浅析乳制品中高危害食源性致病菌--阪崎肠杆菌的快速检
食源性致病微生物阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒的研究
正值炎炎夏季，湿热的空气为细菌、真菌等微生物的生长繁殖提供了必备的温度和湿度，因此更容易引起食物中毒等食源性疾病的发生。
由于传统的食源性微生物检测技术繁琐耗时，故致病微生物的创新检测技术引起了越来越多科研人员的关注。
只有深入分析食源性微生物检测技术，才能帮助相关人员更好地掌握有关的知识和应用要点，从而更有效地发挥关键技术的作用，进一步保证食品的质量与安全。
为此，本刊特设“食源性微生物及其检测技术”专题，对常见的食源性致病菌进行了详细解读，并深入探讨了食源性微生物检测方法的应用与发展，以期为食品安全提供有力保障，促进我国食品工业的健康发展。
需要警惕的“头号敌人”——食源性微生物食源性微生物及其检测技术Aug 2019 CHINA FOOD SAFETY21食品安全问题一直是社会各界关注的重点。
世界卫生组织曾报道称，食源性疾病是受全球关注的卫生问题，更是影响人类健康的重要因素，而病原微生物感染则是导致食源性疾病发生的主要因素。
阪崎肠杆菌在2002年被国际食品微生物标准化委员会（ICMSF）确定为食源性致病菌，如被阪崎肠杆菌感染可能会引起婴幼儿尤其是新生儿患病，如脑膜炎、菌血症及坏死性小肠结肠炎等，更有甚者会引起严重的后遗症或死亡。
有数据显示，目前只有婴幼儿奶粉与这一疾病的爆发相关。
传统的致病微生物检测方法有国标法和纸片法，但因操作复杂且测试周期过长，其已经无法跟上经济发展的步伐，不能满足我国快速发展的食品行业对食品检测工作的需求。
因此，建立一种在婴幼儿奶粉中快速、高效、灵敏的检测阪崎肠杆菌的方法至关重要。
本研究是一种基于环介导等温扩增技术而开发的快速检测食品中阪崎肠杆菌的方法。
环介导等温基因扩增技术（Loop Mediated Isothermal Amplification，以下简称“LAMP 法”）是日本荣研株式会社研究发明的核酸等温扩增方法，其利用4个特殊的引物特异识别靶基因的6个特定区域，采用具有强链置换活性的BstDNA 聚合酶，实现在恒温条件下的体外扩增。
浅论阪崎肠杆菌的危害及其检测方法
长春
１０６； ０２ ３
长春
１ ０ ６） ０２ ３
１ ７－ ６ ２ ２ ０ ） ５ ０ ２ － ３ ６ ２ ９ ９ （０ ６ ０ － ０ ９ ０
文章编号
阪 崎 肠 杆 菌 属 于 肠 杆 菌 科 ， 它 对 所 有 年 龄 由 于 该 菌 对 所 有 年 龄 段 的人 都 有 感 染 性 ， 所 以
维普资讯
浅论阪 崎肠杆菌 的危 害及其 楦测方法 李兆辉 ’ ，柳增善 ’ Nhomakorabea张大伟
（ 吉林 大学农 学部人 畜共 患病研 究所 ，吉林 １ ． ２ 吉林 大学农 学部化 学教研 室 ，吉林 ．
中图分类号 Ｓ ５ ． １２ ８２６＋ 文献标识码 Ａ
表１食品及相关设备和环境中的阪崎肠杆菌
食品及相关的设备 环境
中的 阪崎肠 杆 菌 能 引起新 生儿 的脑 膜 炎 、败 血
症 、 坏 死 性 小 肠 结 膜 炎 等 疾 病 ， 由 于 我 们 对 阪
大酒 儿 粉 豆 竺杯婴鼍塑 ， 粉 孝兰 热矿 水 的泉 篡 翟 原 油 老 鼠 兰 设（ 匙 ： 地 品类童乳 备 、瓶浣 谷 品 挽 、 食加 （ ＊
段 的人都 易感 。本 文 就 阪 崎肠 杆菌 的来源 、传 引起 了医 生 、生产 商 和 消 费者 的广泛 关注 。阪 播 途 径 及 其 危 害 、 最 新 的 检 测 方 法 作 以 综 述 。 崎 肠 杆 菌 作 为 一 个 普 通 的 细 菌 ， 被 广 泛 地 发 现
并根据我 国的实 际情 况提 出了预 防措施 。
１ 背 景
于 家 庭 和 医 院 的 食 品 、 水 和 环 境 中 （ 表 １， 见 ） 而 且 从 制 造 婴 儿 食 品 工 厂 的 环 境 中 也 发 现 了该
阪崎肠杆菌检验
➢ 内在污染 ——二次污染。
如：加工环境中微生物的存在；加工装置内表面 微生物的存在；热处理后，与干燥基粉混合的加入成分 中存在的微生物。
➢ 外源性污染——配方粉调制环境和调制器皿。 受ES污染的配方粉或调制配方在较高温度下存
放，食用前不加热，或加热不彻底，喂食时间较长 等都可导致ES有机会生长繁殖，增加患病的危险性。
2. ES都可以在该平板上生长并产生蓝绿色菌落 3. 其他常见菌在DFI平板的菌落颜色
a. 白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌 、泛菌属的多种菌等
b. 黄色菌落：赫氏埃希氏菌 c. 黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种
• ESIA:蓝色，1-3mm
• 国产显色培养基
2244
第二十四页，共三十五页。
20
E.agglomerans (24.8)
（14.2%） E.cloacae (21.3)
E.sakazakii (14.2)
Iversen和Forsythe 2004
82 （ 25g ）
7 （8.5%）
2
Pantoea spp（2.4)
（2.4%） E.cloacae (1.2)
E.sakazakii (2.4)
1188
第十八页，共三十五页。
第一法 阪崎肠杆菌的检验
1199
第十九页，共三十五页。
阪崎肠杆菌检验程序
检样 100 g/mL+稀释液 900 mL
36℃±1℃，18 h±2h
前增菌
1mL + mLST-Vm 10mL 44℃±0.5℃，24 h±2h
选择性增菌
DFI琼脂 36℃±1℃，24 h±2h
