25 生物化学实验--大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转解析
大肠杆菌感受态细胞的制备和转__[1]...
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由互补产生的β －半乳糖苷酶(LacZ)能够作 用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β －D－ 半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这 个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入 一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会 造成LacZ(β －半乳糖苷酶)基因的失活，破坏α -
步骤需在超净工作台和冰上操作；
4 ．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管
中，在冰上冷却10分钟；
5 ．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；
6 ．弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2
溶液，用移液枪轻轻上下吸动混匀，使细
胞重新悬浮，在冰放置20分钟；
7 ． 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 8 ．弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2溶液， 用移液枪轻轻上下吸动混匀，使细胞重新悬浮； 9 ．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保 护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存 备用（－80℃）。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 实验原理
• 实验仪器 • 实验试剂
• 实验步骤 • 注意事项
实验原理
进行基因克隆时，体外连接的重组DNA分
子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、 增殖和表达。 感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一 些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后， 细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源 DNA的载体分子通过的感受态细胞。
电转化法制备大肠杆菌感受态细胞 实验步骤
1．前夜接种受体菌（DH5或DH10B）， 挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培 养过夜； 2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB 培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养
大肠杆菌感受态细胞的制备原理步骤以及重组质粒转化
一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件,掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法;2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法,了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理;二、原理一大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态,是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物,只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体,能接受外源DNA而不将其降解的生理状态;感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质和酶,负责供体DNA 的结合和加工等;细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等;本实验为了把外源DNA重组质粒引入大肠杆菌,就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞;在细菌中,能发生感受态细胞是占极少数;而且,细菌的感受态是在短暂时间内发生;目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一;主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化,即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁,使DNA 分子能通过质膜进细胞;证据有：1发芽的芽孢杆菌容易转化；2大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染,却能受噬菌体DNA 转化；3适量的溶菌酶能提高转化率;2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点,使DNA 分子能进入细胞;证据是：1蛋白质合成的抑制剂如氯霉素,可以抑制转化作用；2细胞分裂过程中,一直有局部原生质化,但感受态只在生长对数期的中早期出现；3分离到感受态因子,能使非感受态细胞转变为感受细胞;目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论,但是许多实验室一直进行探索,试图从实验中获得明确回答;有人根据pBR322 质粒DNA对Ecoli K――12X1776菌株的转化结果,认为：近来,在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理,可提高转化效率几十倍,通常把细胞悬浮在的100mmol/L CaCl2中,在冰浴条件下,放置过夜,转化率转高,但一过24小时,转化率测恢复为原来的水平;二重组DNA 的转化原理我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞,接下的实验是把重组的DNA 引入受体细胞,使受体菌具有新的遗传特性,并从中选出转化子;作为受体的大肠杆菌C600 或DH 