第五章 凝胶过滤层析(高等教学)
凝胶层析技术(凝胶过滤)
目前使用较多的是葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶，其商品为生物凝胶-P（Bio-Gel P）组成单位是丙烯酰胺（CH2=CH-CONH2）与 甲叉双丙稀酰胺，共聚交联成聚丙烯酰胺。 优点：全惰性的，适宜作为凝胶层析的载体。 缺点：不耐酸，遇酸时酰胺键会水解成羧基，使凝 胶带有一定的离子交换基团，一般只在pH为11范 围内使用。 交联葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex）。 优点：具有良好的化学稳定性等优点。目前最常用。
原理
● 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每 个颗粒犹如一个筛子。 ● 当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子 质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙， 随着溶剂流动，首先流出层析柱； ● 相对分子质量较小的物质可自由地进出 凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率 慢而最后流出层析柱。 ● 中等大小的分子在大分子物质与小分子 物质之间被洗脱。 ● 这样，经过层析柱，混合物中的各物质 按其分子大小不同而被分离。
3、样品的加入 吸取1ml血红蛋白——核黄素混合液，加到凝胶床的表面上， 不要沿柱壁加样品，注意加样时勿将床冲起。 打开出口管，用少量水流一下，接触过样品的管壁，再加水扩 展洗脱，用试管将洗脱液。 4、洗脱： 加0.1mol/l的Nacl溶液洗脱，流速为每分钟1ml,两分钟收一 管。 5、比色测定：波长，红色部分520nm,黄色部分450nm 绘制洗脱曲线： 以光密度为纵座标，以时间为横座标，并标明洗脱峰的名称 。 6、凝胶的回收。
特点：与被分离物质分子的 大小和凝胶颗粒孔隙的大小 有关
Kd=0
大分子量 小分子量
Hale Waihona Puke 0＜Kd<1 Kd=1
洗脱体积
应用
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、 多糖、核酸类等物质。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可 以完全将它们分开。 利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、 去热源和脱色。
凝胶过滤层析
C. Sephadex G-150（分级范围， 5,000-400,000 D）
凝胶粒度的影响
凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱 流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒 凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐 等。 在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μ m左右较合适。对于在水中 保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150μ m左右。凝胶颗粒大小 要均匀，这样流速稳定，效果较好
层析柱 （ a ）自制简易层祈柱（ 1 ．玻璃 管；2.橡皮塞；3．尼龙网）； （b）普通商品柱； （c）双底板层析柱（1.洗脱液进 出口； 2. 多孔底板； 3 ．柱床； 4 ．恒温水进口； 5 ．恒温水出口； 6．可调节的塞子）
4、样品的准备
样品的粘度：粘度大产生介质吸附， 一般要求样品粘度小于0.01Pa· s
选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小 分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd=0， 小分子的Kd＝1。这样能取得最好的分离效果。
例题：从某蛋白质溶液（MW=5500D）中除去无机盐，应选择下 列哪种凝胶最合适？
A. Sephadex G-15（分级范围， <1,500 D） B. Sephadex G-25（分级范围，1000-5000 D）
凝胶过滤层析
定义
凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层 析（size exclusion chromatography）、分子筛层 析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗 透层析（Gel Permeation Chromatography）