增加30倍；25℃放置10h可增加30 000倍。 • 2004年2月FAO/WHO在日内瓦召开的PIF中ES专家研讨会上
改良环介导等温扩增技术快速检测婴儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌_胡连霞
(河北农业大学食品科技学院 , 保定 071001)
摘要 :【目的】采用改良环介导等温扩增(LAMP)技术 , 快速检测婴儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌 。【方法】以阪 崎肠杆菌(ATCC29544)的 16S-23S rRNA 间区序列作为靶序列 , 设计内 、外引物和环引物 , 通过肉眼观察白色 沉淀 , 判断检测结果 。【结果】LAMP 检测阪崎肠杆菌的灵敏度为 0.101 CFU mL , 人工污染阪崎肠杆菌的婴儿 配方奶粉的检出限为 1.1 CFU g 。采用试剂盒提取 DNA , 从样品处理到报告结果 , 耗时 1 h 。而对照 , PCR 检 测阪崎肠杆菌的灵敏度为 101 CFU mL , 人工污染阪崎肠杆菌的婴儿配方奶粉的检出限为 1100 CFU g 。 采用 同样方法提取 DNA , 从样品处理到报告结果 , 耗时 3 h 。【结论】因此 , LAMP 检测婴儿配方奶粉中的阪崎肠杆 菌灵敏度高 , 耗时短 , 方法简便 。 关键词 :环介导等温扩增 ;LAMP ;检测 ;阪崎肠杆菌 ;婴儿配方奶粉 中图分类号 :Q93-3 文献标识码 :A 文章编号 :0001-6209 (2009)03-0378-05
对阪崎肠杆菌的检测方法主要有 FDA 推荐的传统 检测方法 , 免疫学方法和各种 PCR 方法 。传统检测 方法操作繁琐 , 检测时间长 , 而且灵敏度较低 ;免疫 学方法的特异性和灵敏度也不理想 ;PCR 方法敏感 、 快速[ 4] , 但由于需要昂贵的仪器设备 、繁琐的电泳过 程以及对检测人员较高的技术要求 , 而使其难以在 基层普及和推广 。
Biometra 公 司 ), 恒 温 培 养 箱 , 凝 胶 成 像 系 统 1.10 ×10-1 CFU mL 。同时从每稀释度奶粉溶液中取
PCR快速检测奶粉中阪崎肠杆菌研究
PCR快速检测奶粉中阪崎肠杆菌研究叶应旺;吴清平;郭伟鹏;张菊梅【期刊名称】《中国卫生检验杂志》【年(卷),期】2007(17)3【摘要】目的：针对当前国内外传统检测方法都存在时间长、检测结果假阳性突出等问题，建立阪崎肠杆菌快速检测法。
方法：根据阪崎肠杆菌中寡-1，6-葡萄糖苷酶基因设计引物建立PCR方法，并进行PCR反应的灵敏度、特异性实验以及模拟实际样品的最低检出限测定。
结果：纯菌检测灵敏度达10^2 cfu／ml，阪崎肠杆菌菌株PCR扩增均为阳性，阴性对照菌株未扩增出特异性条带；单独接种阪崎肠杆菌（3．5—4．5 cfu／100g）和混合接种大肠杆菌或沙门菌的人工模拟污染奶粉样品中分别在增菌26h和28h时，阪崎肠杆菌均可以检出。
结论：该方法灵敏度高、快速、特异性强，可以很好地应用于奶粉以及其他食品中阪崎肠杆菌的检测与鉴定。
【总页数】4页(P422-424)【关键词】阪崎肠杆菌(Enterobacter;sakazakii);寡-1;6-葡萄糖苷酶基因;奶粉【作者】叶应旺;吴清平;郭伟鹏;张菊梅【作者单位】中国科学院南海海洋研究所;广东省微生物研究所广东省菌种保藏与应用重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R446.5【相关文献】1.婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌双重荧光PCR快速检测方法的建立 [J], 黄建飞;刘小青;刘斌;陈泽峰;兰全学;陈晶2.奶粉中阪崎肠杆菌PCR和荧光PCR 检测方法的研究 [J], 高虹;张霞;高旗利3.种特异性PCR快速检测奶粉中阪崎肠杆菌研究 [J], 叶应旺;吴清平;郭伟鹏;张菊梅;董晓晖4.PCR快速检测奶粉中的阪崎肠杆菌 [J], 冯锋将5.婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌增菌培养对PCR快速检测的影响 [J], 张清平;张懿翔;刘洋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
奶粉中的健康杀手——克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测标准解读
奶粉中的健康杀手——克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检测标准解读！克罗诺杆菌属（Cronobacterspp.）是由Iversen等人于2008年建议创立的隶属于肠杆菌科的一个新属，该属是寄生在人和动物肠道内的一种有周生鞭毛、能运动、兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
该菌的发展经历了4个时期：１起初该菌因其产生黄色素，被认为是肠杆菌属中阴沟肠杆菌的生物变形种──黄色阴沟肠杆菌；２1989年，Farmer通过DNA杂交、生化反应、黄色素产生及抗生素敏感性等实验，发现该菌与阴沟肠杆菌有所不同，为此更名为“阪崎肠杆菌”；３2008年，Iversen等人通过荧光扩增片段长度多态性、自动核糖体分型、16SrRNA基因测序、DNA-DNA杂交和表型阵列等多种分子生物学技术研究，将该菌由种（阪崎肠杆菌）扩大为属（克罗诺杆菌属），这个新属包括6个种；４2012年，Joseph等利用16SrRNA基因序列分析和多位点测序技术对克罗诺杆菌属进行分类研究，提出将克罗诺杆菌属分为7个种。