5α,必须不同外来DNA分子发生遗传重组,通常是rec基因缺陷型的突变体,同时它们必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株;这样外来的DNA分子不会受其限制酶的降解;保持外来DNA分子在受体细胞中的稳定性;制备的大肠杆菌细胞就具有这三种缺陷rk-mk-rec-同时此受体细胞还是氨苄青霉素敏感Ap;在体外构建好的重组分子上具有分解氨苄青霉素Ap基因存在,当它导入受体细胞后,就赋于这些受体细胞新的特性,即Ap 抗性;同时载体质粒上具有乳糖操纵的β一半乳糖苷酶基因lacZ,我们可以利用外源基因插入载体β一半乳糖苷酶基因lac Z,使其失去β一半乳糖苷酶活性的原理来选择新构建的重组子;因pUC18带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pU C18 DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活;此为初步的抗性筛选;pUC18 上带有β-半乳糖苷酶基因lacZ的调控序列和β-半乳糖苷酶N 端146 个的编码序列;这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ 的阅读框架,不影响其正常功能; DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C 端部分序列的编码信息;在各自独立的情况下,pUC18 和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性;但在pUC18 和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质;这种lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补;由α-互补产生的Lac 细菌较易识别,它在生色底物X-gal5-溴-4 氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷存在下被IPTG异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导形成蓝色菌落;当外源片段T GFβⅠ插入到pUC18 质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的片段失去α-互补能力,因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落;由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA 分开;此为α-互补现象筛选;本实验是把外来重组分子和感受态细胞在低温下混合,使其进入受体细胞;DNA分子转化的原理较复杂：1、吸附――完整的双链DNA 分子吸附在受体菌表面;2、转入――双链DNA 分子解链,单链DNA 分子进入受体菌,另一链降解;3、自稳――外源质粒DNA 分子在细胞内又复制成双链环状DNA;4、表达――供体基因随同复制子同时复制,并被转录和翻译;对DNA 分子来说,能被转化进受体细胞的比率极低,通常只占DNA 分子的%,改变条件,提高转化率是很有可能的,一些研究表明下列因素可以提高转化率：1受体菌细胞与DNA 分子两者比例在×108 细胞：1毫微克DNA分子左右转化率较好；2DNA 分子与细胞混合时间为1小时最佳；3铺平板条件会影响转化率；4对不同转化菌株热处理效应不一致;除上述因素外,转化试验还注意如下问题：1、连接DNA 反应液与受体细胞混合时,一定保持在冰浴条件下操作,如果温度时高时低,转化效率将极差;2、热处理2 分钟后,要迅速加进1 毫升LB 以使表型表达,延迟加LB,将使转化率迅速降低;3、在平板上涂布细菌时;注容避免反复来回涂布,因为感受态细菌的细胞壁有了变化,过多的机械压涂布将会使细胞破裂;影响转化率;三、材料一仪器与器皿恒温振荡器电动沉淀旋涡混合器恒温培养箱隔电热恒温锅恒温普通冰箱Eppendorf管转液管平皿涂布棒微量取样器微波炉三角烧瓶刻度保温瓶酒精灯等二大肠杆菌C600 或DH5αrk rec mk三培养基与试剂液体培养基1% %酵母粉%NaCl ;2、100mmol/ L CaCl23.氨苄青霉素溶液50 毫克/毫升连接反应液储液20mg/ml: 用二甲基甲酰胺溶解X-gal 配制成20mg/ml的储液,包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏,储存于-20℃;储液200mg/ml: 在800μl水中溶解200mg IPTG后,用水定容至1ml,用μm滤膜过滤除菌,分装于eppendorf管并储于-20℃;7.含Amp 的LB 固体培养基:将配好的LB 固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp 储存液,使终浓度为50μg/ml,摇匀后铺板;8.含X-gal 和IPTG 的筛选培养基：在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB 平板表面加40ml X-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4 小时,使培养基表面的液体完全被吸收,备用;四、实验步骤一大肠杆菌感受态细胞制备1、将受体大肠杆菌接种于LB斜面上活化,置于恒温培养箱中37℃培养过夜;2、取一环上述大肠杆菌培养物菌落接种于3 毫升LB中,于恒温振荡器上,37℃振荡培养过夜约16 小时,必要时在显微镜下镜检菌细胞是否形态一致,有无杂菌污染;3、用无菌条件下,取过夜培养液1 毫升,接种于新鲜的LB 中100毫升LB/250毫升三角瓶,接种量按菌液浓度而定,一般在1%左右,于恒温振荡器上37℃培养2―3小时;4、取1 毫升培养液以未接种的LB 作空白对照,在751 上测OD550的光密度值,约为― 左右;5.无菌条件下将上述1 毫升菌液倒入毫升EP 中应带盖并高压灭菌过,每组2 支;6、带菌液的置于冰上10 分钟,冷却菌液,平衡好,置于台式低速上,3500r/min 离心5 分钟;7、无菌条件下,倒去上清LB,倒斜,让LB 流干,留下沉淀菌体,加入预冷的100mmo l/L CaCl2溶液600微升,用微量取样器轻轻吸冲底部沉淀菌体,使其悬浮后,把2支管转为1支,摇匀后于冰浴中放置30分钟;8、重新将CaCl2菌悬浮液置于台式低速上,3500r/min离心10分钟,小心侧倒掉上清CaCl2,留沉淀菌体;9、再把菌体悬浮在200 微升100mmol/L CaCl2的溶液中,置于冰上作为转化的受体菌液;此制备的感受态细胞应在此步后1小时至24小时内使用,效率比较高;10.在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB 平板表面加40ml X-gal 储液和4μlIP TG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收,备用;二重组DNA 转化1.取大肠杆菌感受态细胞,在无菌条件下,加入到连接液的Eppendorf管,混匀,置冰浴中30 分钟;2.