凝胶过滤层析脱盐
2.点击“方法”， 打开界面，点击界 面左下方选项，分 析输入参数。
39
点击“方法”，再 点击下方的“采样 控制”，将采样结 束时间改为180分 钟，点击“采用”。
40
记录图谱 保存路径
点击“电压范 围”及“时间 范围”调整电 压值范围1~10 和时间值范围 0~10。（放大 查看）
下端柱头结构
密封圈调节螺帽 的作用： 旋松时密封圈 直径缩小，便于 取出；旋紧时密 封圈被压扁，直 径变大，防止柱 体漏液。
滤膜 密封圈 垫圈
密封圈调 节螺帽
17
二 . 层析柱的安装
洗净层析柱，垂直固定在柱架上:
18
层析柱的安装
旋松密封圈调节螺丝 取下柱头。检查滤膜 是否存在，将柱头装 进玻璃柱体内。
37
操 作 步 骤
将数据采集器通道1 （或通道2）的导线 按颜色分别接在紫 外检测仪背面“记 录仪”的接口上， 要接牢固。
打开电脑，双 击桌面的“N 2000 在线生化 工作站”，选 择通道，进入 工作站界面。
38
3.点击“数据采 集”，进入层析 图谱界面
1.点击“实验信 息”，输入相关 的信息
四. 检测仪器的准备
打开紫外检测仪，预热。按照“N 2000 生化工作 站使用方法”及“核酸蛋白检测仪使用方法”连 接导线、设置参数，调整好仪器。点击“基线查 看”观察基线。
24
样品的准备：
用20ml 0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液溶 解CHOM沉淀。若溶解后的溶液混浊，要 用滤纸滤去不溶物。收集滤液上 Sephadex G-25凝胶层析柱脱盐。
紧上 密紧 封柱 圈头 调螺 节帽 螺后 丝记 。住 旋
19
三. 装 柱
凝胶过滤层析
（3）聚丙烯酰胺凝胶
商品名Bio－gel 与甲叉双丙稀酰胺交联，过硫酸铵为催化剂， TEMED加速剂。改变交联剂的浓度，可以改变 孔隙，交联剂越多，孔隙越小； 常用型号 P-2和P－300，数字×103为分离的 分子量极限 聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本 近似于Sephadex。排阻极限最大的Bio-Gel P-300为4×105 性质 耐酸，pH1－10稳定，耐受变性剂（尿素、胍 盐等）
根据经验，组别分离时，大多采用230cm长的层析柱，分级分离时，一般需 要100cm左右长的层析柱，其直径在15cm范围内。
2）装柱 干装法 容易产生气泡 湿装法 先将适量溶剂加到柱中，将浸泡 好的凝胶缓慢倒入，一直浸泡在溶剂中， 沉降至柱高1/4－1/3时打开下端出口， 溶剂流出。
3）鉴定柱的质量 用带色的物质或蛋白质过柱均匀下降即可。 细胞色素c、血红蛋白等物质配成2mg/ml的溶 液过柱。
几种凝胶的比较
种类（商品名） 商品型号 葡聚糖凝胶 （Sephadex） 琼脂糖凝胶 （Sepharose） G15， G25， G100… 2B, 4B, 6B… 型号中数字意义 每g的吸水量(ml)×10 数字越大，筛孔越大 颗粒中琼脂糖的含量 （％）； 数字越大，筛孔越小 排阻限度 6×105 稳定性 水、盐、碱、弱酸 中稳定；对强酸敏感
分配系数Ｋav 分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。 对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水 体积和在外水体积中的浓度分配关系。
Ｋav＝（Ｖｅ－Ｖｏ）／(Ｖt － Vo)
它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔 隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无 关，也就是说它对每一物质为常数与柱的 物理条件无关。
第五章+凝胶过滤
分类
葡聚糖凝胶（Sephadex） 天然琼脂糖（Sepharose、Bio-gel A） 交联琼脂糖（Sepharose CL-） 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel） 交联葡聚糖 双丙烯酰胺共聚凝胶（Sephacry1） 交联葡聚糖与葡聚糖共价结合的凝胶（Superdex
）
各 种 凝 胶 层 析 的 基 质
链将发生少许水解作用；在0.2mol/L NaOH 溶 液中（室温下）处理100小时，对其低流速和 多孔性没有明显影响； c. 清洁剂（如SDS）、6mol/L盐酸胍和8 mol/L 尿素溶液可作洗脱剂，高温（120℃）消毒（ pH= 7时）处理后，层析性质没明显变化。
Sephacryl 能用于分离蛋白质、核酸、多糖和 蛋白聚糖（Proteoglycans）。也可用于大的 病毒颗粒（直径 >300-400 nm）的分离。层 析时，用细颗粒凝胶分辨率高。
