PEG法诱导鸡血细胞融合课件
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实验十一 鸡血细胞融合
实验十一 鸡血细胞融合
1
实验目的
掌握细胞融合原理 应用聚乙二醇（PEG）融合细胞的方法 细胞融合率的计算。
2
实验用仪器及材料
实验仪器及材料
一、材料 鸡红细胞 二、器材和仪器：显微镜、离心机、水浴箱、 刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片 三、试剂 50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)
3
实验原理
细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理 的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人 工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于 它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融 合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。 细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的 重要手段。 细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)、电脉冲和激光诱导。 目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。 PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极 性基团发生结构重排。
6
数据记录
结果观察 在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜 融合在一起，形成一个异核体细胞。 融合的各个阶段：部分融合、全部融合 要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。 融合率的计算 在高倍镜下随机计数100个细胞(包括融合的与未融合的 细胞)，以融合细胞(含两个或两个以上的细胞核的细胞) 的细胞核数除以总细胞核数(包括融合与未融合的细胞核) 即得出融合率。公式如下：
7Leabharlann 业在显微镜下按顺序绘制所观察到的细胞融 合各阶段，并注明主要特点。 你测定的细胞融合率为多少?
1
实验目的
掌握细胞融合原理 应用聚乙二醇（PEG）融合细胞的方法 细胞融合率的计算。
2
实验用仪器及材料
实验仪器及材料
一、材料 鸡红细胞 二、器材和仪器：显微镜、离心机、水浴箱、 刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片 三、试剂 50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)
3
实验原理
细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理 的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人 工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于 它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融 合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。 细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的 重要手段。 细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)、电脉冲和激光诱导。 目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。 PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极 性基团发生结构重排。
6
数据记录
结果观察 在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜 融合在一起，形成一个异核体细胞。 融合的各个阶段：部分融合、全部融合 要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。 融合率的计算 在高倍镜下随机计数100个细胞(包括融合的与未融合的 细胞)，以融合细胞(含两个或两个以上的细胞核的细胞) 的细胞核数除以总细胞核数(包括融合与未融合的细胞核) 即得出融合率。公式如下：
7Leabharlann 业在显微镜下按顺序绘制所观察到的细胞融 合各阶段，并注明主要特点。 你测定的细胞融合率为多少?