冰浴后,将正在转化反应的细胞悬浮液加入已调好42℃的的恒温槽内,保温2分种;3.热冲击处理后的细胞易死亡,应迅速倒入LB培养液1 毫升,无抗菌素LB 液,有助于基因表达马上置37℃1 小时,每10 分钟翻转1 次;4.用取毫升的转化菌液直接涂布含50μg/ml Amp、40ml X-gal储液和4μlIPTG 储液LB 固体平皿上,共涂布三个培养皿;5.用取未经转化的受体大肠杆菌感受态菌液毫升直接涂布于含50μg/mlAmp、40 ml X-gal 储液和4μlIPTG 储液LB 固体平皿上,作为受体菌对照;6.将第14、15 步涂布培养皿先放室温15 分钟左右,使涂布上的菌液干燥不会流动;然后倒置放于中37℃培养过夜;7.第二天取出培养皿,观察对照平皿和转化平皿菌落情况;对照平皿因受体菌对Am p 敏感,故不能在含Amp的培养基上生长;转化平皿是否有兰色和白色菌落生成如果长出兰色菌落,说明自连的载体pUC18质粒已转入受体菌,但目的基因没有接入载体;如果长出白色菌落,说明目的基因已接入载体,重组质粒的转化子因此丧失了β-半乳糖苷酶活性,在x-gal 和ITPG 存在的生色诱导培养基上只能形成白色菌落;五、结果和讨论比较对照平皿和转化平皿,讨论转化成败原因.。
实验5：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化报告
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态 细胞总数
五、注意事项
1、冰上操作； 2、无菌操作； 3、重悬细胞时操作要轻； 4、实验应设有阳性对照，以估计转化效率；
应设立阴性对照，以消除可能的污染及查 明可能的失败原因。
实验四 大肠杆菌感受
态细胞的制备和质粒 DNA转化
实验目的和要求
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞；
学习用热激法将外源基因导入感受 态细胞。
实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 注意事项
一、实验原理（CaCl2法、热激法）
1、几个概念
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另 一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研 究的基本实验技术。
(一) 纯化及活化菌种（无抗生素的LB ）
单菌落
l mL培养液
冻存菌在新鲜LB
平板上，划线， 37℃培养16~20 h。
挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基 中，37℃培养过夜
取l mL培养液加到 100 mL LB液体培养 基中，37℃摇床培养 2~3 h ，当其OD600 为0.3～0.5时(细胞数 <108/mL)，立即取出， 冰浴10～15 min。
(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡 后于4℃，5000 r/min离心10 min，弃尽上 清(可用加样器将残余液体尽量去净)。— —收集沉淀
2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶 液重悬细胞，于冰上放置15 min．于4℃， 5000 r/min离心10min，弃上清。 —— CaCl2洗涤细胞转化效率的因素
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告摘要：本实验旨在研究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法。
通过对感受态细胞的制备和转化实验的设计和操作，我们成功获得了转化子，并验证了转化效率。
实验结果表明，制备和转化感受态细胞是一种有效的基因工程技术，可用于基因克隆和表达研究。
引言：大肠杆菌是一种常见的细菌，在基因工程领域被广泛应用于基因克隆、表达和蛋白质生产等研究。
然而，大肠杆菌在自然状态下对外源DNA的吸收能力较差，因此需要将其转化为感受态细胞，以便进行基因操作。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的重要步骤。
本实验旨在探究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法，并验证其可行性。
材料与方法：1. 大肠杆菌菌种：选用E. coli DH5α菌株作为实验对象。
2. 培养基：LB培养基。
3. 转化子：选用pUC19质粒作为转化子。
4. 热激转化：将感受态细胞与转化子混合后，通过热激转化的方法将外源DNA转化入细胞。
5. 酒精沉淀：将转化子沉淀后，通过酒精沉淀的方法提取转化子。
结果与讨论：在本实验中，我们首先制备了感受态细胞。
通过在LB培养基中培养大肠杆菌DH5α菌株，使其进入对外源DNA的吸收状态。
然后，我们将感受态细胞与转化子pUC19质粒混合，并进行热激转化。
转化子中的抗生素抗性基因能够在转化后表达，从而筛选出转化子。
最后，我们通过酒精沉淀的方法提取转化子。
为了验证转化效率，我们进行了转化效率测试。
将转化子接种到含有抗生素的LB平板上，培养一夜后，我们观察到形成了菌落。
通过计算菌落的数量，我们可以得出转化效率。
实验结果显示，转化效率达到了10^6 CFU/μg DNA，表明我们成功转化了感受态细胞。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的关键步骤。
通过转化外源DNA，我们可以将目标基因导入大肠杆菌，实现基因克隆和表达。
本实验中使用的热激转化和酒精沉淀方法是常见的转化方法，其简单易行，且转化效率高。
实验大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
。
感受态细胞 质粒DNA
蒸馏水
转化体系 100ul
1ul
空白对照 100ul
1ul
实验步骤
2、轻轻混匀，立即放在冰上30min； 3、42℃水浴90s，然后迅速冰浴1-2min； 4、加入0.8ml LB液体培养基，160r/min，37 ℃培养
40min； 5、稀释后，取培养液100ul，涂布于具有50ug/ml
制备感受态旳细胞一般选择对数生长久，新鲜幼嫩旳 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化旳关键。常用旳感 受态制备措施涉及KCl、CaCl2等措施；后者因为操作简便 且符合大多数旳分子克隆要求，因而被广泛采用。
实验原理
CaCl2 法旳基本原理： 细菌处于低温（0℃）和低渗旳CaCl2溶液
中，菌体膨胀，细胞膜旳通透性发生了临时性 旳变化，转化混合物中旳DNA形成抗DNase旳 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃ 进行短时间旳热激处理，增进DNA旳吸收。
实验原理
