性物质⑵设计、构建生物的新性状甚至新物种⑶分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源。
基因工程的基本条件：A核酸操作的工具酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、核酸酶、核酸修饰酶。
B用于基因克隆的载体：载体的功能及特征、质粒、噬菌体或病毒DNA、考斯质粒与噬菌粒、人造染色体载体C用于基因转移的受体菌或细胞：受体细胞应具备的条件、各种基因工程受体的特性、实验室常用的基因工程受体限制性核酸内切酶的生物功能：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链。
主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用。
限制性核酸内切酶的类型：主要特性I 型II 型III 型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATP Mg2+ SAM Mg2+ ATP Mg2+ SAM识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处II 型限制性核酸内切酶的基本特性：识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。
II 型限制性核酸内切酶的切割方式：平头末端5’粘性末端3’粘性末端II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：（1）使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解（2）低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切（3）一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切影响限制性核酸内切酶活性的因素：DNA样品的纯度（B）DNA样品甲基化程度（C)限制性核算内切酶缓冲液性质（D)酶的纯度（E)DNA分子的构型（F)酶的反应温度和时间载体：基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”，本质是DNA复制子。
DNA重组技术
DNA重组技术不同来源的DNA分子，通过磷酸二酯键连接而重新组合的过程，称为DNA重组（DNA recombination）。
重组DNA技术（recombinant DNA technology）作为分子生物学的一项重要技术得到了迅速的发展。
利用重组DNA技术对DNA分子进行剪切和重新连接，构成重组DNA分子，然后把它导入宿主细胞，进而扩增相关DNA片段，表达相关基因的产物，是进行基因功能研究的基本方法。
克隆（clone）是指由一个细胞经过无性繁殖以后形成的子代群体。
构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁殖体系，即DNA的分子克隆（molecular cloning）过程。
因此，重组DNA技术又称为分子克隆技术或基因工程技术，其具体过程大致为分、切、连、转、筛选。
即分离纯化目的质粒载体、用限制性内切酶酶切纯化的载体、酶切后的载体与靶基因片段的连接、构建质粒载体转染感受态菌、筛选阳性克隆。
载体选择载体（vector）是携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。
常用的载体是通过改造天然的细菌质粒、噬菌体和病毒等构建而成。
目前已构建成的载体主要有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等多种类型，亦可根据其用途不同分为克隆载体和表达载体二类。
载体的构建和选择应考虑以下几个主要的条件：①在宿主细胞中具有自主复制能力或能整合到宿主染色体上与基因组一同复制的能力；②有合适的限制性酶切位点供外源DNA片段插入，多种酶单一位点使载体在使用上具有较大的灵活性；③分子量不宜过大，以便于容纳较大的外源DNA片段并获得较高的拷贝数，也有利于体外重组操作。
④具有合适的筛选标记，以便区分阳性重组体和阴性重组体，常用的筛选标记有抗药性、酶基因、营养缺陷型或形成噬菌斑的能力等。
⑤配备与宿主相适应的调控元件，如启动子、增强子和前导序列等。
本试验选择高拷贝型pGEM载体系列的pGEM-3Zf(+)为基础载体，它含有Lac Z基因编码区、SP6、T7RNA聚合酶启动子和其间的多克隆区域（见图），能在离体情况下合成ssDNA或RNA由于构建DNA或RNA探针的构建。
重组DNA技术
23 重组DNA技术
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4.2 DNA分子的体外重组
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酶切和连接。
23 重组DNA技术
二三．4.3 重组DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定 二四．重组DNA引入宿主细胞
○ 原核生物细胞是很好的受体细胞→容易摄取外界的DNA， 增殖快，基因组简单，便于培养和基因操作。大肠杆菌、 蓝藻、农杆菌等。
重组DNA技术
A Northern印迹
可以检测特定基因的表达情况。
B 原位杂交
可以检测特定细胞中某一基因的表达情况。
23 重组DNA技术
1.2 PCR
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23 重组DNA技术
01
02
03
质粒载体pBR322
04
有复制起始点，能 在受体细胞内复制；
有2种筛选标记基 因；
05
有允许外源DNA插 入的位点；
有高的拷贝数。
pBR322图谱
《重组DNA技术简介》课件
载体的构建
选择合适的载体，如质粒或病毒载体，对其进行 限制性内切酶切割、连接和转化等操作，构建成 重组载体。
克隆的表达与分析
对阳性克隆进行培养和诱导表达，收集表达产物 并进行相关分析，如蛋白质纯化、Western blot 等。
03
重组DNA技术的实验操作