克罗诺杆菌属是一种重要的食源性条件致病菌，可通过污染婴幼儿配方奶粉等食品导致新生儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎。
其名字“克罗诺”（Cronos）来源于希腊神话，克罗诺是希腊神话中十二个泰坦巨神之一，传说他的每个孩子一出生就被他一口吃掉，其行为表现和该菌的致病特性很吻合，因此“Cronobacterspp.”被译成“克罗诺杆菌属”。
该菌作为引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌，对其相关产品的检测及监管尤为重要，常用的检测方法有：另外，2016年12月23日卫计委发布了新标准GB 4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验》，将于2017年6月23日实施，并将代替GB 4789.40-2010、SN/T 1632.1-2013。
该标准与GB 4789.40-2010相比，主要变化有：1.修改了标准名称标准名称中“阪崎肠杆菌检验”改为“克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验”。
阪崎肠杆菌的测定PPT
03
样品处理与准备
样品采集与保存
采样工具
使用无菌采样工具，避免交叉污染。
采样部位
保存条件
将采集的样品立即放入无菌容器中，密 封并标识清楚，置于低温条件下保存， 以确保样品的新鲜度和避免细菌增殖。
根据检测需求，选择合适的采样部位， 如食品表面、内部或液体样品等。
样品前处理
样品均质化
对于固体或半固体样品， 需进行均质化处理，以便 后续检测。
公共卫生监测
建立阪崎肠杆菌的监测网络，及时发现和控 制食品、水源等环境中的污染问题，保障公 众健康。
08
总结与展望
研究成果总结
检测方法优化
通过改进培养基配方、提高检测灵敏度等方式，成功 建立了高效、准确的阪崎肠杆菌检测方法。
污染源追溯
利用分子生物学技术，对阪崎肠杆菌进行基因分型， 实现了对污染源头的快速识别和追溯。
保存期限
注意样品的保存期限，过期样品可 能会影响检测结果的准确性。
04
实验步骤与操作
培养基配制与灭菌
培养基选择
针对阪崎肠杆菌的生长特性，选择适当的培养基， 如阪崎肠杆菌选择性培养基。
培养基配制
按照培养基说明书或实验室标准操作程序（SOP） 进行配制，确保各成分比例准确。
灭菌处理
将配制好的培养基进行高压蒸汽灭菌，确保无菌 状态，避免实验过程中的污染。
考核与评估
定期对实验人员进行考核和评估，包括实验操作技能考核、理论知识测试等，确保实验人员能够熟练掌 握实验技能和知识。同时，对考核结果进行分析和总结，针对存在的问题进行改进和完善。
07
应用实例与案例分析
食品中阪崎肠杆菌的测定
食品样品采集与处理
从食品生产、加工、运输和储存等各环节采集样品，进行适当处 理以消除干扰因素。
阪崎肠杆菌
目前，微生 物学家尚不 清楚阪崎肠 杆菌的污染 来源，但许 多病例报告 表明婴儿配 方粉是目前 发现的主要 感染渠道。
阪崎肠 杆菌是 乳制品 中近几 年新发 现的一 种致病 菌。
阪崎肠杆菌
阪崎肠杆菌在自然界分布广泛，繁殖迅速，但不耐热， 可通过巴斯德消毒法杀灭。阪崎肠杆菌属条件致病菌， 在一般情况下，不对人体健康产生危害，但对于免疫 力低下者和婴幼儿、新生儿，尤其是早产儿、低体重 儿可以致病。感染来源主要是受阪崎肠杆菌污染的奶 粉，人与人之间无传染性。
培养基和试剂
1、缓冲蛋白胨水BPW（略） 2、改良月桂基硫酸盐以蛋白胨肉汤-万古霉素 （mlST-Vm）
• 成分和配置方法详见GB/T 4789.40-2010 附录A2。
加入万古霉素的目的是抑制革兰氏阳性菌等杂 菌的生长。
注意：新鲜配置的mLST-Vm应该在24h内使用， 万古霉素溶液可在在0 ℃～5 ℃保存15 天。
注意：要避光4℃保存。
阪崎肠杆菌显色培养基DFI
微生物
菌落颜色
• 阪崎肠杆菌 • 大肠杆菌 • 金黄色葡萄球菌
蓝绿色 无色菌落 被抑制不生长
培养基和试剂
• 4 、胰蛋白胨大豆琼脂（trypticase soy agar， TSA）：见附录A 中A.3。
• 5 、生化鉴定试剂盒。 • 6、 氧化酶试剂：见附录A 中A.4。 • 7、 L-赖氨酸脱羧酶培养基：见附录A 中A.5。 • 8 、L-鸟氨酸脱羧酶培养基：见附录A 中A.6。 • 9 、L-精氨酸双水解酶培养基：见附录A 中A.7。 • 10、 糖类发酵培养基：见附录A 中A.8。 • 11 、西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录A 中A.9。
阪崎肠杆菌的生理生化特征 报》 2006年06期 《阪 崎肠杆菌的生物学特性及 其检测技术》
食源性阪崎肠杆菌检测方法研究进展
食源性阪崎肠杆菌检测方法研究进展作者：邓丽萍邓访萍张琴来源：《食品安全导刊·下》2023年第11期摘要：阪崎肠杆菌可感染婴幼儿，引发脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎。
因此，探究出快速、灵敏、高效的阪崎肠杆菌检测方法对于保障食品质量安全至关重要。
目前，阪崎肠杆菌的检测方法中比较常见的是分离鉴定法、分子生物学检测技术和免疫学检测法。
分离鉴定法易于操作、成本低，但检测周期长，无法满足对目标食品快速检测的需求；分子生物学检测技术是一种高灵敏度和特异性的检测手段，但是由于其对检测人员要求高，所需设备和试剂价格昂贵，目前多在实验室进行，不适用于现场检测；免疫学检测方法简单快捷，适用于现场快速检验，但容易受到其他杂菌的影响，敏感性较低。