2、质粒旳质量和浓度：用于转化旳质粒DNA应主要 是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA旳浓度在一 定范围内成正比，但当加入旳外源DNA旳量过多或 体积过大时，转化效率就会降低。
1ng旳超螺旋态DNA即可使50μl 旳感受态细胞到 达饱和。一般情况下，DNA溶液旳体积不应超出感 受态细胞体积旳5％。
实验原理
CaCl2 法简便易行，用 CaCl2法制备旳 感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5106-2107个转化菌落。在实际工作 中，每微克有105以上旳转化菌落足以满足 一般旳克隆试验。
制备出旳感受态细胞临时不用时，加入 占总体积15％旳无菌甘油于-70℃，能够保 存六个月。
实验原理
实验大肠杆菌感受态 细胞的制备和转化
25 生物化学实验--大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化【目的】1. 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验方法和技术。
2. 熟悉大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验原理。
【原理】1. 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化原理细菌的生物学特性由于吸收外源 DNA 发生可遗传的改变叫转化，在基因克隆技术中，转化（ transformation ）特指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
转染（ transfection ）是指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。
未经特殊处理的宿主细胞较难进行转化，细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。
重组 DNA 转化细菌的技术操作关键就是通过一定的方法，人工诱导细菌进入一个敏感的感受态，以便外源 DNA 进入细胞内。
本实验采用氯化钙溶液处理对数生长期的E.coli. DH-5α细胞 , 使E.coli. DH-5α细胞的通透性增加，摄取外来 DNA （本实验中的质粒 DNA 为 pUC-18 ）能力增加，其原理为当细菌处于0 ℃ ， CaCl 2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNAase 的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。
2. 转化大肠杆菌的筛选由于 pUC-18 （如图）含有 Amp r （氨苄青霉素抗性）基因便具有在含 Amp 培养基上生长的能力，形成单个菌落，而未转入 pUC-18 的E.coli. DH-5α细胞，不具有 Amp r 基因，在含 Amp 的培养基中，生长受到抑制，不能形成肉眼可见的菌落，从而使转化和未转化宿主细胞得以区分开来。
进一步将转化菌涂布在含IPTG 和 X-gal 的 LB 平板上，由于 pUC-18 还带有一段大肠杆菌β- 半乳糖苷酶基因（ lacZ ）的启动子及其编码α- 片段的 DNA 序列，此结构成为lacZ ＇基因，在 lacZ ＇基因中的靠近 5 ＇端有一段多克隆位点（ MCS ），而大肠杆菌含有β- 半乳糖苷酶ω片段的编码基因，尽管载体和宿主编码的这两个片段都没有活性，但两者同时存在时能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质，这样 lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α- 互补。
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化_实验报告
分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。
体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。
感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。
本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。
进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。
而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。
感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。
本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。
大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化
含抗性的选择性培养基上，长出来的菌落感受态细胞的制备：
实验流程
1. 预培养：接一单菌落到3mL LB培养基中，370C、190rpm振荡培养过夜 2. 取 0.4mL预培养菌液转移到含40mL LB液体培养基的锥形瓶中， 370C、 250rpm振荡培养2.5-3小时（OD600 0.4-0.5） 3. 将菌液转移到1.50mL离心管中，冰上放置10min
影响转化效率的因素
细菌的生长状态(5x107个/mL) 感受态细胞的质量 试剂的质量
思考题
如阴性对照中长出菌，原因？ 在Amp培养板中，菌的密度过 高或培养时间过长时会在阳性 菌的周围长出一些小的卫星菌
外源DNA的质量与数量
器皿的洁净度 污染—尽量所有打开器皿盖的 操作都在超净台中进行
落，它们是Amps的，
原因？
4. 离心 6000rpm ，40C，10min
5. 倒出培养液，将管倒置使培养液流尽 6. 菌体加入预冷的0.1 mol/L的CaCl2 0.5mL，轻吹并悬浮细胞，冰上 30min
7. 离心 6000rpm ，40C，10min，去上清
8. 用冰预冷的0.1M的CaCl2 0.4mL用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作,此为感受
受体菌：
E.Coli DH5α
R-, Amps, pQE30 M-, Tcs
外源质粒:
Ampr抗性基因编码一种周质酶（β -内酰胺酶）可特异地切割Amp的β -内 酰胺环，从而使其失去杀菌能力
基 本 原 理
感受态（Competence)： 细菌处于容易吸收外源DNA的状态 转化（transformation)： 异源DNA分子导入受体细胞的过程 致敏过程: 用理化方法诱导细胞进入感受态的操作 细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外援DNA形成抗DNA酶的 羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面,经短时间420C热激处理,促进细胞吸 收DNA复合物 复苏：细菌在非选择性培养基上保温一段时间，使抗性的表型表达后再转到