粗颗粒凝胶流速快，宜用小直径的层析柱，如操 作得当，可得到较满意的结果。
2．凝胶用量的计算
根据层析柱的体积和干凝胶的膨胀度，可计算 出所需干凝胶的用量：
干凝胶用量（g）=∏r2 h / 膨胀度（床体积/克干 胶）
用此法计算出的干凝胶用量还需增加 10%-20％ ，因为凝胶在处理过程中会有一部分损失。
不同类型凝胶的筛孔的大小不同
凝胶过滤基本原理
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网 孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空 间向下流动，因此流程较短，移动速度快，所 以首先流出。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网 孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下 移动过程中，因此流程较长，移动速率慢，所 以最后流出。
不同型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，膨胀 度、吸水量、筛孔的大小和分组范围有明显 的差异。
凝胶过滤层析
三 操作步骤
1 凝胶的选择和预处理 本实验样品中含有分子量差异不大的多中组 分，其中目的物为分子量60kd 的可溶性蛋白 质，因此属大分子化合物的分离纯化，故选 用SephadexG-75。对球形蛋白质而言，其排 阻限为3000-70000。 称取40g SephadexG-75，加入10倍以上吸液 量的蒸馏水浸泡，在水浴加热时充分膨胀。
三 操作步骤
4 样品预处理及加样 蛋白质样品浓度一般以不大于4%为宜，溶剂为洗脱液。 如样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后再上柱。 将床面多余的洗脱液除掉，吸至离层析床面2厘米处为止。 将出口打开，使床面的洗脱液流至1毫米，关闭出口。用 加样器将样品加入床表面1厘米左右，再打开出口，使样 品渗入凝胶内。样品加完后，用尽量少的洗脱液洗涤表 面1-2次。当样品完全渗入凝胶内后，再仔细加入洗脱液 至离床面3-4厘米处，即可接上洗脱瓶进行层析。
实验六 凝胶过滤层析
一 实验原理
凝胶层析是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相， 由于在层析过程中样品不同的蛋白质具有不同的洗脱， 使不同的分子量的组分得以分离的层析方法。凝胶层 析的分离过程是在装有多孔物质如交联聚苯乙烯、多 孔玻璃、多孔硅胶、交联葡聚糖等填料的柱中进行的。 填料颗粒含有许多不同大小的孔隙。这些孔隙对于溶 剂分子而言是很大的，他们可以自由扩散出入。对于 溶质分子而言，如果分子大小合适时，则可以不同程 度地往孔隙中扩散，大分子量的溶质分子只能占有较 小的孔隙，而小分子量的溶质分子除能占住大孔隙外， 还可以占有另外一些起更小的孔隙。
一 实验原理
所以随着溶质分子尺寸的减小，其占有 孔隙体积迅速增加。当具有一定分子量 分布的高聚物溶液从柱中通过时，由于 溶质分子在孔隙中溶剂与颗粒溶剂之间 进行扩散分配的差异造成较小的分子在 柱中停留的时间比大分子停留的时间要 长，所以整个样品按分子大小顺序而分 开，最先洗脱出来是最大的分子。
凝胶过滤层析法教学专用
15
2013年8月20日星期二
16
Bio－Gel A系型号及性能
2013年8月20日星期二
17
Sepharose系型号能性能
2013年8月20日星期二
18
Sepharose是该系中最早的产品， 为非交联结构，因此不能进行高压 灭菌，仅能在2～40℃范围内使用。 根据琼脂糖含量的不同，对含量为2 ％、4％及6％的产品分别命名为2B、 4B和6B。由于新型凝胶的不断出现， 此型凝胶有逐渐被淘汰的趋势。
2013年8月20日星期二 27
2013年8月20日星期二
28
Sephacryl系列产品性能
2013年8月20日星期二
29
(五)、Superdex系列产品 是最新的凝胶 过滤介质，属BioProcess介质中的一种。 是将葡聚糖以共价键方式结合到高交联 的多孔琼脂糖珠体上形成的复合凝胶。 是将交联葡聚糖优良的过滤选择性及高 交联的琼脂糖的物理化学稳定性集于一 身的具有优良选择性和高分辨率的产品。 可在0.1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液中 40℃处理400小时而分辨率保持不变。
2013年8月20日星期二
30
Superdex结构
2013年8月20日星期二
31
Superdex(BioPrecess介质)素列产品性能
2013年8月20日星期二
32
