现代免疫学实验技术 酶标抗体

《现代免疫学实验技术》

HRP标记抗体的制备用HR标记抗体需借助交联剂的作用，将酶连接在抗体分子上。常用的交联剂为戊二醛和过碘酸钠。

(1)戊二醛交联法戊二醛(掣utaralde—hYde，CHO-(CH，)：—CHO)是一种常用的同型双功能交联剂，它的两个醛基可分别与HRP(正)和抗体蛋白(P)的氨基形成Schiff氏碱(—N=C—)，将两个分子以五碳桥连接起来。

图5—10 戊二醛交联酶与抗体的反应式

戊二醛连接反应是最温和的交联反应之一。可在4—40~C温度范围，pH6．0—8．0的缓冲溶液中进行，分为一步法和二步法。一步法是将酶和待标记抗体混合，同时加入戊二醛进行交联反应。此法操作简便，适用于各种酶一抗体(抗原)系统。但由于不同的酶所含氨基的数量不同，其交联产物不均一，除形成酶一抗体结合物外，酶与酶、抗体与抗体之间也可发生交联。并且对不同酶的交联率也不相同，HRP的交联量一般仅6％左右。二步法是将酶先用戊二醛处理，形成酶-戊二醛结合物，经过透析或层析除去未结合的戊二醛，然后再与抗体结合。酶结合物的质量较均一，产率亦可提高到13％。

戊二醛二步法操作步骤：

①用0．01moL／L、pH6．8PB将25％戊二醛稀释为1．25％；

②称取10mgHRP溶于0．2mil．25％戊二醛，室温(20~C左右)结合18h；

③将反应物通过预先用0．15mol／LNaCl平衡的5ephadexG-50凝胶柱，用平衡液洗脱，去除游离的戊二醛；或对0．01mol／L，pH7．2PBS，4T透析过夜；

④将5mg抗体IeC溶于lan 0．15moL／LNaCl，再与醛化HRP溶液(10mg／an)混合。加入0．1ndlmol／L，pH9．6碳酸盐缓冲液，调节pH至9．0—9．5；

⑤于4~C，电磁搅拌下结合24h。然后加入0．1ml 0，2mol／L赖氨酸(0。29g溶于10ral 蒸馏水)；以封闭残留的醛基，终止反应；

⑥4~C放置2h信装入透析袋，对0．01mol／L、pH7．2PBS，4~C透析过夜；或通过SephadexG-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第l峰洗脱液。加入等量60％甘油防腐，小量分装，4~C或—20~C保存。

(2)改良过碘酸钠法HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠(Nal04)氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成Schiff碱。为了防止酶蛋白的氨基与醛基反应发生自身偶联，在标记前先用2，4—二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白中残存的α-和ε-氨基。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠(NaBH4)还原成稳定的结合物，见图5—11。

HRP—OH—NalO~HRP—CHO—NH2-IgG，HRP—CH二N—IgC—NaHB％,!HBP—cH2一NH—IgC．图5—11 过碘酸钠标记法反应式

操作步骤

①取5mgHRP溶于1mL 0．3mol／L，pH8．1 NaHC03，加入1％DNFB无水乙醇溶液0.1mL，室温下轻微搅拌作用Ih；

②加1mL 0．06mol／L NaIO4，室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色；

③加1mL 0．16mol／L乙二醇，室温下轻搅1h，终止氧化反应；

④装入透析袋，对0.01mol／L，pH9．5碳酸盐缓冲液1000ml，4℃透析过夜，换液3次；

⑤于3ml醛化HRP溶液中加入含5mg IgG的碳酸盐缓冲液lmL，室温避光轻搅下结合2-3h。

⑥加人5mgNaHB4，放4℃3h或过夜(亦可加0．2ml2moL／L、pH9．5乙醇胺，4~C放置7h)；

⑦装入透析袋，对0.01mol／L，pH7．2 PBS，4℃透析24h，换液3次；⑧3000r／min离心30min，除去沉淀物。上清液通过Sephadex G-200凝胶柱层析，PBS洗脱。最后在结合物内加入BSA至蛋白浓度为10mg/mL。小量分装，低温保存备用。