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化报告
提高转化效率的几个因素 细胞生长状态和密度
质粒的质量和浓度
试剂的质量
防止杂菌和杂DNA的污染
2008 0
1 0
2
分 子实 生验 物 学
提高转化效率的几个因素
细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从 －70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备 感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生 长期时为好，可通过监测培养液的 OD600 来控制。 DH5α 菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同 ),这时比较合适。密 度过高或不足均会影响转化效率。
50ng,体积不超过10μ l)，轻轻摇匀，冰上30-
40min；
A.质粒DNA组：10µl 质粒DNA +50µl感受态细胞悬
液
B.空白对照组:10ul 无菌水＋50µl感受态细胞悬
液
2008 0
1 0
2
分 子实 生验 物 学
② 42℃水浴中热击90秒（勿摇动），热击后 迅速置于冰上冷却2min； ③ 向管中加入400μl LB液体培养基(不含卡那 霉素)，混匀后37℃，180rpm振荡培养 40min，使细菌恢复正常生长状态，并表达 质粒编码的抗生素抗性基因(卡那霉素 )； ④ 涂平板：将上述菌液摇匀后取80ul涂布于含 Kana的筛选平板上，在菌液完全被培养基 吸收后，37℃倒置培养皿培养12~18h。 2
2 1 0 分 子实 生验 物 学
2008 0
提高转化效率的几个因素
质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。 转化效率与外源 DNA的浓度在一定范围内成正比 ,但 当加入的外源 DNA 的量过多或体积过大时 , 转化效率 就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞 达到饱和。一般情况下 ,DNA 溶液的体积不应超过感
大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒转化一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA 分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E·coliK——12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化
基本步骤
感受态细胞的制备： 从-80°冰箱取出一管DH5ά菌种，接种环接菌划于37°C预热的无抗生 素的LB平板，37°C过夜； 挑取单克隆第二次划板（注意：三步法划板，每划完步后，接种环必须 在酒精灯上烧一下，以免菌太多，且必须冷却以后在进行下一步）； 从培养皿上挑取一单菌落与3-4mlLB培养液中（无抗生素），37°C摇 床过夜（如需要可以挑一管含抗生素的作为对照）； 将菌液倒入500mlLB培养液中（无抗生素），37°C，250rpm培养至 OD=0.375（注意：事先准备还200µ lLB培养液做对照，细菌OD值非常 重要，1-1.5个小时以后要开始测细菌浓度，细菌OD值最好不要超过 0.4）； 取800µ l菌液到无菌的甘油管中保存菌种，余下的分装到6个无菌100ml 离心管，臵于冰上30min； 2000g，4°C离心10min；
养平板倒臵于37°C培养箱；
2、加10µ l质粒到感受态细胞中（不要打匀），冰上放臵30min；
3、冰上放臵过程中准备超净工作台，移液器及枪头等均需照射紫外，准备 42°C水浴锅； 4、420C循环水浴热激90秒 5、冰浴2分钟 6、每管加800uL LB液体培养基，370C慢摇1小时（ 150rpm ）
1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coliDH5a在使用pUC系列质粒 载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可 用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1， endA1，hsdR17(rk-，mk )，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3)菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET 系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于 BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3)pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌 酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的 表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompThsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS， Camr
大肠杆菌感受态细胞的制备、质粒DNA的转化和重组子筛选
•大肠杆菌处于00C,CaCl2低渗溶 液中,菌细胞膨胀成球形, •外源DNA形成抗DNA酶的羟基钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面, •经短时间420C热击处理,促进细 胞吸收DNA复合物。然后将冰水 孵育后的细菌置于非选择性培养 基上震荡培养。 •再转到含氨苄青霉素的选择性 培养基上，长出来的菌即为转入 了外源基因的菌株。同时，也可 进行蓝白斑筛选。
感受态细胞100ul用纯水代替质粒?冰浴10分钟?426090秒静置勿摇动?迅速放到冰上冰浴2分钟?加入900ullb培养基标明组号37200rpm摇床培养45分钟实验流程质粒转化与筛选?含ap的lb固体培养基50mgl的ap倒平板每组2个凝固后涂布40?lxgal20mgml和7?liptg200mgml
实验流程（质粒转化与筛选）
含Ap的LB固体培养基(50 mg/L的 Ap)倒平板, 每 组2个，凝固后涂布40 µL X-GAL（20 mg/mL） 和 7 µL IPTG（ 200mg/mL ）。 涂布 样品(转化培养后的菌液100uL),涂布于1号平板。 阴性对照100uL ：涂布于2号平板。 倒置平板37 ℃ 培养过夜
实验原理
X-GAL
蓝色
实验原理
IPTG
实验原理
