DNA重组技术的原理及步骤.ppt
重组DNA技术ppt课件
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
粘端切口
DNA连接酶
①作用: 把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，
即将脱氧核糖和磷酸连接起来.
②作用原理：
催化磷酸二酯键形成
③类型：
类型
来源
相同点
功能 差别
E·coliDNA连接酶 大肠杆菌 恢复 只能连接黏性末端
磷酸
T4DNA连接酶
T4噬菌体 二酯键
能连接黏性末端和 平末端(效率较低)
重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶
功
能
限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA
DNA连接酶
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物〔蛋白质）
（二〕工具酶
❖ 限制性核酸内切酶 ❖ DNA聚合酶Ⅰ ❖ 逆转录酶 ❖ T4DNA连接酶 ❖ 碱性磷酸酶 ❖ 末端转移酶 ❖ Taq DNA聚合酶
限制性核酸内切酶
定义 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周 围切割双链DNA的一类内切酶。
DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段 反转录酶
多聚核苷酸激酶
① 合成双链cDNA分子或片段连接 ② 缺口平移制作高比活探针 ③ DNA序列分析 ④ 填补3´末端
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等
DNA重组技术的基本工具(共32张PPT)
E·coliDNA连接酶
3)1977年DNA合成和测序技术的发明
E·coli DNA连接酶
或T4DNA连接酶
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到识别序列的
碱基上，使限制酶不能将其切开。
这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
——特异性
（1）识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列
（2）在特定的位点切割DNA分子。
例如：大肠杆菌的EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC序
列，并在G和A之间切开。
“分子手术刀”---限制性核酸内切酶(限制酶)
• 限制酶的识别序列：
能被限制性内切酶特 大异多性数识限别制的酶切的割识部别位序都列具由
操作。
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要 进行人工改造后才能用于基因工程操作。
思考与探究 P7
4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？
迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具 有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还 不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA 的酶。
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到识别序列的
碱基上，使限制酶不能将其切开。
Haemophilus influenzae d )中先
后分离到3种限制酶，则分别命名为:
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成
DNA重组的原理
DNA重组的原理
DNA重组是一种实验技术，用于将来自不同来源的DNA片段重新组合在一起形成新的DNA分子。
它的原理基于DNA的
双链结构和其特有的互补碱基配对规则。
首先，需要获取来自不同来源的DNA片段。
这些片段可以来
自同一生物体的不同基因，也可以来自不同生物体的DNA。
每个DNA片段都有自己特定的基因序列。
接下来，将目标DNA片段和载体DNA准备好。
载体DNA是
一个可以自我复制的DNA分子，常用的载体有质粒和噬菌体。
目标DNA片段和载体DNA都需要进行酶切，使用特定的限
制酶将它们切割成互补的DNA末端。
然后，将目标DNA片段和载体DNA连接在一起。
这一步需
要使用DNA连接酶，将目标DNA片段和载体DNA的互补末
端连接起来，形成一个新的DNA分子。
连接的过程中会形成
磷酸二酯键。
最后，将重组后的DNA分子导入宿主细胞中。
这可以通过转