鸡血细胞的体外融合
詹纳斯绿染液
方法与步骤
鸡血细胞储备液的制备
取鸡血，加入肝素（100U/5mL全血）制 成抗凝全血。再加入4倍体积0.85 %NaCl 溶液，制成红细胞储备液，保存于4℃。 取鸡血细胞储备液1mL，加入4mL 0.85 %NaCl溶液，混匀后，1500rpm离心 5min，弃上清，用5mL 0.85 %NaCl溶液 重悬浮沉淀，重复离心操作1次。
制备细胞悬液
方法与步骤
染色和镜检
吸取细胞悬液，在凹面载玻片上滴一滴， 加入詹纳斯绿染液混匀，染色3min后盖上 盖玻片，在显微镜下观察细胞融合情况。
计算细胞融合率
细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生 融合细胞的细胞核总数与该视野内所有细胞 的细胞核总总数之比，通常以百分数表示。
融合率 =
细胞融合操作 离心洗涤：
取(1:4)鸡血悬液lml加0.85％生理盐水至５m1，混匀。
1500rpm,5min，弃上清
(重复1次)
加10ml GKN溶液,混匀,计数。 取1ml鸡血细胞悬液，用4m1 Hanks溶液 混匀，1000rpm,5min，弃上清。
水浴 缓慢逐滴加0.5ml的50%PEG至悬液,边加边混匀。
实验原理
实验原理
依据融合过程采用的助融剂不同，细胞 融合可分为：
病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒 （HVJ）； 化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇 （PEG）； 电场诱导的细胞融合； 激光诱导的细胞融合
实验原理
PEG是乙二醇的多聚化合物，可改变各 类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂 类分子发生疏散和重组，诱导产生细胞 融合。 商品PEG存在一系列不同分子质量的多 聚体，一般应用PEG4000~6000的溶液， 能够产生高频率的细胞融合。
PEG法诱导细胞融合
实验十PEG法诱导细胞融合一、实验目的1.了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合的基本原理。
2.通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。
二、实验原理细胞融合（cell fusion）又称体细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞（hybrid cell）。
细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。
依据融合过程采用的助融剂的不同，细胞融合可分为：①病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒(hemagglutinating virus of Japan,HVJ);②化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇（polyethyleneglycol ,PEG）;③电场诱导的细胞融合；④激光诱导的细胞融合。
PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。
PEG可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。
该方法应用相对分子质量为400~6000的PEG溶液引起细胞的聚集和粘连，产生高频率的细胞融合。
融合的频率和活力与所用PEG分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。
三、实验仪器、材料和试剂（１）仪器、用具：注射器、刻度离心管、离心机、血细胞记数板、水浴锅、滴管、显微镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、酒精灯等。
（２）材料：成年家鸡。
（３）试剂1）0.85%NaCl溶液。
2）GKN液：8.0gNaCl，0.4g KCl,1.77 g Na2HPO4·2H2O，0.69 g NaH2PO4·H2O,2.0g葡萄糖,0.01g酚红,溶于1000ml重蒸水中。
3）50%（m/v）PEG溶液：①取50gPEG （相对分子量=4 000）放入100ml瓶中，高压灭菌20min.②让PEG 冷却至50-60℃，勿让其凝固。
#实验8 PEG法诱导鸡血细胞融合
观察时注意不同程 度的融合现象。 度的融合现象。通常分 为五个阶段: 为五个阶段: 两细胞膜接触，粘连; ①两细胞膜接触，粘连; 细胞膜形成穿孔； ②细胞膜形成穿孔； 两细胞的细胞质连通; ③两细胞的细胞质连通; ④通道扩大，两细胞连 通道扩大， 成一体； 成一体； 细胞完全合并， ⑤细胞完全合并，形成 一个含有两个或多个核 的圆形细胞。 的圆形细胞。