在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破 坏读码框，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列 的宿主细胞。这样，lacZ基因在宿主细胞与质粒之间实现了互 补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG 的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。 当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地 导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌 形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。
大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化【实验目的】熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。
【实验原理】当大肠杆菌生长到OD600约为0.2~0.4时，用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞，细胞膨胀成球形，可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态（感受态），处于此状态的细胞称为感受态细胞（competent cells）。
此时，若在感受态细胞中加入质粒，则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面，经过42℃短暂的热激处理后，DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞，(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费送)在不含抗生素的培养基中短暂培养，使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达，在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌（含质粒）与未转化细菌分开，转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落，而未转化的细菌则不能。
(你提供质粒和细胞，我给你免费构建稳定表达细胞系Q往圣科技3452125268)【器材与试剂】(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装)1．实验仪器培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22μm滤膜），酒精灯 (标本检测，你提供标本，我免费给你做实验，成果归你享有Q往圣科技3452125268)2．实验试剂氯化钠（AR），无水氯化钙（AR），蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，800 mL蒸馏水溶解后，(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费基因慢病毒包装)。
用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min；LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121℃高压灭菌20min，分别倒入无菌培养皿。
大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化ppt课件
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四、实验步骤
• 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
①从E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将该菌悬液 以1:30～100接种于LB液体培养基中，37℃ 250r/min活化培养2-3h至OD600=0.2-0.4时停止培 养;
②每人取1个离心管，加入1.5ml菌液，在冰上放置 10min后，于4℃，4000r／min离心2min（从这一 步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而 稳）；
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击 法， CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜 的通透性发生变化，成为能容许外源DNA的 载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
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转化（transformation）
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使 受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基 因工程等研究领域的基本实验技术。
①防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程 均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心 管等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的 试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、 DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转 化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴 定带来不必要的麻烦。
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②感受态细胞长时间处在常温状态，会严 重影响到其转化率，因此应尽量减少常温 操作，动作要迅速。
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• 实验目的 • 实验原理 • 实验试剂 • 实验步骤 • 注意事项
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。