基因的克隆与鉴定
基因克隆
将目的基因从原始生物体中提取出来，经过剪切、拼接等操作后 ，将其插入到载体DNA中，形成重组DNA的过程。
04
重组DNA技术的安全性与伦理问题
重组DNA技术的安全性评估
重组DNA技术的安全性
重组DNA技术是一种在分子水平上对DNA进行操作的技术，通过该技术可以实现对生物 遗传信息的精确控制。经过多年的研究和应用，重组DNA技术已经得到了广泛的应用和 认可，被认为是一种相对安全的技术。
安全评估的必要性
各国政府也制定了一些关于重组DNA 技术的法规和政策，例如美国的《人 间重组DNA研究指南》和中国的《人 间遗传资源管理暂行办法》等。这些 法规和政策对技术的研发和应用进行 了规范和管理，以确保技术的安全和 可控性。
重组DNA技术的社会影响与争议
社会影响
争议与挑战
重组DNA技术作为一种先进的生物技 术，对社会产生了深远的影响。该技 术的应用不仅推动了生物医学领域的 发展，也促进了农业、工业等领域的 技术革新。同时，该技术的应用也引 发了一些社会问题和争议。
基因表达的调控对于生物体的生长发 育和环境适应性至关重要。基因表达 受到多种因素的影响，包括DNA的甲 基化、染色质结构的改变、蛋白质因 子的作用等。
重组DNA技术的操作流程
目的基因的获取
通过限制性内切酶将DNA切割成片段，再通过 凝胶电泳和回收试剂盒分离得到目的基因。
重组dna技术
重组DNA技术介绍重组DNA技术是一种改变生物体基因组的方法，它包括将不同种类的DNA序列组合在一起，从而创建出新的基因组序列。
这项技术的出现引发了科学和医学领域的巨大进步，并在许多领域的研究中发挥着重要的作用。
DNA重组技术的原理DNA重组技术的基本原理是通过将所需的DNA片段插入到载体DNA中，然后将这个“重组”的DNA转移到宿主细胞中，使其表达目标基因。
具体步骤如下：1.DNA片段的获取：首先，需要获取到所需的DNA片段。
这可以通过多种方法实现，如利用限制性内切酶切割DNA、合成化学DNA等。
2.选择适当的载体：载体DNA是一个外源DNA分子，可以用来将目标DNA片段转移至宿主细胞中。
常用的载体包括质粒、噬菌体以及人工染色体等。
3.DNA连接：将目标DNA片段和载体DNA通过DNA连接酶连接起来，形成一个新的重组DNA分子。
4.转化宿主细胞：将重组DNA分子转移到宿主细胞中。
常用的方法包括化学法、电穿孔法以及使用噬菌体病毒作为媒介等。
5.目标基因表达：当重组DNA转移到宿主细胞中后，宿主细胞会开始转录和翻译这个重组DNA，从而产生所需的蛋白质。
重组DNA技术的应用重组DNA技术在许多不同领域中广泛应用。
以下是其中一些重要的应用：1. 基因工程重组DNA技术为基因工程提供了基础。
通过将外源基因插入到宿主细胞中，可以实现在宿主细胞中大量表达目标基因。
这在制药工业中非常重要，可以用来生产各种药物，如人类胰岛素、生长因子等。
2. 农业重组DNA技术在农业领域中也有广泛的应用。
例如，通过将特定基因导入农作物中，可以使其具有某种特定的农艺性状，如抗虫性、抗病性以及耐旱性等。
这为作物生产提供了新的方法和机会。
3. 疾病研究重组DNA技术为疾病研究提供了强大的工具。
通过重组DNA技术，研究人员可以建立转基因动物模型，模拟人类疾病，从而更好地理解疾病的发生和发展机制。
此外，重组DNA技术还可以用于研究特定疾病的基因诊断和治疗方法。
第十五章 重组DNA技术
Blue-white screening on medium with ampicillin, X-gal and IPTG. white colonies contain recombinant plasmid and can be isolated directly from this plate
• DNA诊断 • 基因治疗
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DNA诊断 DNA Diagnosis
• DNA 诊断常用方法 PCR、限制性片断长度多态性、单链构象多 态性、限制性酶切图谱及基因测序等 • DNA诊断的应用 杜氏肌营养不良(DMD)、Leber遗传性神经 病、苯酮酸尿症
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基因治疗 Gene Therapy
• 基因治疗的概念 从基因水平调控细胞中缺陷基因、修补矫正 或替代缺陷基因，分为基因增补、替换、修 复三种类型。
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质粒
• 细菌染色体外、自主复制、闭合环状 DNA • 分子量1kb到200kb以上 • 带有特殊的遗传信息 “抗药性”等 • 改造后成为极其常用的载体 穿梭载体
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pUC19 map
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第二节 重组DNA基本步骤
• • • • • 目的基因的获得(分) 载体的选择与修饰（切） DNA分子的体外重组（接） 重组DNA分子的导入、鉴定（转，筛） 目的基因的表达（表）
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目的基因的表达 Expressing a Target Gene
• 外源基因在原核细胞的表达 优点：简单、迅速、经济适合大规模生产 缺点：缺乏转录后、翻译后加工机制 • 目的基因在真核细胞的表达 表达产物更接近真核天然蛋白质结构 表达载体既含原核克隆载体的主要元件， 又含各种真核表达元件
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第三节 重组DNA技术在医学中的应用
重组dna技术名词解释及流程
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生物技术制药-DNA重组技术
分离病毒颗粒
培养转化细胞、收集菌体
病毒载体DNA分离与纯化
破碎细胞
质粒DNA分离与纯化
ＤＮＡ分子的体外连接 目标DNA片断插入载体
ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片 段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间 形成磷酸酸脂键的生物化学过程， ＤＮ Ａ分子的连接是在酶切反应获得同种酶 互补序列基础上进行的。
植物细胞 动物细胞 微生物细胞：细菌和真菌
（1）将目的基因导入植物细胞 双子叶植物—农杆菌转化法
（1）将目的基因导入植物细胞 单子叶植物—基因枪法
（1）将目的基因导入植物细胞
转基因抗虫棉－花粉管通道法
（2）将目的基因导入动物细胞
显微注射法
（3）将目的基因导入大肠杆菌细胞
质粒转化法：
用CaCl2处理大肠杆菌细胞 感受态大肠杆菌细 胞 重组载体与之混合 重组载体感染感受态 细胞（目的基因进入大肠杆菌细胞）
ⅰ. 超速离心：利用两种DNA分子的大小和空间构型 ⅱ. 变性法：在变性条件下使染色体DNA变为单链，而质 粒DNA仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前 者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。 变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法
载体DNA分离的一般程序
载体DNA
感染或转染细胞（病毒型）
转化细菌细胞（质粒型）
分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一
起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定
的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形
成杂化双链(heteroduplex) 。
复性
RNA
DNA
（一）印迹技术 （二）探针技术
探针 (probe)
一小段用同位素、生物素或荧光染料标
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Ⅱ型限制性核酸内切酶的作用特点—— 回文结构(palindrome)
大部分Ⅱ型限制酶能够识别由4个～8个核苷酸组成的特定序列。 Ⅱ型酶识别具有回文结构的核苷酸序列（图2-2）。“回文”意 为顺读和倒读都一样的词语
GGATCC CCTAGG 切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ
Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端， 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍未端(compatible end)。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
G + GATCC CCTAG G
A +GATCT A TCTAG
(三)载体
一.表达载体(expression vector): 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多 肽链而特意设计的载体称为表达载体。 二.克隆载体(Cloning vector): 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设 计的载体称为克隆载体。
第二节 基本原理
重组DNA技术操作的基本过程
（β-Gal）N端的α-肽链，该α-肽与宿主细胞(如E.coli JM109）中F´
因子上的LacZ´△M15基因（α-肽缺陷型）的产物互补，产生完整的、 有活性的β-半乳糖苷酶，分解生色底物（X-gal）形成蓝色菌落。当 外源基因插入MCS后，LacZ´α-肽基因的读码框被破坏，不能合成完 整的β-半乳糖苷酶分解底物X-gal，菌落呈白色。称为“蓝白斑”筛 选。
二、DNA连接酶(基因工程的“缝纫针”) ：
1. T4噬菌体DNA连接酶：两个不同片段双链DNA存在 互补粘性末端（Km=0.6µmol/L)或平末端(Km=50µmol/L)。 DNA连接反应都是由T4DNA连接酶介导 2. 大肠杆菌DNA连接酶:不能催化平末端DNA分子的 连接
三、DNA聚合酶
抑制和调节多 种激素的作用
人体生长激素释放激素(SS) 9升大肠杆菌 培养液 基因工程
从动物脑中提取: 5mg---50万只羊脑
主要内容：
相关概念
– DNA克隆 – 工具酶 – 目的基因 – 基因载体
基本原理
重组DNA技术与医学的关系
第一节、重组DNA技术相关概念 Concept Associated to Recombinant DNA Technology
DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段
反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
一.限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 定义： 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其 周围切割双链DNA的一类内切酶。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
G + GATCC CCTAG G
分类： Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名：
Hin dⅢ
属 系 株
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶 工程、细胞工程等 基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克
隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学 或重组DNA技术(recombination DNA technique)，基因操作 (gene manipulation)、遗传工程(genedc engineering)。
重组DNA技术操作过程可形象归纳为：
分
切 接
