沉降菌测试方法
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2、硫乙醇酸盐流体培养基（细菌），根据试验实际用量取若干培养基和蒸馏水，煮沸，摇匀，分装至适宜的容器中，瓶塞封口，灭菌。硫乙醇酸盐流体培养基置33℃培养48小时，应无菌生长。
改良马丁培养基（真菌），根据试验实际用量取若干培养基和蒸馏水，煮沸，摇匀，分装，灭菌。改良马丁培养基置24℃培养72小时，应无菌生长。
人员进出洁净生产区的一般程序：
进
出
人员进出无菌操作洁净生产区程序：
进
出
无菌医疗器具洁净室环境要求及监测：
监测项目技术指标监测方法监测频次
100级10000级100000级300000级
温度（℃）18℃—28℃1次/班
相对湿度% 45~65 1次/班
水平层流
风速m/s≥0.4——————JC
垂直层流1次/月
≥0.3
换气次数——≥20 ≥15 ≥12 1次/月
静压差Pa 不同级别洁净室及洁净室与非洁净室之间≥5
洁净室与室外大气≥10 1次/月
沉降菌数 ≤1 ≤3 ≤10 ≤15 GB/T16294-1996 1次/周
附录C（资料性附录）洁净室（区）沉降菌技术要求
洁净室（区）沉降菌技术要求
洁净度
级别
澳大利亚TGA
沉降菌测试方法
1、把ф90mm×15mm硼硅酸玻璃培养皿包在报纸里，放入恒温烤箱中加热至180℃后，干烤2小时。
2、取X克培养基放入X克蒸馏水，放入高压消毒锅中加热溶化，冷至45℃时，在无菌操作要求下将培养基注入培养皿，每皿约15ml。
3、待琼脂凝固后，将培养基平皿倒置于33℃恒温培养箱中培养48小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可采样用。制备好培养皿宜在2—8℃环境中保存。
4、操作时，应用适当的消毒液对供试品表面或外包装擦拭消毒后，以无菌方法取内容物。取供试品3只接种于足以浸没供试品的适量培养基中。一只瓣膜接种于硫乙醇酸盐流体培养基中，轻轻摇动，使瓣膜与培养基混合，1支试管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液1ml,作阳性对照，1支作空白对照。另取2只瓣膜接种于改良马丁培养基中，2支试管作空白对照。硫乙醇酸盐流体培养基置33℃培养，改良马丁置24℃培养阳性对照管培养48小时后应有菌生长。
把细菌内毒素检查水4支外表擦净打开，倒入烧杯中，用移液管取25.8ml倒入装3只瓣膜烧杯中，用锡纸封口，放进提前打开升温至37℃恒温培养箱中，培养1.5小时。供试液贮存应不超过2小时。
注：V-浸提介质体积，单位为毫升（ml）
L-产品细菌内毒素限值，单位为细菌内毒素单位每毫升（EV/ml）
CGMP
(2002年ຫໍສະໝຸດ Baidu月16日)
欧盟EU CGMP
附录l
(2008年2月)
美国FDA
CGMP
（2004年9月）
药品生产质量管理规范
（1998修订）
φ90mm
CFU/4ha
φ90mm
CFU/4ha
φ90mm
CFU/4ha
沉降菌/皿，0.5h
100
A级
＜1
A级
＜1
＜1
≤1
-
B级
≤5
B级
≤5
≤3（1000级）
6、沉降菌测试前，被测洁净室已消毒。被测洁净室温湿度须达到规定要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内，测试状态有静态和动态两种，测试状态选择须符合生产要求，并在报告中注明测试状态。
7、测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别工作服，静态测试时，室内测试人员不得多于2人。测试时间对单向流100级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min后开始，对非单向流，100000级以上净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。
-
10000
C级
≤50
C级
≤50
≤5
≤3
100000
D级
≤100
D级
≤100
≤50
≤10
为培养皿暴露时间不超过4h，以平均菌落数表示。
无菌检查法试验步骤
无菌检查在洁净度100级单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。
1、器具灭菌：培养皿若干个（报纸所好）、试管、剪刀、镊子等装入盒中置电热干燥箱内180℃，2小时。