8、染色和镜检 、 吸取细胞悬液，在凹面玻片上滴一滴， 吸取细胞悬液，在凹面玻片上滴一滴，加入詹纳斯绿染 液混匀，染色3min后盖上盖玻片，在显微镜下进行观察细 后盖上盖玻片， 液混匀，染色 后盖上盖玻片 融合情况。 胞融合情况。 9、 9、计算细胞融合率 细胞融合率是指在显微镜的视野内， 细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞其 细胞核总数与该视野内所有细胞（包括已融合细胞） 细胞核总数与该视野内所有细胞（包括已融合细胞）的细胞 核总数之比，通常以百分比表示，而且要进行多个视野测定, 核总数之比，通常以百分比表示，而且要进行多个视野测定 再加以平均统计，更为准确。 再加以平均统计，更为准确。
四、方法与步骤
（一）鸡血细胞的体外融合
1.鸡血细胞的获得 1.鸡血细胞的获得 用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血， 用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血， 注入试管后，速加入肝素（100U肝素/5ml全血 混合， 肝素/5ml全血） 注入试管后，速加入肝素（100U肝素/5ml全血）混合，制 成抗凝全血。 成抗凝全血。 2.鸡血细胞储备液的制备 2.鸡血细胞储备液的制备 在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85%NaCl溶液， 0.85%NaCl溶液 在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85%NaCl溶液，制 成红细胞储备液，置于4℃冰箱内可供一周内使用。 4℃冰箱内可供一周内使用 成红细胞储备液，置于4℃冰箱内可供一周内使用。 3、鸡血细胞悬液的制备及稀释 取细胞悬液1mL 1mL， 4mL0.85%NaCl溶液混匀 溶液混匀， 取细胞悬液1mL，加4mL0.85%NaCl溶液混匀，1200r/min 离心5min 弃上清液，再加入5ml 0.85%NaCl溶液按上述条 5min， 离心5min，弃上清液，再加入5ml 0.85%NaCl溶液按上述条 最后，弃去上清液，加入10ml GKN溶液 10ml的 溶液， 件离心一次。最后，弃去上清液，加入10ml的GKN溶液，制 成鸡血细胞悬液。吸取0.5ml鸡血细胞悬液，加入4.5ml 0.5ml鸡血细胞悬液 4.5ml的 成鸡血细胞悬液。吸取0.5ml鸡血细胞悬液，加入4.5ml的 GKN液进行稀释 液进行稀释。 GKN液合
鸡血细胞的体外融合
水浴2min
加入Hanks溶液至5m1，混匀。
水浴5min
1000rpm，5min，弃上 清
加入Hanks溶液至5m1，混匀，1000rpm，5min。
实验原理
实验仪器、用具
注射器 滴管 烧杯 容量瓶 凹面载玻片 盖玻片
离心机 水浴锅 显微镜 细胞计数板 酒精灯 刻度离心管
试剂
Hanks原液（10×）
NaCl2 Na2HPO4· 12H2O KCl KH2PO4 MgSO4· 7H2O 葡萄糖 CaCl2
视野内融合细胞的核数/视野内细胞的总核数×100％
测定时要进行多个视野计数，并进行统计分 析。
注意事项
温度、融合时间、PEG的浓度与作用时 间、细胞密度、机械力等因素均影响融 合率，实验操作时应予以注意，并在需 要的时候及时镜检。
作业
画出观察到的融合细胞，并计算融合率。
思考题
根据自己的实验结果，分析在实验过程 中影响融合率的主要步骤。 Ca2+在实验中起什么作用?
细胞融合操作 离心洗涤：
取(1:4)鸡血悬液lml加0.85％生理盐水至５m1，混匀。
1500rpm,5min，弃上清
(重复1次)
加10ml GKN溶液,混匀,计数。 取1ml鸡血细胞悬液，用4m1 Hanks溶液 混匀，1000rpm,5min，弃上清。
水浴 缓慢逐滴加0.5ml的50%PEG至悬液,边加边混匀。
詹纳斯绿染液
方法与步骤
鸡血细胞储备液的制备
取鸡血，加入肝素（100U/5mL全血）制 成抗凝全血。再加入4倍体积0.85 %NaCl 溶液，制成红细胞储备液，保存于4℃。 取鸡血细胞储备液1mL，加入4mL 0.85 %NaCl溶液，混匀后，1500rpm离心 5min，弃上清，用5mL 0.85 %NaCl溶液 重悬浮沉淀，重复离心操作1次。
加入Hanks溶液至5m1，混匀。
水浴5min
1000rpm，5min，弃上 清
加入Hanks溶液至5m1，混匀，1000rpm，5min。
实验原理
实验仪器、用具
注射器 滴管 烧杯 容量瓶 凹面载玻片 盖玻片
离心机 水浴锅 显微镜 细胞计数板 酒精灯 刻度离心管
试剂
Hanks原液（10×）
NaCl2 Na2HPO4· 12H2O KCl KH2PO4 MgSO4· 7H2O 葡萄糖 CaCl2
视野内融合细胞的核数/视野内细胞的总核数×100％
测定时要进行多个视野计数，并进行统计分 析。
注意事项
温度、融合时间、PEG的浓度与作用时 间、细胞密度、机械力等因素均影响融 合率，实验操作时应予以注意，并在需 要的时候及时镜检。
作业
画出观察到的融合细胞，并计算融合率。
思考题
根据自己的实验结果，分析在实验过程 中影响融合率的主要步骤。 Ca2+在实验中起什么作用?