本文综述了分离鉴定法、分子生物学检测技术、免疫学检测技术等多种阪崎肠杆菌的检测方法，结合参考文献就检测研究进展予以分析，以期为食品中阪崎肠杆菌的快速检测方法研究提供参考。
关键词：阪崎肠杆菌；检测方法；研究进展Research Progress in Detection Methods for Foodborne Enterobacter sakazakiiDENG Liping1，2，3， DENG Fangping4， ZHANG Qin1，2，3（1.Guangdong Food Quality Supervision and Inspection Station， Guangzhou 511442， China;2.Guangdong Food Industry Institute Limited Company， Guangzhou 511442， China;3.Guangdong Provincial Food Industry Public Laboratory， Guangzhou 511442， China;4.The First Hospital of Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510080， China）Abstract： Trace amounts of E. sakazakii can infect newborns and young children， causing meningitis， septicaemia and necrotising small bowel colitis， among others. Therefore， exploring a rapid， sensitive and efficient detection method for E. sakazakii is essential for ensuring food quality and safety. At present， conventional isolation and identification， molecular biology and immunological detection methods for E. sakazakii are more common. The separation and identification method is easy to operate and low cost， but the detection cycle is long， which can not meet the demand for rapid detection of target food. Molecular biotechnology is a highly sensitive and specific means of detection， but due to its high demand for test technicians， the required equipment and reagents are expensive， and is currently mostly carried out in the laboratory， is not suitable for on-site testing. The method of immunological determination is simple and fast， which is suitable for field rapid detection， but it is easy to be interfered with other miscellaneous bacteria and itssensitivity is not high enough. In this paper， separation and identification method， molecular biological detection techniques， immunological detection techniques and other detection methods of E. sakazakii were reviewed， and the research progress of detection was analyzed in combination with references， in order to provide reference for the rapid detection of E. sakazakii in food.Keywords： Enterobacter sakazakii; detection method; research progress阪崎腸杆菌（又称阪崎氏肠杆菌）是一种寄生于人和动物肠道内的条件致病菌，在自然界中分布广泛，具有一定的耐热性、耐干燥性、耐高渗环境性，可抵抗超高温瞬时灭菌。
牛奶中阪崎肠杆菌的检测方法
牛奶中阪崎肠杆菌的检测方法引言：阪崎肠杆菌（又称阪崎氏肠杆菌）是一种周身无鞭毛，能运动，无芽孢的兼性厌氧菌，革兰氏阴性杆菌。
1980年由黄色阴沟肠杆菌更名为阪崎肠杆菌。
阪崎肠杆菌能引起严峻的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，致死率可达40％～80%，自1961年首次由阪崎肠杆菌引起的新生儿脑膜炎之后，全球范围间续消失感染大事，丹麦、希腊、英国、荷兰、冰岛等国均有报道。