化或转染的方法实现。
宿主细胞会接受重组后的DNA，并将
其复制和传递给子细胞，从而产生大量拥有重组DNA的细胞。
通过DNA重组，可以将不同基因或DNA片段组合在一起，
创建新的DNA分子。
这项技术被广泛应用于基因工程、遗传
学研究以及生物制药等领域。
DNA重组技术的原理及步骤
DNA重组技术的原理及步骤DNA重组技术是一种分子生物学技术，它通过重新组合DNA分子的特定部分，可以改变生物体的基因组成，从而实现对基因的操作和操控。
DNA重组技术的原理可以概括为：通过酶类作用在DNA链上剪切出特定的片段，再利用DNA连接酶将不同源的DNA片段连接在一起，形成新的DNA分子。
第一步：DNA提取DNA提取是DNA重组技术的前提和基础。
首先需要选择适当的生物样本，如细菌、植物、动物细胞等，利用细胞裂解方法将细胞溶解，释放出DNA。
然后经过蛋白质酶的消化，去除蛋白质、RNA等杂质，最终得到纯净的DNA溶液。
第二步：DNA切割DNA切割是指将DNA分子切割成特定的片段。
这一步骤可以利用限制性内切酶来实现。
限制性内切酶是一种酶类，能够识别DNA链上的特定序列，并在该序列的特定位点上切割DNA链。
通过选择不同的限制性内切酶，可以将DNA切割成不同长度的片段。
第三步：DNA纯化与回收切割后的DNA片段需要通过凝胶电泳分离和纯化。
凝胶电泳是利用DNA片段在电场中的移动速度差异，使不同长度的DNA片段在凝胶中分离的方法。
分离完成后，可以通过抽取单个的DNA片段进行纯化，获得所需的DNA溶液。
第四步：目标片段回收将目标片段从凝胶中回收需要先进行DNA片段的可视化。
一般可以采用亮蓝G染色剂着色和紫外线照射的方式进行可视化，然后使用刮片等方法将目标片段回收。
第五步：DNA连接DNA连接是将目标片段与载体DNA连接在一起，形成重组DNA。
载体DNA一般选择能够稳定复制的质粒或噬菌体基因组。
连接需要使用DNA连接酶，该酶能够识别DNA链的断裂末端，并将目标片段与载体DNA连接在一起。
第六步：转化连接完成后，可以将重组的DNA转移到宿主细胞内。
转移可以通过化学法转化细胞、电穿孔法或者基因枪等方法实现。
转化后的细胞会自主复制并表达被插入的重组DNA。
第七步：筛选与鉴定对转化后的细胞进行筛选与鉴定，以确定是否成功插入重组DNA。
DNA重组技术(Recombinant DNA)实验原理、用品和步骤
DNA重组技术(Recombinant DNA)实验原理、用品和步骤【实验原理】1．DNA重组技术重组DNA(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。
它包括以下几个步骤：1）重组DNA分子的构建：即将目的基因（DNA或cDNA片段）与载体DNA重组，应用TA 克隆方法,将PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。
该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR产物,在DNA连接酶作用下，目的DNA和载体DNA连接形成重组DNA分子。
2）将重组DNA分子转化宿主细胞。
3）克隆选择增殖：将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主菌敏感的抗生素，重组DNA（TA克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成集落。
挑取菌落，置液体培养基中培养，得到大量含重组DNA的细菌。
4）收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子（质粒），并纯化，获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。
2．质粒DNA的小量制备常见的质粒DNA提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。
本实验采用的是碱裂解法，碱裂解法的原理：在PH 12.0~12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒（CC）DNA仍为自然状态。
将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。
大部分染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。
通过离心，将可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收质粒DNA。
3．质粒DNA的限制性内切核酸酶（限制酶）切分析限制酶存在于原核生物体内，根据其结构和功能特性分为：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。
DNA重组实验原理及步骤