分离目的基因 限制酶切目的基因与载体 拼接重组体 转入受体细胞 筛选重组体
转 筛
分
目的基因 基因载体
切 接
重组体
总 体 技 术 路 线
转 筛 表
以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程
第二节
重要的工具酶
限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ
第四节
定义
常用载体
载体是携带目的基因进入宿主细胞扩增和表达的工具。具备的条件: ①具有自主复制能力 ②有多个单一限制性内切酶的酶切位点（MCS） ③具有选择性遗传标记 ④分子量小 ⑤拷贝数高（10个～200个/细胞） ⑥具有较高的遗传稳定性。
常用载体:
质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA
1.质粒 (plasmid):是细菌内携带的染色体外的小型双链环状DNA，
Hae Ⅱ 5’…PuGCGC▼Py...3’ Kpn Ⅰ 5’…GGTAC▼C...3’ Pst Ⅰ 5’…CTGCA▼G...3’ Sph Ⅰ 5’…GCATG▼C...3’ 切割后产生平末端: Alu Ⅰ 5’…AG▼CT...3’ EcoR Ⅴ 5’…GAT▼ATC...3’ Hae Ⅲ 5’…GG▼CC...3’ Pvu Ⅱ 5’…CAG▼CTG...3’ Sma Ⅰ 5’…CCC▼GGG...3’
能独立进行复制。
特点: 1.分子量相对较小能在细菌内稳定存在，能在宿主细胞内独立自
主复制；有较高的拷贝数。 2.具有一个以上的遗传标志，便于在宿主细胞进行选择。 3.具有多个限制性酶的单一切口，称为多克隆位点。便于外源基因的插入。
常用质粒载体
（一） pBR322质粒：由一系列大肠杆菌质粒DNA
通过重组技术构建成，长度为4.36kb，特点：
重组DNA技术的发展史
1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。 O. T. Avery（1944年）证明，遗传信息的携带者是DNA； J. D. Watson和F. H. C. Crick提出了DNA分子的双螺旋结构模型 （1953年） M. Meselson和F. W. Stahl证实了DNA的半保留复制（1958年） F. H. C. Crick提出遗传信息传递的“中心法则”（1958年） F. Jacob和J. Monod提出了调节基因表达的操纵子模型（1961年） M. W. Nirenberg等人破译了氨基酸的64个遗传密码（1966年） 1972年，P. Berg等率先完成了DNA体外重组(1980年诺贝尔化学奖) 1973年，S. Cohen等进一步实现了重组DNA的转化 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程 公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。 1982年，美国食品与药物管理局批准首例基因工程产品--人胰岛素 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。
第五章
重组DNA技术
重组DNA技术 又称DNA克隆或分子克隆
DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone
1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验:
从S型细菌中分别抽提出DNA、蛋白质和荚膜物质，并把每一种成分同活的R型细菌混 合，悬浮在合成培养液中。结果发现只有DNA组分能够把R型细菌转变成S型细菌
1.大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段): 大 肠杆菌DNA聚合酶I具有三种酶活性。 Klenow片段具有二 种酶活性（去除5’ 3’外切酶活性）。 2. Taq DNA聚合酶: 耐热（75-80℃），分子量65kD, 也具5’ 3’外切酶活性。 反转录酶(RDDP):多功能酶，无3’ 5’DNA外切酶活 性，具有3’ 5’RNA外切酶活性。
（1）含有复制起始点和复制调节信号；
（2）有单个EcoRI酶切位点，可切开插入目的基因；
（3）有抗四环素基因Ter+和抗氨苄青霉素基因 Amp+，便 于重组体细胞的筛选。
（二） pUC系列载体:
由pBR质粒与M13噬菌体构建而成，长度为2.674kb，特点：
①具有更小的分子量和更高的拷贝数。 ② “蓝白斑”筛选: pUC载体中的LacZ´基因可编码β-半乳糖苷酶
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ逆转录酶
T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶
重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶 功 能
限制性核酸内切酶
DNA连接酶
识别特异序列，切割DNA
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 ①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等 ①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基
目的基因的获取
克隆载体的选择和构建 DNA导入受体细胞
外源基因与载体的连接 重组体的筛选
克隆基因的表达
重组DNA技术操作的主要步骤 载体
质粒 噬菌体 病毒
目的基因（外源基因）
基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物
开环载体DNA
限制酶消化
目的基因
转化 体外包装，转染
重组体
连接酶
带重组体的宿主
筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交
Ampr
LacZ´ pUC19 (2 686bp)
Ori
ori
EcoRⅠ SacⅠ KpnⅠ SmaⅠ BamHⅠ XbaⅠ SalⅠ PstⅠ SphⅠ Hind Ⅲ
pUC19质粒载体图