4、采样时，一般在100级层流罩中放置3个培养皿，在100000级，10000级按面积大小一般放2个培养皿。打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5小时，再将培养皿盖上后倒置于恒温培养箱33℃培养，时间不小于48小时，采样点位置离地0.8m—1.5m左右。
5、将培养皿举起用肉眼直接计数，用记号笔点记然后用5—10倍放大镜检查是否遗漏，若培养皿上有2个或2个以上菌落重叠，分辨时仍以2个或2个以上菌落计数，不要漏计培养皿边缘生长菌落，并注意细菌菌落与培养基沉淀物区别。
营养琼脂根据实际用量按一皿装15ml，分装几个皿来计算，灭菌。
0.9%氯化钠分装至7支试管，封口，灭菌。
3、把金黄色葡萄球菌用接种环刮一下，放入0.9%氯化钠试管中摇匀，作10倍系列稀释至10-7，然后从10-5、10-6、10-7试管各抽取1ml，分别放入标号5#、6#、7#培养皿里，倒入营养琼脂摇匀，（营养琼脂不能太烫，以不烫手为准）待营养琼脂冷却后倒置放入33℃培养箱中培养48小时，48小时中取出观察计数，根据菌落数小于100cfu来决定用几号。
5、结果判断：在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。培养14天后，若供试品管匀澄清，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并有菌生长，判供试品不符合规定。
细菌内毒素试验步骤：
1、准备工作：
移液管：0.1ml1支，1ml10支
试管：10ml×4支，试管架2个（大小）
烧杯40ml2个，锥形瓶2个
8、平均菌落数计算：M1+M2+M3
平均菌落数=
n—培养皿总数
M1—1号培养皿菌落数
M2—2号培养皿菌落数
Mn—n号培养皿菌落数
用平均菌落数判断洁净空气中微生物。洁净室内平均菌落数必须低于所选定的评定标准，（100级≤1个；10000级≤3个；100000级≤10个）。若某洁净室内平均菌落数超过标准，则必须对此区域先进行消毒，然后重新采样两次，测试结果均须合格。
试验所用器皿需经处理除去可能存在的外源性内毒素，玻璃器皿置电热干燥箱内180℃干烤至少2小时。
细菌内毒素检查水10ml×4支
细菌内毒素工作标准品1支，每安瓿含内毒素10EU
鲎试剂 0.1ml×8支
同一批号3支瓣膜
浸提介质：细菌内毒素检查水
浸提介质体积计算公式：V= =8.6（ml）
8.6×3=25.8（ml）
改良马丁培养基（真菌），根据试验实际用量取若干培养基和蒸馏水，煮沸，摇匀，分装，灭菌。改良马丁培养基置24℃培养72小时，应无菌生长。
人员进出洁净生产区的一般程序：
进
出
人员进出无菌操作洁净生产区程序：
进
出
无菌医疗器具洁净室环境要求及监测：
监测项目技术指标监测方法监测频次
100级10000级100000级300000级
温度（℃）18℃—28℃1次/班
相对湿度% 45~65 1次/班
水平层流
风速m/s≥0.4——————JC
垂直层流1次/月
≥0.3
换气次数——≥20 ≥15 ≥12 1次/月
静压差Pa 不同级别洁净室及洁净室与非洁净室之间≥5
洁净室与室外大气≥10 1次/月
沉降菌数 ≤1 ≤3 ≤10 ≤15 GB/T16294-1996 1次/周
附录C（资料性附录）洁净室（区）沉降菌技术要求
洁净室（区）沉降菌技术要求
洁净度
级别
澳大利亚TGA
沉降菌测试方法
1、把ф90mm×15mm硼硅酸玻璃培养皿包在报纸里，放入恒温烤箱中加热至180℃后，干烤2小时。
2、取X克培养基放入X克蒸馏水，放入高压消毒锅中加热溶化，冷至45℃时，在无菌操作要求下将培养基注入培养皿，每皿约15ml。
3、待琼脂凝固后，将培养基平皿倒置于33℃恒温培养箱中培养48小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可采样用。制备好培养皿宜在2—8℃环境中保存。
4、操作时，应用适当的消毒液对供试品表面或外包装擦拭消毒后，以无菌方法取内容物。取供试品3只接种于足以浸没供试品的适量培养基中。一只瓣膜接种于硫乙醇酸盐流体培养基中，轻轻摇动，使瓣膜与培养基混合，1支试管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液1ml,作阳性对照，1支作空白对照。另取2只瓣膜接种于改良马丁培养基中，2支试管作空白对照。硫乙醇酸盐流体培养基置33℃培养，改良马丁置24℃培养阳性对照管培养48小时后应有菌生长。