其严峻性已引起世界多国相关部门的重视，阪崎肠杆菌已被世界卫生组织和很多国家确定为引起婴儿死亡的重要条件致病菌。
我国也于2021年5月20日通过了《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》行业标准，并于同年10月实施，我国《婴儿配方食品》和《幼儿配方食品》相关标准规定婴幼儿配方奶粉、食品中禁止检出阪崎肠杆菌等致病菌。
一、阪崎杆菌的生物学特性1 形态染色阪崎肠杆菌属肠杆菌科肠杆菌属, 因此本菌具备肠杆菌基本形态特征: 革兰阴性粗短杆菌，有周身菌毛, 无芽胞, 有动力[1] 。
2 培育特性能在一般养分琼脂、血平板、麦康凯(MAC) 琼脂、伊红美兰(EMB) 琼脂、脱氧胆酸琼脂等多种培育基上生长繁殖。
培育最佳温度25 ～36 ℃ , 在6～45 ℃下都能生长, 某些菌株可在47 ℃下生长[8] 。
在胰蛋白胨琼脂(TSA) 、脑心浸液琼脂(BH I) 及血平板上经25 ～36 ℃培育24 h 后, 形成1. 5 ～2. 5mm, 黄色菌落。
在结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBG) 能产生紫红色菌落[2]。
二、阪崎杆菌的传统检测方法阪崎肠杆菌检验程序见图1。
1 基本步骤如下：取检样100g（mL）加入已预热至44℃装有900mL缓冲蛋白胨水的锥形瓶中，用手缓缓地摇动至充分溶解，36℃1℃培育18 h2h。
移取1mL 转种于10mL mLST-Vm肉汤，44℃0.5 ℃培育24 h2h。
轻轻混匀mLST-Vm 肉汤培育物，各取增菌培育物1环，分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色培育基平板，36℃1℃培育18 h2 h。
阪崎肠杆菌测试片快速准确保障乳品安全
阪崎肠杆菌测试片快速准确保障乳品安全
孙霞;卢新
【期刊名称】《食品安全导刊》
【年(卷),期】2009(000)004
【摘要】阪崎肠杆菌是乳制品中新发现的一种病原菌．已被世界卫生组织和许多国家确定为引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌。
从2005年开始我国陆续出台了阪崎肠杆菌检测的行业标准和国家标准。
虽然标准规定的检测方法准确性和灵敏度较高，但存在操作繁琐、时间长等缺陷，为了寻求更简便、快速的检测方法．本公司将选择性显色培养基结合吸水凝胶和各种载体做成一次性的测试片．
【总页数】2页(P45-46)
【作者】孙霞;卢新
【作者单位】广州绿洲生化科技有限公司;广州绿洲生化科技有限公司
【正文语种】中文
【相关文献】
1.Easy TestTM测试片: 准确性更高、适用性更广——微生物快速检测新产品 [J], 王芳;王凯;樊赟;刘沛;王磊
2.测试片法:实现乳品阪崎肠杆菌的快速检测 [J], 孙霞;卢新
3.提高斐林氏快速法测还原糖的准确性 [J], 黄水泉
4.一种快速,宽带,准确的测相方案 [J], 顾慰君
5.快速、准确的硬度测试手段——试片测定法 [J], 周伟良;瞿晓燕
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婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的检测
明进行识别。本次检测中使用的培养基的典型阪崎肠杆菌为蓝-绿色菌落,其它菌
为无色、乳白色或黄色菌落。
培养后挑取至少5个可疑菌落,不足5个时挑取全部可疑菌落, 划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂TSA 平板，25℃±1℃培养 48h±4h。
7
分 析 结 果
鉴定
取出培养完成的胰蛋白胨大豆琼脂TSA 平板，直接挑取黄色可疑菌落,进行生 化鉴定。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。 用接种管将可疑菌落分别加入生化孔内，每个生化孔内载有风干的底物。在 35~37°C培养18~24小时，参考说明表判读其结果。
乳制品生产与控制
8
乳制品生产与控制
1
国家标准 设备和材料 分析步骤 分析结果
3
GB 4789.40-2016 食品安全国家标
Байду номын сангаас
准 食品微生物学检验
国 家 标
克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验
准
4
实 验 设 备 和 材 料
设备和材料
恒温培养箱、冰箱（2℃~5℃）、恒温水浴箱、天平（感量0.1g）、均质器、 振荡器、吸管（1mL、10mL或微量移液器及吸头）、锥形瓶（容量100mL、
200mL、2000mL）、培养皿（直径90mm）、pH计或pH比色管或精密pH试
纸、全自动微生物生化鉴定系统
培养基的制备-样品的稀释和培养
分
析
步 骤
培养基的制备
缓冲蛋白胨水(BPW)、改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（mLST-Vm)、阪崎
肠杆菌显色培养基（DFI琼脂）、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、生化鉴定试剂盒
样品稀释与培养 无菌称取样品100g、10g、1g各三份,分别加入900mL、90mL、9mL已预热至44℃的 缓冲蛋白胨水,轻轻振摇使充分溶解,制成1∶10样品匀液,置36℃±1℃培养18h±2h。 培养完成后分别移取1mL转种于10mL加入了万古霉素的改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉 汤中， 44℃±0.5℃培养24h±2h。