实验十 DNA重组一、实验原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做重组子。
DNA在体外的连接重组是基因工程操作的核心技术之一，其本质是一个酶促反应过程。
即在一定的条件下，DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5¹端磷酸和3¹端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程。
常用的DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
其中T4噬菌体DNA连接酶对底物的要求低，能更有效地连接DNA的平末端，应用更广泛。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分3步：①首先，ATP与T4噬菌体DNA连接酶通过ATP的磷酸与连接酶的赖氨酸的氨基形成酶―ATP复合物。
②被激活的AMP随后从赖氨酸残基转移到DNA一条链的5¹端的磷酸基团上，形成磷酸―磷酸键。
③DNA链3¹端的羟基被活化，取代ATP后与DNA5¹端的磷酸根形成磷酸二酯键，并释放出AMP，完成DNA之间的连接。
T4噬菌体DNA连接酶需要镁离子和ATP作为辅助因子，在一定的温度和pH条件下进行连接反应。
二、仪器及试剂：1. 仪器：台式离心机、移液器、吸头、恒温水浴锅等。
2. 试剂：T4 DNA连接酶、10×T4 DNA连接酶缓冲液、载体DNA、外源DNA。
三、操作步骤1. 外源DNA片段和载体DNA的连接取1只无菌Ep管、用微量进样器按下列顺序加入各成分。
10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul酶切后的DNA片段 *1 约0.3 pmol酶切后的载体DNA *2 约0.03pmolT4 DNA Ligase 1ulddH2O 加至 25ul*1 DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3－10倍。
人工基因重组（DNA重组技术）
人工基因重組（DNA重組技術）
一、人工基因重組：
以人工方法將不同來源的DNA連接起來而成為重組DNA
→再將重組DNA放入宿主細胞（基因轉殖）
→重組DNA在細胞內進行複製、轉錄和轉譯以合成蛋白質
二、重組DNA的操作過程：
1.載體和目標基因（外源基因）的選取：
(1)以細菌質體、噬菌體、病毒DNA、反轉錄病毒作為載體
→載體須帶有特定的標誌基因（耐抗生素、抗重金屬、螢光的基因）
(2)以動物、植物、微生物的DNA作為目標基因（外源基因）
2.利用限制酉每（鑑識酉每）切開載體和目標基因→使DNA的二端各呈單股
(1)限制酉每具有高度專一性（僅能辨識特定的一小段核酸序列）
→由特定的二個含氮鹽基間切開
→使載體與目標基因的二端皆各呈單股（黏性端）
(2)黏性端使目標基因與載體之單股DNA能穩定配對而不易斷裂
(3)GAA TTC為EcoRI限制酉每的辨認序列
→EcoRI會切開核酸序列中的含氮鹽基G與A之間的磷酸鍵
3.重組DNA：
→利用接合酉每（DNA連接酉每）以共價鍵方式將目標基因與載體連結成環狀的重組DNA
4.基因轉殖：將重組DNA送入宿主細胞中
→目標基因隨著載體在細菌體內複製、轉錄和轉譯、表現性狀
5.篩選轉形細胞：
∵質體帶有特定的標誌基因（耐抗生素、抗重金屬、螢光的基因）
∴轉殖成功的細胞（轉形細胞）可生長於含抗生素或重金屬的培養基中未轉殖成功的細胞則無法生存於含抗生素或重金屬的培養基中。
基因工程1.0-DNA重组技术
理想克隆载体的特性
分子量小、多拷贝、松驰控制型 具有多种常用的限制性内切酶的单切点 能插入较大的外源DNA片段 具有容易操作的检测表型。 常用质粒载体大小在1kb至10kb之间，如pBR322、pUC系列、pGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。
4362 bp
pBR322 old-style general purpose plasmid
DNA重组技术示意图
One basic cloning technique begins with the insertion of a foreign gene into a bacterial plasmid.
Fig. 20.1
DNA重组技术
质粒、DNA或RNA提取(Extraction) 酶切（Enzyme digest) 连接（ligation) 转化（transformation) 筛选（selection) 蛋白表达（Protein expression)
