HPLC法检测功能红曲中的洛伐他汀
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收稿日期 :2000 - 01 - 08
2000 年 第 2 期 王春娜 : HPL C 法检测功能红曲中的洛伐他汀
49
红曲在我国的应用源远流长 ,在发酵食品 、食品色素 、中药等领域有着广泛的应用[1 ] . 近年来红曲霉的次级代谢物成为研究热点 ,日本学者远藤章根据李时珍“活血化瘀”的启示 , 从红曲中分离出优良的降血脂药物洛伐他汀 (Lovastatin) [2 ] . 洛伐他汀是 3 - 羟基 - 3 - 甲基 戊二酰辅酶 A ( HM G - CoA) 还原酶的抑制剂 ,HM G - CoA 还原酶是胆固醇生物合成的关键 酶 ,因此 ,洛伐他汀作为降血脂药物于 1987 年被批准上市后 ,很快得到了广泛应用[3 ] . 至今 , 功能红曲的开发研究方兴未艾. 一般红曲降血脂功效甚微 ,这是因为一般红曲中没有降血脂 的有效成分洛伐他汀. 对功能红曲中主要的降血脂成分洛伐他汀进行快速准确的测定 ,对优 化生产工艺 ,控制产品质量 ,具有极其重要的意义.
1979 , 32 (8) ,852～854 [ 3 ]肖国胜等. 洛伐他汀治疗高胆固醇血症的有效性和无害性. 新乡医学院学报 ,1998 ,15 (4) :26 [ 4 ]吴 禾等. 高效液相色谱法测定仙茅中仙茅苷的含量. 药物分析杂志 ,1999 ,12 (2) :105～107
50 北 京 农 学 院 学 报 第 15 卷
速 015ml/ min , 检测灵敏度 0101 AU FS ,柱温为室温 ,进样量 20μl. 标样和样品的色谱见图 2 和图 3.
图 3 样品的色谱图
213 供试品溶液及对照品溶液制备 供试品溶液 精密称取红曲样品 5g ,用 100ml 乙酸乙酯在索式提取器上回流提取 1h ,
237nm 处的吸收峰最明显 ,因此检测波长选择 237nm ,见图 1.
图 1 洛伐他汀的紫外光谱图 图 2 标样的色谱图
212 色谱分离条件及结果 Sp herisorb ODS 柱 (416mm ×150mm) ,粒径 5μm ,流动相为甲醇 :011 %磷酸 (75∶25) ,流
提取液蒸发至干 ,用 5ml 甲醇复溶 ,待分析用. 对照品溶液 精密称取洛伐他汀标样 10mg ,溶于 50ml 甲醇中 ,得到 200mg/ L 的标准
溶液. 214 标准曲线的绘制
把对照品溶液分别稀释至 100 、50 、25 、1215 、6125mg/ L1 分别取 20ug 进样 1 实验表明 Lovastatin 含量在 6125～100mg/ L 范围内 ,其进样量与色谱峰面积呈线性关系 ,得到直线回 归方程 y = 3 ×10 - 5x - 018541 ,相关系数 R = 019992 ,其中 x 为峰面积 ,y 为样品量. 215 重复性测定
进样 ,测定结果见表 2.
2000 年 第 2 期 王春娜 : HPL C 法检测功能红曲中的洛伐他汀
加入量 (μg) 3163 6125 12150 25100
检出量 (μg) 3162 6111 12179 25148
表 2 回收率试验
回收率 % 99172 97176 102132 101192
1 仪器及试剂
111 仪 器 L C - 3A 高效液相色谱仪 ( Shimadzu) , SPD - 1 紫外可见分光检测器 ,100μl 进样器.
112 试 剂 洛伐他汀对照品 ,华北制药厂. 甲醇 ,色谱纯 ;其他试剂均为分析纯. 功能红曲样品由浙
江工业大学提供.