(六)、聚乙烯醇系(Toyopearl)：以交联 聚乙烯醇为骨架的凝胶过滤介质，20世 纪80年代初部世，由美国R&H公司与日 本曹达公司联合开发。是多孔的三维网 状结构，大分子链上含有丰富的羟基， 使其具有高度亲水性，进行化学改性后 可转变为含有多种功能基的离子交换剂 及亲和吸附剂。Fractogel TSK是该系列 的类似产品，适用于HPLC(高效液相层 析)。
凝胶过滤层析的原理及应用
凝胶过滤层析的原理及应用1. 引言凝胶过滤层析是一种常用的生物化学实验技术，它基于凝胶质地的特性，在生物分子的分离和纯化过程中发挥重要作用。
本文将介绍凝胶过滤层析的原理以及其在实际应用中的一些例子。
2. 原理凝胶过滤层析的原理是基于分子在凝胶质地中的大小排列和相互作用的差异。
凝胶是一种具有多孔结构的材料，其孔径可以通过调整凝胶成分和交联程度来控制。
较大的分子无法穿过较小的孔径，因此会在凝胶质地中滞留，而较小的分子则可以自由通过凝胶。
3. 凝胶的种类凝胶过滤层析常用的凝胶包括聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）和琼脂糖凝胶（agarose gel）等。
聚丙烯酰胺凝胶适用于分离小分子量的蛋白质和核酸，而琼脂糖凝胶则适用于大分子量的生物大分子的纯化和分离。
4. 凝胶过滤层析的步骤凝胶过滤层析主要包括样品预处理、样品加载、层析和洗脱等步骤。
4.1 样品预处理样品预处理是为了使样品适应凝胶过滤层析的条件。
常见的样品预处理包括酸碱调节、盐浓度调整和添加缓冲剂等。
4.2 样品加载样品加载是将预处理好的样品加入凝胶中。
通常可以通过吸引力（如电泳力）或压力驱动来实现样品的加载。
4.3 层析层析是指将样品在凝胶质地中进行分离的过程，其中较大分子滞留在凝胶中，而较小分子则通过凝胶自由扩散。
层析时间可以根据实验需要进行调节。
4.4 洗脱洗脱是将目标分子从凝胶中提取出来的过程。
常见的洗脱方法包括添加高浓度盐溶液和改变pH值等。
5. 应用凝胶过滤层析在生物化学实验中有广泛的应用，以下是一些常见的应用例子：5.1 蛋白质纯化通过调整凝胶孔径和交联程度，可以将不同分子量的蛋白质分离和纯化。
凝胶过滤层析在蛋白质纯化中起到了关键的作用，可以实现高效高纯度的蛋白质纯化。
5.2 DNA片段分离凝胶过滤层析也可以用于DNA片段的分离，常见的应用包括PCR产物纯化、DNA限制性酶切产物分离等。
通过选择适当的琼脂糖凝胶孔径，可以将目标DNA片段从其他杂质DNA中分离出来。
凝胶过滤层析
凝胶及柱的选择
ห้องสมุดไป่ตู้
•凝胶的处理及装柱
凝胶干粉的溶胀（热溶 胀）、浮选、抽气、蓝 色葡聚糖检查、装柱、 平衡 装柱时要注意操作压。 操作压=柱内液面和出水 接管末端的高度差
样品上柱 洗脱收集
部分收集器、核酸蛋白检测仪
（蛋白质在280nm处的光吸 收值与其浓度成正比） 凝胶的保存方法
0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰
3.离子交换层析 固定相为离子交换剂，利 用各组分对离子交换剂的亲和力不同而 进行分离。 4.凝胶层析 固定相为多孔凝胶，利用各 组分在凝胶上受阻滞的程度不同而进行 分离. 5.亲和层析 根据生物特异性吸附进行分 离，固定相只和一种待分离组分有特异 性的亲和能力而结合，而与无结合能力 的其他组分分离。被分离的大分子与固 定相发生可逆的非共价结合（如：抗原 与抗体、激素与受体、酶的活性中心与 专一的底物等。）
凝胶过滤层析 （分子筛层析、排阻层析）
层析技术的分类： 按层析原理的分类： 1.吸附层析 固定相是固体吸附剂，利用各 组分在吸附剂表面吸附能力的差别而进 行分离。 2.分配层析 固定相为液体，利用各组分在 两种不相溶的溶剂间有不同的分配系数 来实现分离的方法。 分配系数K=（固 定相中溶质的浓度）/（流动相中溶质的 浓度）
6． 装完后上样前要用洗脱液平衡。 7． 要稳压，控制洗脱液排出口与洗脱瓶 之间的高度差，并控制洗脱速度，速度 为6—7滴/分钟。 8． 使用过的柱用2倍洗脱液平衡后可再 上柱使用。 9. 上样时，缓慢沿层析柱内壁加于柱床 表面。
应用
a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 浓缩 c. 蛋白质分子量的测定
装柱的注意事项： 1. 柱要保持垂直。 2. 液面要高于胶面。 3． 要根据所需纯化物质的分子量选择胶 的孔径。本实验用G-50。 4． 胶要充分膨胀，并去掉小颗粒。 5． 装柱要均一，胶面要平整，柱不能留 有气泡（包括死空间），必要时可用玻 棒在凝胶表面轻轻搅拌，再让凝胶自然 沉淀。胶柱不能有断层。否则得重装。
第五章-凝胶过滤层析
复习
根据凝胶床的组成，总柱床体积等于外水体积、内水体积 与凝胶体积之和：
Vt=V0+Vi+Vg
凝胶柱体积参数示意图
26
复习
凝胶过滤洗脱曲线示意图 （组分A为全排阻分子，组分B为部分渗透分子，组分C为全渗透分子）
洗脱体积Ve定义为自样品加至层析柱上部开始，至洗脱组分达到最 大浓度（对映洗脱峰峰顶）时流经层析柱的洗脱液的体积.