奶粉中阪崎肠杆菌在检测及控制方面的研究进展
较 高的致 死 率 ，对 早 产 婴儿和 免 疫低 下 的婴 幼 儿 具 有极大 的威胁 ，近 年来 引起 了人们 的高度 关注 。 研 究者对 Ｅ ａ ａａ ｉ ．ｓｋｚ ｋｉ的研 究涵 盖 了 Ｅ ａ ａａ ｉ ｓ ｋｚ ｋｉ
Ｃｏｌ ｇｅｏｆＦｏ ｃ ｅ ｅ ｏｕ ｈ ｅ ｔＵｎｉ ｒ ｉｙ ｌ ｅ ｏｄ Ｓ ｉｎｃ ，Ｓ ｔ ｗ ｓ ｖｅ ｓｔ，Ｃｈｏ ｑｉ ０７１ ，Ｃｈｎａ ｎｇ ｎｇ４０ ５ ｉ
ＡｂｔａｔＥ ｔ ｏ ａｔｒ ａａａ ｉｉａｃｓ— ｔｌ ａｔ ｉｍ ｏ， ｉ ｎｃｕｅ ｒ ｖｒｉｌ ｆ ａ ｉ ｕｙｔ ｆｎｓＴ ｉｐｐ ｒ ｓ ｃ： ｎｅ ｂ ｃ ｋｚ ｋ ａｅｆ ａｂ ｃｅ ｕ ｉ ｆ ｄ ｗｈ ｈｃ ｓ ｒ ｅｓ ｅ ａ ｌｎ ｒ ｉ ａｔ． ｈｓ ａｅ ｒ ｒ ｅｓ ｉｓ ａ ｒ ｎｏ ｃ ａ ａ ｉｅ ｂ ｔ ｊ ｏｎ
微 生 物 ， 将 其 列 为 与 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 （ｉ ｅｉ ｏ ｏｙｏ ｅ ｅ） 肉毒 梭 菌 （ ｌｓ ｉｉｍ Ｌｓ ｒ ｍ ｎ ｃｔｇ ｎ ｓ 、 ｔ ａ Ｃｏ ｔｄｕ ｒ ｂ ｔｌ ｕ ） Ａ型 毒素和 Ｂ型 毒素 、 ｏｕｉ ｍ 的 ｎ 微小 隐孢子 虫 （ ｒ ｔ ｐ ｒｉｍ ｐ ｒｕ ） 有 同 等 危 害 的微 生物 Ｃ ｙ ｏ ｏｄｕ ａｖ ｍ 具 ｐ ｓ
品安 全 与 质 量控 制 。
于丰 宇 等 ： 粉 中 阪崎 肠杆 菌在 检 测及 控 制 方面 的研 究进展 奶
的分类 学和 生 物化 学 性质 、分 离和 鉴 别方 法 、 临 床 病 因学和 致病 性 、对 抗 生素 的抗 性 、污 染源 等 方 面 。 随 着 研 究 的 不 断 深 入 ， 人 们 意 识 到 Ｅ ｓ ｋｚ ｋ ａ ａ ａｉ ｉ已经 成为 一个 影 响健康 的新 因素 ，尤 其 是婴幼 Ｊ ｉ 方奶粉 中 Ｅ ａａ ａ ｉ的污染事 件 ，为 ＬＥ ￣ ｓ ｋｚ ｋｉ
美国热电：奶粉中阪崎肠杆菌检测方法比较
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结晶紫中性红胆盐琼 脂平板培养符合革兰 阴性无芽孢肠杆菌生 化特征
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培养基准备，平板培 养，菌落记数，生化 鉴定
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4-6 天 （1）无特殊设备要求 （2）方法经典可靠 （3）可直观判断细菌 活与死
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（1）检测周期长，费 时费力 （2）在结晶紫中性红 胆盐琼脂平板上，该 菌与肠杆菌科其它某 些 菌 菌 落 形 态 相 似， 可操作性差
结晶紫中性红葡萄糖琼脂 （VRBGA）平板或 显色培养基平板 胰化大豆蛋白琼脂平板
氧化酶试验，革兰氏染色 API 20E 生化鉴定试剂盒 或其他鉴定系统
辅助试验 观察黄色素产生
DžMastercycler®
realplex ᕩЏ߿᧙ 1$3 ̀
- 快速银制荧光定量 PCR 仪
报 告
升降温速度：+ 6℃ / - 4.5℃
Eppendorf 荧光定量 PCR 检测体系
1、 模板 DNA 的制备
从 EE 肉汤中分别提取 1 ml 加到 1.5 ml 无菌离心管中，8000 r/min 离心 5 min，取上清液，加入 50 µl DNA 提取液，混匀后 沸水浴 5 min，12000 r/min 离心 5 min，取上清液以待检测。
奶粉中病源微生物的分子生物学检测
前 言
随着经济的发展以及人们对先进技术掌握的逐步完善，奶粉 中病源微生物导致的安全和健康问题，引起了人们对病源微 生物检测的重视。本文以目前奶粉中最新关注的病源微生物 阪崎肠杆菌的生物学检测为例，借助 Eppendorf 高品质的 实验室仪器家族，帮您构建奶粉中病源微生物检测的分子生 物学平台。 阪崎肠杆菌（ Enterobacter sakazakii ）是人和动 物 肠道 内寄生的一种革兰氏阴性无芽孢杆菌，属肠杆菌科的一种。 该菌在一定条件下可引起人和动物致病，因此被称为条件致 病菌。 2005 年 5 月 20 日，由中国检验检疫科学研究院和天津检 验检疫局牵头完成的《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》行业标 准在京通过审定。该标准的建立为管理部门提供了更有效的 执法依据，为企业质量控制提供了有力的技术手段，对降低 婴幼儿配方奶粉的风险，保证代乳品的安全性具有十分重要 的意义。 多份研究报告表明婴儿配方奶粉是当前发现致婴儿、早产儿 脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎的主要感染渠道，故配方奶 粉中阪崎肠杆菌污染问题成为世界瞩目的焦点。
测试片法:实现乳品阪崎肠杆菌的快速检测
测试片法：实现乳品阪崎肠杆菌的快速检测
孙霞;卢新
【期刊名称】《食品安全导刊》
【年(卷),期】2009(000)002
【摘要】阪崎肠杆菌是寄生于人和动物肠道内的条件性致病菌，可导致新生儿出现脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎等疾病，具有发病急、致死率高等特点。