2 方法与结果
211 检测波长的选择 紫外吸收光谱测定结果表明 , 洛伐他汀在 229 、237 、246nm 处 有 3 个 特 征 峰 , 由 于
平均回收率 % 100143
51
变异系数 % 1182
217 功能红曲的检测结果
表 3 功能红曲检测结果
功能红曲编号 ZH - 1 ZH - 2 ZH - 3
产量 (μg/ g) 57191 15168 24130
功能红曲编号 ZH - 4 ZH - 5 ZH - 6
产量 (μg/ g) 238121 9125 20108
从表中可见 ,不同功能红曲中洛伐他汀的含量差别较大 ,最高的含量为 238121 (μg/ g) . 同时对市售的用作色素的红曲米进行测定均未检测出洛伐他汀. 因为人体血液中含有洛伐 他汀在 1～5μg/ L 时会产生降低胆固醇功效 ,成年人血液量为 20L ,所需洛伐他汀的有效剂 量为 100μg ,服用 015g 功能红曲即可满足要求. 因此以富含洛伐他汀的功能红曲开发降血 脂保健食品是可行的.
参考文献
[ 1 ]傅金泉. 中国红曲及其实用技术. 北京 :中国轻工业出版社 ,1997 [ 2 ]A. Endo. Monacolin # K ,a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species. J . Antibiotics ,
HPL C 法检测功能红曲中的洛伐他汀
王春娜
(北京农学院基础科学系 ,北京 102206)
摘 要 采用高效液相色谱法 ( HPL C) ,选用 Spherisorb ODS 柱 ,以甲醇2011 %磷酸 (75∶ 25) 分离测定功能红曲中的洛伐他汀 ,检测波长 237nm. 该方法具有良好的线性关系和分 离度 ,重现性好 ,平均回收率为 100143 % ,RSD 为 1182 %. 本文对功能红曲样品进行测定 , 最高洛伐他汀含量为 238121μg/ g. 此法快速 、准确 ,可作为此类产品质量控制方法. 关键词 高效液相色谱 ( HPL C) ,功能红曲 ,洛伐他汀 中图分类号 :O65717 + 2 文献标识码 :A
第 15 卷 第 2 期 2000 年 4 月
北 京 农 学 院 学 报 J OU RNAL OF B EIJ IN G A GRICUL TU RAL COLL EGE
文章编号 :1002 - 3186 (2000) 02 - 0048 - 04
Vol. 15 No. 2 Ap r12000
Determination of Lovastatin in Functional Red Koji Using HPLC Method Wang Chunna
(Beijing Agricult ural College ,Beijing 102206)
Abstract The paper describes t he determination of Lovastatin in f unctional red koji by means of HPL C(high2performance liquid chromatogup hic) . Lovastatin is separated on t he Sp herisorb ODS column using met hanol2011 % p hosp horic acid (75∶25) as mobile p hase. Detection wave2 lengt h is 237 nm. The met hod demonst rates good linear relationship , separation drgree and re2 producibility . The average recovery rate of Lovastatin is 100143 % and RSD ( Relative Standard Deviation) is 1182 %. The experiment shows t hat t he highest content of Lovastatin in f unc2 tional red koji is 238121μg/ g. The approach has characteristics of quickness and accuracy , which can serve as t he quality cont rol met hod of t he similar product s. Key words High2performance liquid chromatograp hy , f unctional red koji , lovastatin
3 讨 论
1) 根据反复实验 ,红曲粉采用索氏提取器提取 1h 可将洛伐他汀提取完全. 2) 采用生物测定法测定一个样品 ,首先要将检测菌 (掷孢酵母) 预培养 ,然后将样品皂化 后 ,用纸片浸泡 ;纸片阴干后放在培养皿上 ,经过二天左右的时间培养后 ,测量抑菌圈的直 径 ,与标样的抑菌圈相比后计算效价. 这种方法耗时长 、误差因素多. 薄层层析法测定样品 时 ,从点样 、展层到扫描计算 ,所需时间至少两个半小时 ,而且精确度稍差. 而采用 HPL C 法 则具有快速 、准确的优点 ,可作为此类产品质量控制的方法[4 ] . 3) 结果表明本文所列流动相具有分离效果好 ,简便 、快速 、准确 、经济的优点. 4) 并非所有的红曲产品都含有洛伐他汀 ,且不同来源功能红曲的洛伐他汀产量差别较 大.
任取一样品 ,重复进样 5 次 ,结果如下表所示. 由表可知本实验具有良好的重现性 ,色谱 条件合理.