细胞融合操作 离心洗涤：
取(1:4)鸡血悬液lml加0.85％生理盐水至５m1，混匀。
1500rpm,5min，弃上清
(重复1次)
加10ml GKN溶液,混匀,计数。 取1ml鸡血细胞悬液，用4m1 Hanks溶液 混匀，1000rpm,5min，弃上清。
水浴 缓慢逐滴加0.5ml的50%PEG至悬液,边加边混匀。
詹纳斯绿染液
方法与步骤
鸡血细胞储备液的制备
取鸡血，加入肝素（100U/5mL全血）制 成抗凝全血。再加入4倍体积0.85 %NaCl 溶液，制成红细胞储备液，保存于4℃。 取鸡血细胞储备液1mL，加入4mL 0.85 %NaCl溶液，混匀后，1500rpm离心 5min，弃上清，用5mL 0.85 %NaCl溶液 重悬浮沉淀，重复离心操作1次。
细胞生物学实验报告-鸡红细胞的融合教学幻灯片
八、绘图
2020/4/21
（3）取上稀释悬液1ml，加5ml0.85%生理盐水混 匀
2020/4/21
（4）1000rpm离心上述溶液5min，去上清液，重 复操作3次
（5）第三次离心去上清液后，加GKN 0.5ml 制成10%悬液，放在37℃水浴箱预热2~3min
（6）逐滴0.25ml的50%的PEG溶液，边加边 摇匀，37℃恒温静置15min
2、数据处理：由上表原始数据得视野内发生融合的 细胞核数为12个，视野内所有细胞核总数为105 个，由公式：
融合率=视野内发生融合的细胞核数/视野内所有细
胞核数× 100% =12/105 ×100% =11.4%
3、实验结果：鸡红细胞的融合率为11.4%
2020/4/21Fra bibliotek七、结果分析及讨论
2020/4/21
（7）取上述液一滴，盖上盖玻片，镜检
2020/4/21
五、数据记录及处理
观察四个视野中的细胞，记录鸡血细胞融合情况如下表所 示
视野细胞核 视野内融合
总数
细胞核数
2核细胞
3核细胞 所有细胞核 所有融合细
总数
胞核总数
1 30
4
2
0
2 26
3
0
1
105 12
3 28
2
1
0
4 31
3
0
1
2020/4/21
鸡红细胞的融合
实验报告
主要内容
1
实验目的
2
实验用品
3
实验原理
4
需要实注验意步的问骤题
5 数据记录及处理 6 结果分析及讨论
7
绘图
聚乙二醇诱导鸡红细胞融合条件的优化_仇燕
中图分类号： Q813． 2 文献标识码： A doi： 10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2011． 03． 074
Optimal Condition of PEG － Induced Chicken Red Blood Cells Fusion
QIU Yan，LI Zhao － wei，MIAO Fang
2011 年 21（ 3）
生物技术
51
（ College of Biological Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China）
Abstract： Objective： To find the optimal condition of chicken red blood cells fusion with PEG （ Mw = 4000） as the revulsant． Method： The effects of different cell density，fusion temperature，PEG concentration and reaction time on cell fusion rate were studied． Three factors and three levels of orthogonal test were designed to attain the best cell fusion condition． Result： The most appropriate condition for cell fusion was cell density 2 × 106 / ml，35% PEG，35 centigrade and 40min． Conclusion： Under this condition，the highest cell fusion rate reached 33． 06% ． Key words： cell fusion； chicken red blood cells； PEG
Optimal Condition of PEG － Induced Chicken Red Blood Cells Fusion
QIU Yan，LI Zhao － wei，MIAO Fang
2011 年 21（ 3）
生物技术
51
（ College of Biological Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China）