该菌的自然来源比较广泛，但是从多起阪崎肠杆菌引发的中毒事件中发现，婴幼儿配方奶粉是目前阪崎肠杆菌主要感染渠道。
而2002年和2003年发生的两家国际乳业巨头因产品中检出阪崎肠杆菌主动召回产品的事件则使阪崎肠杆菌成为世界瞩目的焦点。
【总页数】1页(P41)
【作者】孙霞;卢新
【作者单位】广州绿洲生化科技有限公司;广州绿洲生化科技有限公司
【正文语种】中文
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1.测试片法快速检测乳品中的菌落总数 [J], 梁春梅;喻东威;吴玉秋;刘晓川;薛志清;解鑫;赵媛;许璐;扎木则仁
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3.阪崎肠杆菌测试片快速准确保障乳品安全 [J], 孙霞;卢新
4.测试片法在金黄色葡萄球菌感染快速检测中的应用 [J], 韩善桥;赵晓航;石峰;史
成和
MP法和PCR法对阪崎肠杆菌快速检测的对比探究 [J], 颜学伟
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浅析乳制品中高危害食源性致病菌--阪崎肠杆菌的快速检测
彭年才
（西安交通大学生命科学与技术学院，生物医学分析技术及仪器研究所
中国陕西.西安710049 pnc@）
摘要：2006年国家出台的《婴幼儿配方乳粉生产许可证审查细则》中明确要求采用国际通行的“荧光PCR仪”作为出厂检验必备设备，此要求已成为乳品企业生产许可证核发的必要条件。
本文简单综述了国际通行的保证食品安全的食源菌检测标准、仪器和方法。
介绍了乳制品高危致病菌——阪崎肠杆菌的危害、检测必要性以及检测方法的历史演变。
在介绍荧光PCR技术特征的同时，重点论述了荧光PCR方法检测乳品中阪崎肠杆菌的政策要求、技术标准、实验技术、检测步骤以及实验室建设要点。
本文以具有自主知识产权的国产荧光PCR仪及试剂为例，具体介绍了阪崎肠杆菌检测过程和筛选判别实例。
关键词：食品安全、食源菌、乳品检测、阪崎肠杆菌、荧光PCR仪、快速检测
世界贸易的全球化同时也带来了食品安全风险！食品安全是全球日益关注的一个重要的公共卫生问题。
全球每年发生食源性疾病数十亿例，发达国家发生食源性疾病的概率也相当高，平均每年1/3的人群感染食源性疾病。
近年来，世界范围内屡屡发生大规模食品安全事件，如：日本上万人葡萄球菌肠毒素导致的雪印牛奶中毒、英国的疯牛病、法国的李斯特氏病毒、泰国的禽流感、比利时的二恶英事件等。
每年由数十亿例食源性疾病而导致的医疗费增加、不安全食品的召回、以及产品的销毁带来的经济损失不可估量！食品安全引起的“食物恐怖”：以食源菌或化学性、生物性、放射性等有害物质污染甚至蓄意污染食品，导致人群伤害或死亡，破坏社会经济或政局稳定的行动或危险越来越被人们所重视，如大头娃娃和毒饺子事件，无一不给我们敲响警钟。
其中食源菌污染是导致以上事件的主要原因，因此制定食源菌检测标准、采用国际通行的检测仪器以及研制和使用具有自主知识产权的国际通行检测仪器是被学界、政府、企业界和人民群众公认为目前的当务之急。
本文就乳制品中高危害致病菌——阪崎肠杆菌的检测做一些简要的分析。
1.阪崎肠杆菌的危害及检测的必要性
阪崎肠杆菌是奶粉(乳)制品中新发现的一种致病菌，可以引发婴儿、早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎散发和暴发。
研究报告表明婴幼儿配方奶粉是主要感染渠道,由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达40％～80%，已引起世界多国的重视。
阪崎肠杆菌已引起世界多国相关部门的重视。
据报道,国外乳业巨头曾因此被召回.在美国FDA2002年在本土某一些国际乳业巨头生产的婴儿配方奶粉中检出阪崎肠杆菌后，2003年又一家国际乳业巨头公司主动召回在美国生产的一批检出极微量阪崎肠杆菌的罐装早产儿特殊配方奶粉，阪崎肠杆菌从此成为世界瞩目的焦点。
但是几年前国内企业鲜有自查能力,原因是国内以前还没有专门的检测手段,而去买一套以前国内从未有过的检测设备也不是马上就可办到的。
目前,国外奶粉(乳)制品巨头就以拥有先进检测手段作为一个有力的宣传点,比如惠氏（中国）宣称保证在中国销售的每一个产品都经过了阪崎肠杆菌的检测才上市；同样宣称拥有此检测设备的企业还有美赞臣（中国）公司。
在国外发现的奶粉中的阪崎肠杆菌并非有其特定的区域局限性，中国奶粉企业又面临一项大难题。
值得庆幸的是：2005年5月20日，由中国检验检疫科学研究院和天津出入境检
验检疫局牵头完成的《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》行业标准在京通过了审定。
这项标准的出台，解决了我国检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌无标准、无检测方法的问题。
同年10月该标准被实施。
与之配套2006年出台了06版乳品企业生产许可证《关于印发食用植物油等26个食品生产许可证审查细则的通知》，其中《附件8：婴幼儿配方乳粉生产许可证审查细则(2006版)》里明确规定采用国际通行的“荧光PCR仪”为出厂检验必备设备。
另外多部国家标准明确要求用PCR方法检测阪崎肠杆菌、食品中致病菌等。
如«中华人民共和国出入境检验检疫行业标准»SN/T 1632.1—2005奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第1部分：分离与计数方法；第2部分：PCR方法；第3部分：荧光PCR方法；