3
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
一、凝胶过滤的概念
不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同, 凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层 析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.
4
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶色谱分离原理
5பைடு நூலகம்
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
12
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶过滤洗脱曲线示意图 （组分A为全排阻分子，组分B为部分渗透分子，组分C为全渗透分子）
13
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
所示层析图谱中，样品由三种组分组成。 组分A为全排阻分子，分子量大于凝胶分级范围上限，不能进入 凝胶网孔，经凝胶颗粒间隙被洗脱，该组分的洗脱体积Ve等于外 水体积V0（Ve=V0）。 组分C为全渗透分子，分子量小于凝胶分级范围下限，完全渗透 进入凝胶网孔内，在正常洗脱条件下，与凝胶间不存在吸附作用 时，此类组分的洗脱体积是最大的，等于外水体积V0与内水体积 Vi之和（Ve=V0+Vi）。 组分B为部分渗透分子，分子量处于凝胶分级范围内，是此类凝 胶能有效分离的物质。根据组分B的分子量，该组分能以一定程 度进入凝胶网孔之中，其洗脱体积Ve处于组分A与组分C之间 （V0<Ve<V0+Vi）。
凝胶过滤层析技术原理讲解
凝胶过滤层析技术原理讲解凝胶过滤层析技术（GFC，Gel filtration chromatography）是一种基于分子大小差异的分离技术。
该技术通过在一个多孔凝胶柱中进行分离，使分子根据其大小在凝胶柱中的迁移速率不同而得到分离。
本文将详细讲解凝胶过滤层析技术的原理。
凝胶过滤层析技术的原理基于分子在多孔凝胶柱中迁移的速率与其体积大小成反比的规律。
凝胶柱中的多孔凝胶由多聚物（如聚丙烯酰胺、海藻酸钠等）构成，呈现出一定的孔径分布。
分子小于凝胶孔径的分子可以进入孔道中，而大于凝胶孔径的分子则无法进入孔道，只能沿凝胶颗粒表面通过。
因此，相对较大的分子在凝胶柱中的迁移速率更快，相对较小的分子则迁移速率较慢。
具体而言，凝胶过滤层析技术分为两个主要步骤：样品加载和洗脱。
1.样品加载：首先将待分离的样品溶液加入到凝胶柱中，样品中的各种分子根据其体积大小进入到凝胶孔道或沿凝胶颗粒表面通过。
体积较大的分子无法进入孔道，因此会快速通过凝胶柱，迁移速率较快。
体积较小的分子则能够进入孔道，受到凝胶孔道的阻碍，迁移速率较慢。
这样，样品中的不同分子就会在凝胶柱中根据其体积大小而分离。
2.洗脱：在样品加载后，需要通过洗脱来收集分离的目标分子。
洗脱过程中使用一种洗脱缓冲液，缓冲液的成分和pH值可以调整以满足对目标分子的选择性洗脱。
这样，在洗脱过程中，不同体积大小的分子将以不同的速率从凝胶柱中洗出，实现对目标分子的分离纯化。
需要注意的是，凝胶过滤层析技术不仅仅能够根据分子的大小分离，还可以用于蛋白质的分离，通过调整凝胶柱中的凝胶孔径和选择合适的缓冲液来实现蛋白质的选择性分离。
总结而言，凝胶过滤层析技术通过利用多孔凝胶柱的孔径分布特性，实现对分子根据其体积大小的分离。
通过加载样品并使用合适的洗脱缓冲液，不同体积大小的分子可以在凝胶柱中分离纯化。
这种技术简单易行，广泛应用于分子生物学、生物医学等领域的分离纯化研究中。
凝胶过滤层析技术原理讲解
凝胶过滤层析技术原理讲解凝胶过滤层析技术原理讲解(附动画)原创作者;gfzhang凝胶过滤层析(Gel Filtration Chromatography，GFC)又称尺寸排阻层析(Size Exclusion Chromatography，SEC)凝胶渗透层析(Gel Permeation Chromatography，GPC)分子筛层析(Molecular Sieve Chromatography，MSC)注:在高效液相色谱分析中，用GFC或SEC表示凝胶过滤色谱或尺寸排阻色谱，流动相通常是水溶液;在有机高分子分析中，常用GPC表示凝胶渗透色谱，流动相通常是有机溶剂;在蛋白质分离纯化中用GFC或SEC表示凝胶过滤层析或尺寸排阻层析;本文以下内容均针对蛋白质分离，因此均以凝胶过滤层析(GFC)表示。