5000g离心15分钟。 取上清,加入RNA酶A(10mg/ml), 37℃水浴20分钟。 加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀, 12000g离心10分钟。 取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀, 12000g离心10分钟。 取上层水相, 用70%冷乙醇洗涤，12000g离心5分钟。 倒置离心管，风干沉淀，溶于500ml TE或水中。
CTAB法的优缺点
优点：避免使用氯仿等腐蚀性试剂 缺点：得率较低
3、质粒DNA的大量提取
（A）碱法
取对数生长后期菌液250ml，5000g离心10分钟,弃上清, 离心管倒置使上清流尽。 细菌沉淀重悬浮于5ml溶液I中。 加入10ml新配制的溶液II, 缓缓地颠倒离心管数次,以混匀内容物,冰浴10分钟。 加10ml用冰预冷的溶液III, 摇匀离心管,冰置15分钟,此时形成白色絮状沉淀。
DNA重组技术的基本步骤PPT课件
-
41
（1）、农杆菌转化法
-
42
转移至受体细胞 整合到染色体上
-
43
P15-2
根据农杆菌可将目的基因导入双子 叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能 将目的基因导入单子叶植物的原因吗？ 若想将一个抗病基因导入单子叶植物 (如小麦），从理论上说，你认为应该 怎么做？
因为单子叶植物不能分泌出大量的酚类化合物来吸引农杆菌， 向单子叶植物的伤口处喷洒酚类化合物，使用基因枪法及花粉
1、什么是目的基因？
2、获取目的基因的方法有哪些？其操 作过程分别是怎样的？
-
9
1、目的基因概念： 主要指的是编码蛋白质的结构基因。也 可以是一些具有调控作用的因子。
2、目的基因获取方法： Ⅰ、从基因中获取目的基因 Ⅱ、利用PCR技术扩增目的基因 Ⅲ、化学方法直接人工合成 8100 C. 17280 D. 7560
-
28
4、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分 子片段为ATGTG／TACAC，要使其数量增多，可用PCR
技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 D
①双链DNA分子为模板 ②ATGTG或TACAC模板链 ③四 种脱氧核苷酸 ④四种核苷酸 ⑤DNA聚合酶 ⑥热稳定 DNA聚合酶⑦引物 ⑧温度变化 ⑨恒温
-
36
目的基因与运载体结合所需的条件有 D
①同一种限制酶 ②具有抗性基因的质粒
③RNA聚合酶 ④目的基因
⑤DNA连接酶 ⑥四种脱氧核苷酸
⑦ATP
A．①②③④⑤⑥⑦ B．①②④⑤⑥⑦
C．①②③④⑤
D．①②④⑤⑦
（多选）一个基因表达载体的构建应包括 ABCD
A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因
三、1重组DNA的转化及重组子鉴定和PCR技术
❖ 3、仪器 恒温摇床，电热恒温培养箱，超净工作台，电热恒温水浴， 分光光度计，台式离心机，取液器
三、实验步骤
❖ 1、取出感受态细胞让其在冰上自然解冻，每200μL解冻的 感受态细胞加入整管连接产物，混匀后冰浴30min。
❖ 当有外源DNA片段插入到质粒位于lacZ′ 中的多克隆位点后，宿主细胞和重组质粒不 能形成有活性的β-半乳糖苷酶，不能将无色 的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物 5-溴-4-靛蓝。因此含有重组质粒的克隆就是 白色 实验用品
❖ 1、材料 JM109受体菌（感受态细胞），实验三的连接产物，取液器 吸头，EP管。
❖ 3、仪器 PCR热循环仪， 琼脂糖凝胶电泳系统
三、实验步骤
❖ 1、在0.2mL EP管内配制 25μL PCR反应体系 ：
反应物
体积（μL）
ddH2O
17
10 ×PCR Buffer
2.5
MgCl2
1.5
4× dNTP
1
引物1
0.5
引物2
0.5
Taq酶
0.5
模板DNA
1.5
2、混匀后，瞬时离心。
将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间， 促使在转化过程中获得的新的表型（如Ampr等）得 到表达。在选择性培养基上进行重组子的鉴定。
的pUC18
大肠杆菌JM109
lacZ基因在缺 少近操纵基因区段
的宿主细胞与带有 完整近操纵基因区
段的质粒之间实现 了互补，称为α-互 补。
由α-互补而产 生的LacZ+细菌形 成有活性的β-半乳 糖苷酶，在诱导剂 IPTG的作用下， 在生色底物X-Gal 存在时产生蓝色菌 落，因而易于识别。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第五组：郑桂贤
一、发展历史
• 1951年，美国学者E．莱德伯格等发现了噬菌体。1957年日本学者发 现了抗药性质粒。
• 20世纪70年代初，生物化学研究的进展也为重组DNA技术奠定了基础 • 1978年，诺贝尔生医奖颁给发现DNA 限制酶的纳森斯、亚伯与史密斯