二、实验原理细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Ampr 等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。
三、实验仪器、材料与试剂（一）、实验仪器超净工作台；低温离心机；恒温摇床；恒温箱；-70℃冰箱；恒温水浴器（二）、实验材料氯化钙（CaCl2）；胰蛋白胨；酵母提取物；氯化钠（NaCl）；氨苄青霉素；大肠杆菌DH5α；pUC19质粒；50mL离心管；吸头、试管、培养皿、锥形瓶等。
（三）、试剂1、0.1mol/L CaCl2溶液2、LB液体培养基3、氨苄青霉素（Amp），用无菌水配制成100mg/mL溶液，置-20℃冰箱保存。
四、实验步骤1、从E. coli DH5α平板上挑取1个单菌落于2 ml LB试管中，37℃，振荡，O/N；2、取500 μl菌液转到含50 ml LB三角瓶中，37℃振荡，2.5 hrs；3、将菌液转到50 ml离心管中，10 min on ice；4、离心，4 krpm，10 min，4℃，→回收细胞；5、用冰冷的10 ml的0.1 M CaCl2悬浮沉淀，30 min on ice→离心，4 krpm，10 min，4℃，→回收细胞；6、用冰冷的2 ml的0.1 M CaCl2悬浮细胞，即为感受态细胞；7、取200 μl感受态细胞，加2 μl pUC19 DNA（50 ng）混匀，30 min on ice；另设两对照：受体菌，200 μl感受态细胞+ 2 μl无菌水；质粒，200 μl 0.1 M CaCl2溶液+ 2 μl质粒DNA溶液；8、置于42℃，90 s，→2 min on ice→各加800 μl LB，37℃轻轻摇动，1 hr；9、取100 μl上述转化的感受态细胞，涂皿（含100 μg/ml Amp）→倒置平皿，37℃，O/N，出现菌落。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和基因工程领域。
在这个实验报告中，我们将讨论大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验。
实验目的：本实验的目的是制备大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
通过这个实验，我们可以研究细菌的基因表达和遗传变异。
实验材料和方法：1. 大肠杆菌培养基：含有适当营养物质的LB培养基。
2. 大肠杆菌感受态细胞：选择性培养基（如含有抗生素的培养基）筛选得到的细菌株。
3. 目标DNA：从其他生物体中提取的DNA片段。
4. 热激转化装置：用于将DNA转化到感受态细胞中的装置。
5. 热激转化条件：将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，然后在热激转化装置中进行热冲击。
实验步骤：1. 制备感受态细胞：从大肠杆菌培养基中挑取一小部分细菌，接种到含有适当抗生素的选择性培养基中。
在37摄氏度下孵育过夜。
2. 提取目标DNA：从其他生物体中提取目标DNA片段，可以使用商业提取试剂盒或自制提取试剂进行操作。
3. 转化实验：将感受态细胞取出，进行适当的处理，如洗涤和离心。
将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，并在热激转化装置中进行热冲击。
然后将细菌培养在含有抗生素的选择性培养基上。
4. 孵育和筛选：将转化后的细菌培养在含有抗生素的选择性培养基中，以筛选出成功转化的细菌。
在孵育过程中，可以使用PCR或其他方法进行确认。
结果和讨论：通过本实验，我们成功制备了大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
在筛选过程中，我们观察到在含有抗生素的培养基上生长出了抗性菌落，表明转化成功。
通过进一步的分析，如PCR检测，我们可以确认转化的目标DNA是否存在于细菌中。
这个实验的结果对于后续的基因表达研究和遗传工程应用具有重要意义。
大肠杆菌是常用的宿主细胞，可以用于大量表达外源蛋白和合成重组蛋白。
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大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化【目的】1. 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验方法和技术。
2. 熟悉大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验原理。
【原理】1. 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化原理细菌的生物学特性由于吸收外源 DNA 发生可遗传的改变叫转化，在基因克隆技术中，转化（ transformation ）特指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
转染（ transfection ）是指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。
未经特殊处理的宿主细胞较难进行转化，细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。
重组 DNA 转化细菌的技术操作关键就是通过一定的方法，人工诱导细菌进入一个敏感的感受态，以便外源 DNA 进入细胞内。
本实验采用氯化钙溶液处理对数生长期的 E.coli. DH-5α细胞 , 使 E.coli. DH-5α细胞的通透性增加，摄取外来 DNA （本实验中的质粒 DNA 为 pUC-18 ）能力增加，其原理为当细菌处于0 ℃ ， CaCl 2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNAase 的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。
2. 转化大肠杆菌的筛选由于 pUC-18 （如图）含有 Amp r （氨苄青霉素抗性）基因便具有在含 Amp 培养基上生长的能力，形成单个菌落，而未转入 pUC-18 的 E.coli. DH-5α细胞，不具有 Amp r 基因，在含 Amp 的培养基中，生长受到抑制，不能形成肉眼可见的菌落，从而使转化和未转化宿主细胞得以区分开来。
进一步将转化菌涂布在含 IPTG 和 X-gal 的 LB 平板上，由于 pUC-18 还带有一段大肠杆菌β- 半乳糖苷酶基因（ lacZ ）的启动子及其编码α- 片段的 DNA 序列，此结构成为 lacZ ＇基因，在 lacZ ＇基因中的靠近 5 ＇端有一段多克隆位点（ MCS ），而大肠杆菌含有β- 半乳糖苷酶ω片段的编码基因，尽管载体和宿主编码的这两个片段都没有活性，但两者同时存在时能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质，这样 lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α- 互补。