(1)分离机理GFC填料是由高分子交联而成、内部具有网状筛孔的固体颗粒，利用球状凝胶内的筛孔的大小，不同水力学半径的分子在通过填料时运行路径存在差异，利用该差异将不同大小的蛋白质进行分离。
蛋白质分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，因此总体运行路径较短，从层析柱入口到出口所需时间较短;较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，总体运行路径较长，故在管柱内的停留时间较长;基于此原理可以区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而确定未知样品的分子量。
注1:球形蛋白与线性分子在凝胶过滤层析中的保留行为存在差异，因此使用球形蛋白制作的分子量标准曲线不能用于明胶多肽、淀粉或其它聚合物。
(2)应用范围A蛋白质分离，基于混合中不同蛋白质分子尺寸大小进行分离;B分子量测定，蛋白质分子量(球形)的对数与其在凝胶过滤层析时的保留时间呈线性关系; C样品脱盐或溶剂置换。
(3)填料要求一般状况下，用于制备凝胶过滤层析的填料应不吸附目标成份，所有欲分离物质均被洗脱出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。
《凝胶过滤层析》课件
高分子材料
随着高分子合成技术的进步，新型的高分子材料将应用于凝胶过滤层析中，以提高分离效率和分辨率。
纳米材料
纳米材料具有独特的物理和化学性质，将其应用于凝胶过滤层析中，有望实现更高效的分离和更精确的检测。
自动化和智能化发展
借助人工智能和机器学习技术，对凝胶过滤层析的数据进行深度分析，为实验结果提供更准确的解释和预测。
聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂聚合形成的网状高分子凝胶，具有良好的分子筛效应。
简介
应用
优点
缺点
常用于分离蛋白质、多肽等生物小分子，也可用于制备亲和层析介质。
分离效果好、分辨率高、操作简便。
可能产生毒性，对盐浓度和pH值敏感。
凝胶过滤层析的步骤
点击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅的阐述您的观点。
葡聚糖凝胶
简介 应用 优点 缺点 葡聚糖凝胶是一种由葡萄糖单元组成的线性高分子凝胶，具有良好的化学稳定性和生物相容性。 分离效果好、分辨率高、操作简便。 广泛用于分离蛋白质、酶、核酸等生物大分子，也可用于制备亲和层析介质。 成本较高，对盐浓度和pH值敏感。
琼脂糖凝胶
简介 应用 优点 缺点 琼脂糖凝胶是由琼脂糖形成的线性高分子凝胶，具有较好的机械强度和稳定性。 常用于分离DNA、RNA和蛋白质等生物大分子，也可用于制备微孔过滤介质。 机械强度高、稳定性好、成本较低。 对盐浓度和pH值敏感，可能产生拖尾现象。
凝胶过滤层析是一种基于分子大小分离蛋白质混合物的技术。
单击添加标题
点击此处添加正文，文字是您思想的提炼。
定义
它利用具有不同孔径的凝胶作为分离介质，根据蛋白质分子的大小和形状进行分离。
第五章-凝胶过滤层析PPT优秀课件
每一种特定的凝胶介质都有特定的分子量分级范围，分级范 围是凝胶介质的重要参数。 根据其分级范围，可以将溶质分子分为三类： 1.分子量大于分级范围上限的分子被称为全排阻分子，它们 完全被排阻在凝胶颗粒网孔外，从颗粒间隙中通过，所受阻 力最小，流程也最短，首先从层析柱中被洗脱下来；
凝胶过滤分离蛋白质 的过程
（1）蛋白质混合物上柱； （2）开始洗脱，小分子进入凝胶颗粒内，大分子被排阻在
颗粒外； （3）小分子被滞留而移动慢，大分子移动快，大小不同的
分子开始分开； （4）大小不同的分子完全分开； （5）大分子已被洗脱，而小分子仍在层析柱内。
6
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
3
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
一、凝胶过滤的概念
不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同, 凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层 析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.