时，斯吉巴尔斯基在《基因》期刊中写道：限制酶将带领我们进入合 成生物学的新时代。 • 基因工程、遗传工程、分子克隆作为DNA重组技术的代名词被广泛使 用。
真核表达体系 • 关键步骤是将重组DNA导入真核细胞
分
基因载体
目的基因
质粒 噬菌体 病毒切口的载体
接 粘端连接
有切口的目的基因
重组体DNA连接酶
平端连接
尾接法
转
转化 转染 体外包装
带重组体的宿主细胞
筛
表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法
目的基因的表达
、测序引物、 核酸杂交探针、定点突变
2. 基因组DNA 、cDNA
cDNA
基因重组
转化细菌
克隆载体的选择和构建
• 理想载体具备的条件：可转移性、复制功能、多克隆位点 （广泛、特异）、显著的筛选标志，便于筛选和鉴定、安 全性
导入大肠杆菌
• 1. 氯化钙转化法 • 2. 电击法 • 3. 体外包装感染法
• 导入哺乳动物细胞
• 1. 显微注射法 • 2. 电穿孔法 • 3. DNA-磷酸钙共沉淀
•4. DEAE-葡聚糖转染法 • 5. 病毒感染法 • 6. 脂质体介导法 • 7. 细胞融合法 • 8. 原生质体融合法 • 9. 微细胞介导法
HaeⅠ的识别序列
5’- GTTAAC-3’
3’- CAATTG -5’
（三）接：目的基因与载体连接
• (三) 连接策略 • 1. 粘端DNA 间的连接
•
(1) 同一限制性内切酶切割位点连接
•
(2) 不同限制性内切酶切割位点连接
• 2. 平端DNA 间的连接
• 3. 同聚物加尾连接
• 4. 人工接头连接
总观
参考文章
• 张亚旭 DNA重组技术的研究综述 生物技术进展 2012年 第2卷第一期 57-83
• 张洪渊 生物化学教程 第七章 Page479 • 王镜岩 朱圣庚 徐长法 生染和感染的解析 生物学
教学 2010（第35卷）第10期
• 常用克隆载体：质粒DNA、噬菌体DNA 、病毒DNA
• 质粒是存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子；具有自我复制功能； 带有抗性基因及表型识别等遗传性标记;经改造后具有多克隆位点。
• pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。它是由 pSF2124、pMB1及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。
Recombinant DNA Technology
① ②
③ ④
⑤ ⑥
①从细胞中分 离出DNA
②限制酶截取 DNA片断
③分离大肠杆 菌中的质粒
④ DNA重组
⑤用重组质粒 转化大肠杆菌
⑥培养大肠杆菌 克隆大量基因
⑦重组体的筛选
（一）分：目的基因的获取
1. 化学合成法:较短的基因（60-80bp）用途：PCR引物
二、DNA重组技术的原理
• 1.目的基因的获取 • 2.克隆载体的选择与构建 • 3.外源基因与载体的连接 • 4.重组DNA导入受体菌 • 5.重组体的筛选 • 6.克隆基因的表达
三、 DNA重组技术的步骤
1. 分：分离目的基因 2. 切：对目的基因和载体适当切割 3. 接：目的基因与载体连接 4. 转：重组DNA转入受体菌 5. 筛：筛选出含有重组体的受菌体
多克隆位点
polylinker
复制起始点 ori
遗传标记
Amp
质粒载体
（二）切：对目的基因和载体适当切割
（1）与DNA分子相关的几种酶及基因工程的其他工具
限制性内切核酸酶
• 在特异位点上切割DNA分子 EcoRⅠ的识别序列
• 分三类，常用为Ⅱ类酶 • 识别序列呈回文对称
5’- GAATTC-3’ 3’- CTTAAG -5’
CCGG GGCC
CCGG GGCC
CGG C
C GGC
CCGG GGCC
HapⅡ
CGG C
T4-DNA 连接酶
C GGC
粘端连接
AGCT TCGA
AGCT TCGA
AGCT TCGA
AluⅠ
DNA连接酶
平端连接
同聚物加尾连接
（四）转：重组DNA转入受体菌
• 无性繁殖 • 感受态细胞: 容易接受外源DNA的状态. • 方式: 转化、转染、感ß-半乳糖苷酶法）
（LacZ基因 ）
插入片段
（LacZ基因失活 ）
LacZ酶
氨苄培养基
(六) 克隆基因的表达
原核表达体系——表达载体的标准：
• 1. 含有大肠杆菌适宜的选择标志 • 2. 具有能调控转录、产生大量mRNA的强启
动子 • 3. 含有适当的翻译控制序列 • 4. 含有合理设计的多接头克隆位点
（五）筛：筛选出含有重组体的受菌体
直接选择法
间接筛选法
•
核酸水平
蛋白质水平
•
•1. 抗药性选择 *1. 酶切图谱
免疫学的技术：
*2. 核酸探针
SDS-PAGE、
•2. 标志补救 *3. PCR
Western blot 、
•3. 分子杂交法 *4. 序列测定
ELISA 、放免、
•
免疫沉淀、
•
荧光抗体等