DNA重组技术的原理及步骤.ppt

总观
参考文章
• 张亚旭 DNA重组技术的研究综述 生物技术进展 2012年 第2卷第一期 57-83
• 张洪渊 生物化学教程 第七章 Page479 • 王镜岩 朱圣庚 徐长法 生物化学下册 第40章Page580 • 百度百科 • 马克学 席兴宇 转化、转导、转染和感染的解析 生物学
教学 2010（第35卷）第10期
（五）筛：筛选出含有重组体的受菌体
直接选择法
间接筛选法
•
核酸水平
蛋白质水平
•
•1. 抗药性选择 *1. 酶切图谱
免疫学的技术：
*2. 核酸探针
SDS-PAGE、
•2. 标志补救 *3. PCR
Western blot 、
•3. 分子杂交法 *4. 序列测定
ELISA 、放免、
•
免疫沉淀、
•
荧光抗体等
多克隆位点
polylinker
复制起始点 ori
遗传标记
Amp
质粒载体
（二）切：对目的基因和载体适当切割
（1）与DNA分子相关的几种酶及基因工程的其他工具
限制性内切核酸酶
• 在特异位点上切割DNA分子 EcoRⅠ的识别序列
• 分三类，常用为Ⅱ类酶 • 识别序列呈回文对称
5’- GAATTC-3’ 3’- CTTAAG -5’
• 常用克隆载体：质粒DNA、噬菌体DNA 、病毒DNA
• 质粒是存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子；具有自我复制功能； 带有抗性基因及表型识别等遗传性标记;经改造后具有多克隆位点。
• pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。它是由 pSF2124、pMB1及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。
Recombinant DNA Technology
① ②
③ ④
⑤ ⑥
①从细胞中分 离出DNA
②限制酶截取 DNA片断
③分离大肠杆 菌中的质粒
④ DNA重组
⑤用重组质粒 转化大肠杆菌
⑥培养大肠杆菌 克隆大量基因
⑦重组体的筛选
（一）分：目的基因的获取
1. 化学合成法:较短的基因（60-80bp）用途：PCR引物
DNA重组技术的原理及步骤
第五组：郑桂贤
一、发展历史
• 1951年，美国学者E．莱德伯格等发现了噬菌体。1957年日本学者发 现了抗药性质粒。
• 20世纪70年代初，生物化学研究的进展也为重组DNA技术奠定了基础 • 1978年，诺贝尔生医奖颁给发现DNA 限制酶的纳森斯、亚伯与史密斯
时，斯吉巴尔斯基在《基因》期刊中写道：限制酶将带领我们进入合 成生物学的新时代。 • 基因工程、遗传工程、分子克隆作为DNA重组技术的代名词被广泛使 用。
、测序引物、 核酸杂交探针、定点突变
2. 基因组DNA 、cDNA 3. 聚合酶链反应
基因组DNA文库
基因组DNA
限制性内切酶
基因重组
体外包装
cDNA文库
mRNA
反转录酶
cDNA
基因重组
转化细菌
克隆载体的选择和构建
• 理想载体具备的条件：可转移性、复制功能、多克隆位点 （广泛、特异）、显著的筛选标志，便于筛选和鉴定、安 全性
• •
抗药性选择
2）标志补救（ß-半乳糖苷酶法）
（LacZ基因 ）
插入片段
（LacZ基因失活 ）
LacZ酶
氨苄培养基
(六) 克隆基因的表达
原核表达体系——表达载体的标准：
• 1. 含有大肠杆菌适宜的选择标志 • 2. 具有能调控转录、产生大量mRNA的强启
动子 • 3. 含有适当的翻译控制序列 • 4. 含有合理设计的多接头克隆位点
真核表达体系 • 关键步骤是将重组DNA导入真核细胞
分
基因载体
目的基因
质粒 噬菌体 病毒
PCR cDNA 人工合成 基因文库
切
限制性内切酶
有切口的载体
接 粘端连接
有切口的目的基因
重组体DNA连接酶
平端连接
尾接法
转
转化 转染 体外包装
带重组体的宿主细胞
筛
表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法
目的基因的表达
二、DNA重组技术的原理
• 1.目的基因的获取 • 2.克隆载体的选择与构建 • 3.外源基因与载体的连接 • 4.重组DNA导入受体菌 • 5.重组体的筛选 • 6.克隆基因的表达
三、 DNA重组技术的步骤
1. 分：分离目的基因 2. 切：对目的基因和载体适当切割 3. 接：目的基因与载体连接 4. 转：重组DNA转入受体菌 5. 筛：筛选出含有重组体的受菌体
Biblioteka Baidu入大肠杆菌
• 1. 氯化钙转化法 • 2. 电击法 • 3. 体外包装感染法
• 导入哺乳动物细胞
• 1. 显微注射法 • 2. 电穿孔法 • 3. DNA-磷酸钙共沉淀
•4. DEAE-葡聚糖转染法 • 5. 病毒感染法 • 6. 脂质体介导法 • 7. 细胞融合法 • 8. 原生质体融合法 • 9. 微细胞介导法
CCGG GGCC
CCGG GGCC
CGG C
C GGC
CCGG GGCC
HapⅡ
CGG C
T4-DNA 连接酶
C GGC
粘端连接
AGCT TCGA
AGCT TCGA
AGCT TCGA
AluⅠ
DNA连接酶
平端连接
同聚物加尾连接
（四）转：重组DNA转入受体菌
• 无性繁殖 • 感受态细胞: 容易接受外源DNA的状态. • 方式: 转化、转染、感染
HaeⅠ的识别序列
5’- GTTAAC-3’
3’- CAATTG -5’
（三）接：目的基因与载体连接
• (三) 连接策略 • 1. 粘端DNA 间的连接
•
(1) 同一限制性内切酶切割位点连接
•
(2) 不同限制性内切酶切割位点连接
• 2. 平端DNA 间的连接
• 3. 同聚物加尾连接
• 4. 人工接头连接