表 1 重复测定结果
测定结果 (mg/ L)
平均值
偏差
变异系源自文库 %
12123 12124 12126 12141 12136
12130
010718
015837
216 回收率测定 采用加样回收法 ,1ml 样品溶液中加入 1ml 不同标准浓度的洛伐他汀溶液 ,分别取 20μl
2000 年 第 2 期 王春娜 : HPL C 法检测功能红曲中的洛伐他汀
49
红曲在我国的应用源远流长 ,在发酵食品 、食品色素 、中药等领域有着广泛的应用[1 ] . 近年来红曲霉的次级代谢物成为研究热点 ,日本学者远藤章根据李时珍“活血化瘀”的启示 , 从红曲中分离出优良的降血脂药物洛伐他汀 (Lovastatin) [2 ] . 洛伐他汀是 3 - 羟基 - 3 - 甲基 戊二酰辅酶 A ( HM G - CoA) 还原酶的抑制剂 ,HM G - CoA 还原酶是胆固醇生物合成的关键 酶 ,因此 ,洛伐他汀作为降血脂药物于 1987 年被批准上市后 ,很快得到了广泛应用[3 ] . 至今 , 功能红曲的开发研究方兴未艾. 一般红曲降血脂功效甚微 ,这是因为一般红曲中没有降血脂 的有效成分洛伐他汀. 对功能红曲中主要的降血脂成分洛伐他汀进行快速准确的测定 ,对优 化生产工艺 ,控制产品质量 ,具有极其重要的意义.
1979 , 32 (8) ,852～854 [ 3 ]肖国胜等. 洛伐他汀治疗高胆固醇血症的有效性和无害性. 新乡医学院学报 ,1998 ,15 (4) :26 [ 4 ]吴 禾等. 高效液相色谱法测定仙茅中仙茅苷的含量. 药物分析杂志 ,1999 ,12 (2) :105～107
50 北 京 农 学 院 学 报 第 15 卷
速 015ml/ min , 检测灵敏度 0101 AU FS ,柱温为室温 ,进样量 20μl. 标样和样品的色谱见图 2 和图 3.
图 3 样品的色谱图
213 供试品溶液及对照品溶液制备 供试品溶液 精密称取红曲样品 5g ,用 100ml 乙酸乙酯在索式提取器上回流提取 1h ,
237nm 处的吸收峰最明显 ,因此检测波长选择 237nm ,见图 1.
图 1 洛伐他汀的紫外光谱图 图 2 标样的色谱图
212 色谱分离条件及结果 Sp herisorb ODS 柱 (416mm ×150mm) ,粒径 5μm ,流动相为甲醇 :011 %磷酸 (75∶25) ,流
提取液蒸发至干 ,用 5ml 甲醇复溶 ,待分析用. 对照品溶液 精密称取洛伐他汀标样 10mg ,溶于 50ml 甲醇中 ,得到 200mg/ L 的标准
溶液. 214 标准曲线的绘制
把对照品溶液分别稀释至 100 、50 、25 、1215 、6125mg/ L1 分别取 20ug 进样 1 实验表明 Lovastatin 含量在 6125～100mg/ L 范围内 ,其进样量与色谱峰面积呈线性关系 ,得到直线回 归方程 y = 3 ×10 - 5x - 018541 ,相关系数 R = 019992 ,其中 x 为峰面积 ,y 为样品量. 215 重复性测定
进样 ,测定结果见表 2.
2000 年 第 2 期 王春娜 : HPL C 法检测功能红曲中的洛伐他汀
加入量 (μg) 3163 6125 12150 25100
检出量 (μg) 3162 6111 12179 25148
表 2 回收率试验
回收率 % 99172 97176 102132 101192
1 仪器及试剂
111 仪 器 L C - 3A 高效液相色谱仪 ( Shimadzu) , SPD - 1 紫外可见分光检测器 ,100μl 进样器.
112 试 剂 洛伐他汀对照品 ,华北制药厂. 甲醇 ,色谱纯 ;其他试剂均为分析纯. 功能红曲样品由浙
江工业大学提供.