4
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶色谱分离原理
5
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
9
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
三、凝胶过滤的有关理论问题 ㈠ 凝胶介质的多孔结构和凝胶柱的体积参数 凝胶过滤介质是由多聚物交联形成的具有三维网状结构的
颗粒。 凝胶柱的体积参数包括： 总柱床体积（total volume, Vt），是凝胶经溶胀、装柱、
沉降，体积稳定后所占据层析柱内的总体积； 外水体积（outer volume, V0），是柱中凝胶颗粒间隙的液
7
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
2.分子量低于分级范围下限的分子被称为全渗透分子，它们 完全进入凝胶颗粒网孔内部，洗脱时所受阻力最大，流程也 最长，最后从层析柱中被洗脱； 3.分子量在分级范围内的分子被称为部分渗透分子，它们依 据分子大小不同程度的进入凝胶颗粒内部的，是该凝胶介质 的有效分离对象。 如果两种物质分子量均大于凝胶介质分级范围的上限，或者 均小于分级范围下限，它们就无法通过层析而分离。
凝胶过滤层析
【实验目的】掌握凝胶过滤层析的原理及操作方法【实验原理】凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
1、器材：核酸蛋白检测仪、层析柱、水浴锅、真空泵2、试剂：SephadexG-25【实验步骤】（1）凝胶的选择：在经过膜分离后，分子量<5000。
本次实验选用G-25葡聚糖凝胶（分离范围1000-5000）。
（2）柱子的选择：分子量<5000，膜分离后玉米肽中不同的小肽分子量比较接近，属于分级分离，所以选用50*1.6规格的柱子。
（3）干凝胶用量的计算：柱子体积/膨胀度，G-25膨胀度是4~6。
（4）凝胶的预处理：将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。
可以用玻璃棒搅拌，但是不能剧烈，防止凝胶破裂。
多洗几次，尽量洗干净。
自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。
充分溶胀后，进行真空脱气。
（5）洗脱液的选择：本实验采用蒸馏水做洗脱液。
（6）凝胶的填充：将层析柱与地面垂直固定在架子上，然后将处理好的凝胶倒入柱子里，不能有气泡，要防止干柱。
（7）柱平衡：装柱完成后，用洗脱液来平衡柱子，直至核酸蛋白检测系统基线保持水平半个小时以上。
（8）上样：上样量在5%~10%。
（9）标准曲线的制作：本次实验用到还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、杆菌肽（氧化型谷胱甘肽（GSSG），M=612.63；还原型谷胱甘肽（GSH），M=307.33；杆菌肽M=1422.69）。
三种肽各称取0.03g 配成2ml，进行层析，在恒定流速下进行凝胶过滤层析。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
高级教育
12
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶过滤洗脱曲线示意图 （组分A为全排阻分子，组分B为部分渗透分子，组分C为全渗透分子）
高级教育
13
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
所示层析图谱中，样品由三种组分组成。
组分A为全排阻分子，分子量大于凝胶分级范围上限，不能进入
凝胶网孔，经凝胶颗粒间隙被洗脱，该组分的洗脱体积Ve等于外
外水体积（outer volume, V0），是柱中凝胶颗粒间隙的液 相体积的总和；
内水体积（inner volume, Vi），是存在于溶胀后的凝胶颗 粒网孔中的液相体积的总和；
凝胶体积（gel volume, Vg），又称支持物基质体积 （matrix volume of the support, Vs）或干胶体积，是凝胶 颗粒固相所占据的体积，
Ve = V0 + Kd·Vi Kd的值与被分离物质的分子量和分子形状、凝胶颗粒间
高级教育
8
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
在生物大分子的分离中，决定该分子在层析时的保留时间 长短即洗脱快慢的因素不仅仅是相对分子质量，分子形状 的影响也很大。有着相同分子量，但是形状不同的分子， 其保留时间不同。一般来说，分子量相同情况下，不对称 程度增加会使分子更容易被阻挡在凝胶颗粒的网孔之外， 导致保留时间变短。
高级教育
4
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶色谱分离原理
高级教育
5ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶过滤分离蛋白质 的过程
（1）蛋白质混合物上柱； （2）开始洗脱，小分子进入凝胶颗粒内，大分子被排阻在
颗粒外； （3）小分子被滞留而移动慢，大分子移动快，大小不同的
分子开始分开； （4）大小不同的分子完全分开； （5）大分子已被洗脱，而小分子仍在层析柱内。
宽，从几百到数百万，因此既适用于分子量较低的寡糖、寡
肽、聚核苷酸等生物小分子的分离，也适用于蛋白质、多糖、
核酸等大分子物质的纯化；
（4）设备相对简单、易于操作、分离周期短、连续分离时
层析介质不需再生即可反复使用。
高级教育
3
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
一、凝胶过滤的概念
不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同, 凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层 析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.