SNT 1204-2003 植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法；
SNT 1635-2005 贝类中诺沃克病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法等
实时荧光定量PCR技术正是采用国际通行的检测标准，进行阪崎肠杆菌的检测。
除应用于乳品企业外，还大量应用于食品加工企业、医疗机构等。
为了打破国外先进食源菌分子检测仪器在我国的垄断地位，同时降低食品加工企业拥有该类仪器的门槛，近年来我国政府十分重视扶持具有自主知识产权的实时荧光定量PCR仪器的开发和推广工作。
据《中国乳品工业》2007年总第198期，国产实时荧光定量PCR仪已通过性能检测、，临床试验，获得了医疗器械注册证。
在多家乳品生产、食品加工、医疗机构推广应用，效果良好。
性能达到国际同类产品先进水平。
2.阪崎肠杆菌的检测方法
常用病原菌检测品种：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森式菌、单增李斯特氏菌、空肠弯曲杆菌等。
包括阪崎肠杆菌。
检测方法的历史演变：通常检测食物病原体有多种方法，如18世纪初，仅仅是通过常规尿液和血液成分检测肝病、肾病；18世纪中，体液酶的分析通过碱性磷酸酶检测肝功能；血清淀粉酶检测胰腺炎；酶类标志物检测心脏病；19世纪，放射及酶联免疫分析激素检测内分泌功能；肿瘤标志物检测癌症；蛋白标志物检测心脏病；到了20世纪，生化检测血糖等——糖尿病、心血管；生理参数——心血管病等；21世纪，应用分子生物学，通过实时定量PCR分子诊断仪实现基因诊断：食品安全、病原体及传染、肿瘤、遗传病等各种检测方法从灵敏度、特异性、抗污染、易操作性四方面比较表明，PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、抗污染能力强｛荧光PCR｝、容易操作等特点。
P CR检测方法又分为三种：荧光法、电泳法、ELISA法。
分析对比图见下表：
3.荧光PCR方法简述
PCR历史发展的三个阶段：定性PCR（电泳法）、酶免法定量PCR、实时荧光定量PCR。
实时荧光定量PCR技术比定性PCR技术发明晚将近十年，相比定性PCR，它有如下突出优点：
荧光定量PCR 反应过程实时监测、荧光定量重复性好、基因定量分析——稳定性好、荧光检测——浓度梯度试验线性范围宽、热循环升降温快速、荧光定量在对数期进行定量分析等优势。
西安天隆TL988荧光定量PCR仪曲线
4.荧光PCR实验室建设要点
由于PCR技术特别灵敏，为防止试验过程交叉污染，应根据《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》卫医发[2002]10号和《临床基因扩增检验实验室工作规范》卫检字[2002]8号相关要求，对PCR实验室进行防污染布局和管理。
PCR实验室原则上应分为四个隔开的工作区域，每一区域都应有专用的仪器设备，分别是1 试剂储存和准备区、2 标本制备区、3扩增反应混合物配制和扩增区、4扩增产物分析区。
根据管理办法规定，如果使用实时荧光定量pcr仪，各区域可适当合并，我们建议将扩增区和产物分析区合并为扩增检测区即共三个间。
5.阪崎肠杆菌荧光PCR检测步骤（以西安天隆科技有限公司生产的TL988型实时荧光定量PCR仪及阪崎肠杆菌检测荧光试剂为例）
[标本取样] 取样前消毒样品包装的开启处和取样工具。
按照“三管”增菌法，无菌称取100g，10g和1g样品各三份分别加入2L，250ml，125ml的样品稀释瓶中，加入9倍预热到45℃的灭菌水[1：10稀释]，或者将样品直接称量到装有9倍预热的45℃的灭菌水的样品稀释瓶中，振荡使样品充分混匀，36℃±1℃培养18～22h。
分别移取培养18～22h的悬液各10ml加入90ml肠杆菌增菌肉汤[EE肉汤]中，36℃±1℃培养18～22h。
[检测步骤]
试剂制备
取出反应管N支（N＝样本数＋1管阳性对照＋1管阴性对照），瞬时离心后，存于4℃备用。
DNA提取
标本处理：每瓶培养的EE肉汤分别取1ml加到1.5ml无菌离心管中，8000r/min离心5min，尽量吸弃上清液；加入50ulDNA提取液[使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取]，混匀后沸水浴10min,12000r/min离心5min,取上清液2ul做模板进行PCR反应。
PCR扩增
---加样取出备用的PCR反应管，分别加入处理后的样品上清2ul，阴阳性对照直接加2ul，瞬时离心后放入仪器样品槽进行PCR反应。
---编辑 2．1点击新建文件，输入实验文件名称2．2对应样品槽样本放置顺序设置阴、阳性对照以及未知标本，并在Name拦中设置样品名称。
2．3 换到温度设置窗口设置循环条件：如下
试验有效性判定设定阈值线高于阴性对照最高点，阳性对照的Ct值＜25，反应有效。
结果判定设定阈值线高于阴性对照最高点，检验样本Ct值小于或等于25.0时，报告阪崎肠杆菌筛选阳性；检验样本Ct值大于25.0且小于30.0时，重复一次，如果Ct值仍小于30.0，且曲线有明显的对数增长期，可报告阪崎肠杆菌筛选阳性，否则报告阪崎肠杆菌未检出；样本检验不到Ct值时，或Ct值为0时，报告阪崎肠杆菌未检出。
作者简介
彭年才：男，高级工程师，国家863计划评审专家，863计划重点项目“重大疾病检测与预警微系统”首席专家，西安生命科学与技术协会秘书长。
研究方向：病原菌快速检测、生命科学仪器。