由α- 互补而产生的 LacZ + 细菌在诱导剂 IPTG 的作用下，在生色底物 X-gal 存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
然而，当外源 DNA 插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α- 互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。
图 23-1 质粒 pUC18 图谱图 23-2 质粒 pUC18 酶切图谱【器材】• 高速温控离心机• 超净工作台• 恒温水浴箱• 10ml 离心管、 1.5m 1EP 管• 培养皿（φ 9cm ）• 酒精灯• 推子• 摇床• 可调微量移液器• 10ml 试管、 100ml 三角瓶• 恒温培养箱• 0.45μm 、 0.22μm 滤膜• 封口膜【试剂】1 ．E.coli. DH-5α菌种2 ． pUC-18 质粒（ 0.5μg/μl ）3 ． LB （ Luria-Bertani ）液体培养基：细菌培养用胰化蛋白胨（ bacto-tryptone ） 10g 、细菌培养用酵母抽提物（ bacto-yeast extract ） 5g 、NaCl 10g 、加去离子水至 800ml ，搅拌，使溶质完全溶解。
用 5mol/L NaOH （约 0.2ml ）调节 pH 值至 7.4 ，加去离子水至总体积为 1L ，以 1.034×105 Pa 高压蒸气灭菌 20 分钟。
4 ． LB 固体培养基上述 LB 液体培养基中按 15g /L 加入细菌培养用琼脂（ bacto-agar ），以1.034×10 5 Pa 高压灭菌 20 分钟。
溶液尚未冷却时，即应取出培养基，并轻轻转动以使溶解的琼脂均匀分布于整个培养基溶液中。
5 ． 0.1mol/L CaCl 2 溶液用蒸馏水溶解 11 g 的 CaCl 2 ，定容至 1000 ml ， 1.034×10 5 Pa ，高压灭菌 20 分钟， -20℃ 保存。
6 ．氨苄青霉素（ Amp ）溶液取未开封氨苄青霉素粉 0.5g ，加入灭菌蒸馏水 5m 1 ，配制成 100mg/ml 溶液，过滤除菌， -20℃ 分装保存。
7 ． IPTG （异丙基 -β-D- 硫代半乳糖苷）取 1g IPTG 溶于 4ml 去离子水中，再用水补至 5ml ，用 0.22μm 滤膜过滤除菌，每份 1ml 分装后， -20℃ 保存。
8 ． X-gal （ 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 -β-D- 半乳糖苷）用二甲基甲酰胺溶解 X-gal 配制成 20mg/ml 的储存液，不需滤过除菌，保存于1.5mlEP 管中，用铝箔包裹贮存于 -20℃避光保存。
9 ．甘油 50ml取 50ml 甘油， 121℃ ,30 分钟高温灭菌。
【操作】1 ．感受态细胞的制备灭菌操作步骤于超净工作台中进行，下同。
（ 1 ）用无菌小枪尖从E.coli. DH-5α LB 平板上挑单菌落，将此枪尖放于含5m 1 LB 液体培养基的试管中， 37℃， 200r/min 振荡过夜，第二天将此试管中的 5m 1 LB 培养基接种于含 100m 1 LB 液体培养基的三角瓶中， 37℃，300r/min 振荡培养 2 ～ 4h ，到 A 600 一般在 0.2~0.4 之间（约含 5×10 7 个细菌 / ml ），为对数生长期或对数生长前期。
（ 2 ）将培养物于冰上放置 10 分钟，然后转移入两个 50ml 离心管中，4℃， 4000 r/min 离心 10 分钟，弃去上清，倒置离心管 1 分钟，流尽剩余液体，加入 10m 1 预冷的 CaCl 2 溶液，轻轻悬浮细菌，置冰浴中 10 分钟；（ 3 ）于 4℃， 4000 rpm 离心 10 分钟回收细胞，轻轻倒去上清，每 50ml 的原培养物再加入 2ml 冰冷的 CaCl 2 溶液，按 200μl 一管分装于 1.5m 1EP 管中 , 若不马上进行转化，该感受态细胞可以加入终浓度为 10% 的灭菌甘油，置于 -70℃冻存。
2 ．大肠杆菌质粒转化（热休克法）（ 1 ）取一支感受态大肠杆菌加入 50μl 含 20ng pUC-18 的 TE 缓冲液，温和混匀，置冰上 30 分钟，此步骤操作时应设立两个对照组：①取 50μl 含 20ng pUC-18 的 TE 缓冲液加入感受态细胞，做阳性对照（ A 组）；②不加任何 DNA 的感受态细胞作阴性对照（ B 组），仅加入 50μlTE 缓冲液。
（ 2 ）转移到 42℃水浴中放置 90 秒，迅速放回冰中。
（ 3 ）将细胞冷却 1-2 分钟后，立即加入 0.8 m 1 LB 液体培养基，混匀，37℃保温 45 分钟。
3 ．转化大肠杆菌的筛选（ 1 ） Amp 筛选然后各取 50μl A 组、 B 组中的培养物分别用推子涂布于两块含 Amp(100μg/ml 的 LB 平板中。
另作一对照组，另各取 50μl A 组、 B 组中的培养物用推子涂布于两块不含 Amp 的 LB 平板中。
将上述平皿倒置放入 37℃恒温培养箱，培养过夜；第二天观察各平皿上细菌生长情况，并作记录。
（ 2 ）β- 半乳糖苷酶系统筛选在预制好的 LB 琼脂平板（含 Amp 100μg/ml ）上，加上 40μl 20mg/ml 的 X-gal 和 4μl 200mg/ml 的 IPTG 溶液；用灭菌推子，将 X-gal 和 IPTG 溶液均匀涂布于琼脂凝胶表面， 37℃放置 3 小时，待溶液全部吸入琼脂表面，将取 A 组 50μl 细菌涂布于平板中，将平皿倒置放入 37℃恒温培养箱，培养过夜 , 第二天观察各平皿上细菌生长情况，并作记录。
【注意事项】1 ．在实验过程中注意无菌（实验菌除外）操作。
2 ．必要的对照在实验过程中非常重要，不可不设。
【思考题】1 ．为什么在热休克的情况下制备感受态细胞？2 ．药物筛选法和蓝白斑筛选法（α- 互补）的原理各是什么？3 ．氯化钙法和氯化镁法制备感受态细胞的优缺点各是什么？附：氯化镁法【试剂】• 1×TSS 致敏缓冲液• 10% PEG （ MW=4000 ）• 5% DMSO （ 0.45μm 过滤）• 50mmol/LMgCl 2用 LB 培养基制备，调 pH 值至 6.5【操作】1 感受态细胞的制备及长期冻存（一）E.coli. DH-5α菌株于 LB 培养基中生长至对数前期，然后转移入两个50ml 离心管中，4℃ ， 4000 rpm 离心 10 分钟，弃去上清。
（二）用 5ml 的1×TSS 致敏缓冲液（冰预冷）悬浮细胞，然后分装成 0.1ml 一份速置冰上温和混匀， -70℃ 贮存。
使用前，从 -70℃ 取出贮存的感受态细菌，冰上放置 5 分钟后即可。
2 转化细菌（一） -70℃ 取出制备好的感受态细菌，冰上放置 5 分钟即可直接转化。
（二）每 0.1ml 感受态细胞加入 1μl ，混匀后冰上放置 30 分钟。
（三）加入 0.9mlLB 培养基, 37℃ 保温 45 分钟。
（四）取 200μl 用推子涂布于琼脂平板上， 20 分钟将平皿倒置放入37℃ 恒温培养箱，培养过夜 , 第二天观察各平皿上细菌生长情况，并作记录。