第五章 凝胶过滤层析
高级教育
1
第五章 凝胶过滤层析 第一节 概 述
凝胶过滤层析（gel filtration chromatography, GF或GFC） 是20世纪50年代前后发展起来的一种按分子大小进行分 离的纯化手段。
在众多分离计划中被广泛采用，不同的文献中采用了多种 不同的称谓:
凝胶层析（gel chromatography） 排阻层析（exclusion chromatography） 分子筛层析（molecular sieving chromatography） 立体排阻层析（steric exclusion chromatography） 体积排阻层析（size exclusion chromatography, SEC）
高级教育
2
第五章 凝胶过滤层析 第一节 概 述
凝胶过滤具有的优势 :
（1）凝胶介质不带电荷，具有良好的稳定性，分离条件温
和，回收率高，重现性好；
（2）通常情况下，溶液中存在各种离子、小分子、去污剂、
表面活性剂、蛋白变性剂等不会对分离产生影响，层析还能
在不同pH、温度下进行；
（3）应用范围广，能分离的物质相对分子质量的覆盖面
高级教育
10
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
根据凝胶床的组成，总柱床体积等于外水体积、内水体积 与凝胶体积之和：
Vt=V0+Vi+Vg
凝胶柱体积参数示意图
高级教育
11
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
㈡ 洗脱体积和分配系数
洗脱体积Ve定义为自样品加至层析柱上部开始，至洗脱 组分达到最大浓度（对映洗脱峰峰顶）时流经层析柱的洗 脱液的体积.
高级教育
9
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
三、凝胶过滤的有关理论问题
㈠ 凝胶介质的多孔结构和凝胶柱的体积参数
凝胶过滤介质是由多聚物交联形成的具有三维网状结构的 颗粒。
凝胶柱的体积参数包括：
总柱床体积（total volume, Vt），是凝胶经溶胀、装柱、 沉降，体积稳定后所占据层析柱内的总体积；
高级教育
6
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
二、生物分子的相对分子质量、分子大小和形状
每一种特定的凝胶介质都有特定的分子量分级范围，分级范 围是凝胶介质的重要参数。 根据其分级范围，可以将溶质分子分为三类： 1.分子量大于分级范围上限的分子被称为全排阻分子，它们 完全被排阻在凝胶颗粒网孔外，从颗粒间隙中通过，所受阻 力最小，流程也最短，首先从层析柱中被洗脱下来；
高级教育
7
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
2.分子量低于分级范围下限的分子被称为全渗透分子，它们 完全进入凝胶颗粒网孔内部，洗脱时所受阻力最大，流程也 最长，最后从层析柱中被洗脱； 3.分子量在分级范围内的分子被称为部分渗透分子，它们依 据分子大小不同程度的进入凝胶颗粒内部的，是该凝胶介质 的有效分离对象。 如果两种物质分子量均大于凝胶介质分级范围的上限，或者 均小于分级范围下限，它们就无法通过层析而分离。
度进入凝胶网孔之中，其洗脱体积Ve处于组分A与组分C之间
（V0<Ve<V0+Vi）。
高级教育
14
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶过滤层析是一种分配过程，凝胶颗粒内部吸附的溶剂 为固定相，流经层析柱的洗脱剂为流动相，样品的洗脱过 程就是溶质分子在两相中不断分配平衡的过程，而某种物 质的洗脱体积Ve的大小取决于该物质在流动相和固定相 之间的分配系数Kd，其关系式为：
水体积V0（Ve=V0）。
组分C为全渗透分子，分子量小于凝胶分级范围下限，完全渗透
进入凝胶网孔内，在正常洗脱条件下，与凝胶间不存在吸附作用
时，此类组分的洗脱体积是最大的，等于外水体积V0与内水体积
Vi之和（Ve=V0+Vi）。
组分B为部分渗透分子，分子量处于凝胶分级范围内，是此类凝
胶能有效分离的物质。根据组分B的分子量，该组分能以一定程