把细菌内毒素检查水4支外表擦净打开，倒入烧杯中，用移液管取25.8ml倒入装3只瓣膜烧杯中，用锡纸封口，放进提前打开升温至37℃恒温培养箱中，培养1.5小时。供试液贮存应不超过2小时。
注：V-浸提介质体积，单位为毫升（ml）
L-产品细菌内毒素限值，单位为细菌内毒素单位每毫升（EV/ml）
CGMP
(2002年ຫໍສະໝຸດ Baidu月16日)
欧盟EU CGMP
附录l
(2008年2月)
美国FDA
CGMP
（2004年9月）
药品生产质量管理规范
（1998修订）
φ90mm
CFU/4ha
φ90mm
CFU/4ha
φ90mm
CFU/4ha
沉降菌/皿，0.5h
100
A级
＜1
A级
＜1
＜1
≤1
-
B级
≤5
B级
≤5
≤3（1000级）
6、沉降菌测试前，被测洁净室已消毒。被测洁净室温湿度须达到规定要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内，测试状态有静态和动态两种，测试状态选择须符合生产要求，并在报告中注明测试状态。
7、测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别工作服，静态测试时，室内测试人员不得多于2人。测试时间对单向流100级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min后开始，对非单向流，100000级以上净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。
-
10000
C级
≤50
C级
≤50
≤5
≤3
100000
D级
≤100
D级
≤100
≤50
≤10
为培养皿暴露时间不超过4h，以平均菌落数表示。
无菌检查法试验步骤
无菌检查在洁净度100级单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。
1、器具灭菌：培养皿若干个（报纸所好）、试管、剪刀、镊子等装入盒中置电热干燥箱内180℃，2小时。
4、采样时，一般在100级层流罩中放置3个培养皿，在100000级，10000级按面积大小一般放2个培养皿。打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5小时，再将培养皿盖上后倒置于恒温培养箱33℃培养，时间不小于48小时，采样点位置离地0.8m—1.5m左右。
5、将培养皿举起用肉眼直接计数，用记号笔点记然后用5—10倍放大镜检查是否遗漏，若培养皿上有2个或2个以上菌落重叠，分辨时仍以2个或2个以上菌落计数，不要漏计培养皿边缘生长菌落，并注意细菌菌落与培养基沉淀物区别。
营养琼脂根据实际用量按一皿装15ml，分装几个皿来计算，灭菌。
0.9%氯化钠分装至7支试管，封口，灭菌。
3、把金黄色葡萄球菌用接种环刮一下，放入0.9%氯化钠试管中摇匀，作10倍系列稀释至10-7，然后从10-5、10-6、10-7试管各抽取1ml，分别放入标号5#、6#、7#培养皿里，倒入营养琼脂摇匀，（营养琼脂不能太烫，以不烫手为准）待营养琼脂冷却后倒置放入33℃培养箱中培养48小时，48小时中取出观察计数，根据菌落数小于100cfu来决定用几号。
5、结果判断：在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。培养14天后，若供试品管匀澄清，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并有菌生长，判供试品不符合规定。
细菌内毒素试验步骤：
1、准备工作：
移液管：0.1ml1支，1ml10支
试管：10ml×4支，试管架2个（大小）
烧杯40ml2个，锥形瓶2个
8、平均菌落数计算：M1+M2+M3
平均菌落数=
n—培养皿总数
M1—1号培养皿菌落数
M2—2号培养皿菌落数
Mn—n号培养皿菌落数
用平均菌落数判断洁净空气中微生物。洁净室内平均菌落数必须低于所选定的评定标准，（100级≤1个；10000级≤3个；100000级≤10个）。若某洁净室内平均菌落数超过标准，则必须对此区域先进行消毒，然后重新采样两次，测试结果均须合格。
试验所用器皿需经处理除去可能存在的外源性内毒素，玻璃器皿置电热干燥箱内180℃干烤至少2小时。
细菌内毒素检查水10ml×4支
细菌内毒素工作标准品1支，每安瓿含内毒素10EU
鲎试剂 0.1ml×8支
同一批号3支瓣膜
浸提介质：细菌内毒素检查水
浸提介质体积计算公式：V= =8.6（ml）
8.6×3=25.8（ml）