2 方法与结果
211 检测波长的选择 紫外吸收光谱测定结果表明 , 洛伐他汀在 229 、237 、246nm 处 有 3 个 特 征 峰 , 由 于
平均回收率 % 100143
51
变异系数 % 1182
217 功能红曲的检测结果
表 3 功能红曲检测结果
功能红曲编号 ZH - 1 ZH - 2 ZH - 3
产量 (μg/ g) 57191 15168 24130
功能红曲编号 ZH - 4 ZH - 5 ZH - 6
产量 (μg/ g) 238121 9125 20108
从表中可见 ,不同功能红曲中洛伐他汀的含量差别较大 ,最高的含量为 238121 (μg/ g) . 同时对市售的用作色素的红曲米进行测定均未检测出洛伐他汀. 因为人体血液中含有洛伐 他汀在 1～5μg/ L 时会产生降低胆固醇功效 ,成年人血液量为 20L ,所需洛伐他汀的有效剂 量为 100μg ,服用 015g 功能红曲即可满足要求. 因此以富含洛伐他汀的功能红曲开发降血 脂保健食品是可行的.
参考文献
[ 1 ]傅金泉. 中国红曲及其实用技术. 北京 :中国轻工业出版社 ,1997 [ 2 ]A. Endo. Monacolin # K ,a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species. J . Antibiotics ,
HPL C 法检测功能红曲中的洛伐他汀
王春娜
(北京农学院基础科学系 ,北京 102206)
摘 要 采用高效液相色谱法 ( HPL C) ,选用 Spherisorb ODS 柱 ,以甲醇2011 %磷酸 (75∶ 25) 分离测定功能红曲中的洛伐他汀 ,检测波长 237nm. 该方法具有良好的线性关系和分 离度 ,重现性好 ,平均回收率为 100143 % ,RSD 为 1182 %. 本文对功能红曲样品进行测定 , 最高洛伐他汀含量为 238121μg/ g. 此法快速 、准确 ,可作为此类产品质量控制方法. 关键词 高效液相色谱 ( HPL C) ,功能红曲 ,洛伐他汀 中图分类号 :O65717 + 2 文献标识码 :A
第 15 卷 第 2 期 2000 年 4 月
北 京 农 学 院 学 报 J OU RNAL OF B EIJ IN G A GRICUL TU RAL COLL EGE
文章编号 :1002 - 3186 (2000) 02 - 0048 - 04
Vol. 15 No. 2 Ap r12000
Determination of Lovastatin in Functional Red Koji Using HPLC Method Wang Chunna
(Beijing Agricult ural College ,Beijing 102206)
Abstract The paper describes t he determination of Lovastatin in f unctional red koji by means of HPL C(high2performance liquid chromatogup hic) . Lovastatin is separated on t he Sp herisorb ODS column using met hanol2011 % p hosp horic acid (75∶25) as mobile p hase. Detection wave2 lengt h is 237 nm. The met hod demonst rates good linear relationship , separation drgree and re2 producibility . The average recovery rate of Lovastatin is 100143 % and RSD ( Relative Standard Deviation) is 1182 %. The experiment shows t hat t he highest content of Lovastatin in f unc2 tional red koji is 238121μg/ g. The approach has characteristics of quickness and accuracy , which can serve as t he quality cont rol met hod of t he similar product s. Key words High2performance liquid chromatograp hy , f unctional red koji , lovastatin
3 讨 论
1) 根据反复实验 ,红曲粉采用索氏提取器提取 1h 可将洛伐他汀提取完全. 2) 采用生物测定法测定一个样品 ,首先要将检测菌 (掷孢酵母) 预培养 ,然后将样品皂化 后 ,用纸片浸泡 ;纸片阴干后放在培养皿上 ,经过二天左右的时间培养后 ,测量抑菌圈的直 径 ,与标样的抑菌圈相比后计算效价. 这种方法耗时长 、误差因素多. 薄层层析法测定样品 时 ,从点样 、展层到扫描计算 ,所需时间至少两个半小时 ,而且精确度稍差. 而采用 HPL C 法 则具有快速 、准确的优点 ,可作为此类产品质量控制的方法[4 ] . 3) 结果表明本文所列流动相具有分离效果好 ,简便 、快速 、准确 、经济的优点. 4) 并非所有的红曲产品都含有洛伐他汀 ,且不同来源功能红曲的洛伐他汀产量差别较 大.
任取一样品 ,重复进样 5 次 ,结果如下表所示. 由表可知本实验具有良好的重现性 ,色谱 条件合理.
表 1 重复测定结果
测定结果 (mg/ L)
平均值
偏差
变异系源自文库 %
12123 12124 12126 12141 12136
12130
010718
015837
216 回收率测定 采用加样回收法 ,1ml 样品溶液中加入 1ml 不同标准浓度的洛伐他汀溶液 ,分别取 20μl