Abstract： Objective： To find the optimal condition of chicken red blood cells fusion with PEG （ Mw = 4000） as the revulsant． Method： The effects of different cell density，fusion temperature，PEG concentration and reaction time on cell fusion rate were studied． Three factors and three levels of orthogonal test were designed to attain the best cell fusion condition． Result： The most appropriate condition for cell fusion was cell density 2 × 106 / ml，35% PEG，35 centigrade and 40min． Conclusion： Under this condition，the highest cell fusion rate reached 33． 06% ． Key words： cell fusion； chicken red blood cells； PEG
实验4.鸡血细胞的融合
[实验原理 实验原理] 实验原理
PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量 的多聚体。PEG可与水分子借氢键结合,在高浓度(50 ％)的PEG溶液中自由水消失，导致细胞脱水而发生质 膜结构的变化，引起细胞融合。为了发挥PEG促进细 胞融合的效力，必须采用较高浓度的PEG溶液，但在 高浓度PEG溶液下，细胞可能因脱水而受到显著的破 坏。因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是 PEG融合技术的关键。 本实验材料为鸡红细胞，其核结构紧密，易于观察。
(2)水浴 (2)水浴
加GKN溶液至0.5m1,混匀,
39度 水浴5min 缓慢逐滴加0.25ml的50%PEG至悬液,边加边混匀, 水浴15min 加入GKN溶液至4m1, 混匀, 水浴10min 3000rpm/min,1min,弃上清
加入GKN溶液至4m1, 混匀, 3000rpm/min,1min,
(3)观察: (3)观察: 观察
弃去上清液，加入GKN溶液至1ml，混匀。 取1滴悬液滴于载玻片上，加入Janus green 染液1滴，用牙签搅匀，8min后盖上盖玻片， 观察细胞融合情况
[作业 作业] 作业 绘制显示所观察到的细胞融合情况图 [思考题 思考题] 思考题 1．细胞融合率受哪些因素的影响 ．细胞融合率受哪些因素的影响? 2．在进行细胞融合时，要注意那些问题 ．在进行细胞融合时，要注意那些问题? 注意事项 1、PEG应保持预热状态 、 应保持预热状态 2 PEG应沿管壁不同方向滴入 应沿管壁不同方向滴入
[内容与方法 内容与方法] 内容与方法
内容： 内容： 鸡血细胞的融合
方法： 方法：
(1)离心洗涤 (1)离心洗涤：
取 (1:4)鸡血悬液1 ml加0.85％生理盐水至 4m1,混 匀 000rpm/min,1min。
实验十一鸡血细胞融合PPT课件
细胞形态比较
比较不同处理组之间的细胞形态差异，分析诱导因素对 细胞形态的影响。
诱导因素对细胞融合的影响
诱导因素分析
分析不同诱导因素对细胞融合的作用，如化 学物质、物理因素等。
诱导因素比较
比较不同诱导因素对细胞融合的影响程度， 确定最佳诱导条件。
05 实验总结与展望
实验总结
实验原理
鸡血细胞融合实验涉及细胞生物学、 遗传学和分子生物学等多个领域，通 过实验，我们深入了解了细胞融合的 过程和机制。
疾病治疗
通过细胞融合技术可以制备具有 特定功能的细胞系，用于治疗某 些遗传性疾病、肿瘤和免疫系统
疾病等。
药物研发
利用细胞融合技术可以制备具有特 定功能的细胞系，用于药物筛选和 药效研究，有助于发现新的药物和 治疗方案。
生物材料
通过细胞融合技术可以制备具有特 定功能的生物材料，如人工皮肤、 骨骼和器官等，用于医学和生物工 程领域。
细胞融合的诱导和检测
诱导细胞融合
将分离出的细胞用细胞融合诱导剂处 理，诱导细胞融合。
检测细胞融合
使用荧光染料或免疫学方法检测细胞 融合的情况，观察融合细胞的形态和 数量。
细胞融合的鉴定和观察
鉴定细胞融合
通过检测细胞膜的连续性和荧光染料的 分布情况，鉴定细胞是否融合成功。
VS
观察融合细胞
在显微镜下观察融合细胞的形态、生长情 况及功能表现，记录相关数据。
实验十一鸡血细胞融 合ppt课件
目录
CONTENTS
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果分析 •胞融合的过程
鸡血细胞融合是指将两个或多个鸡血细胞通过特定手段融合成一个细胞的过程。 这个过程涉及到细胞膜的改变和细胞内物质的交换，是研究细胞结构和功能的重 要手段。
实验十-PEG法诱导鸡血细胞融合
称取.4g的CaCl2，融于30-50ml的重蒸水中。取 1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先放重蒸水800ml于烧 杯中，然后按上述配方顺序，逐一称取药品。必须在前 一药品完全溶解后，方可加入下一药品，直到葡萄糖完 全溶解后，再将已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水至 1000ml。
（6）Hanks液：Hanks原液100 ml，加重蒸水896 ml，
5、染色和镜检 吸取细胞悬液，在凹面玻片上滴一滴，加入詹纳斯绿染液 混匀，染色5min后盖上盖玻片，在显微镜下进行观察细胞 融合情况。
观察时注意不同程度的融合现象。通常分为五 个阶段。①两细胞膜接触，粘连；②细胞膜形成穿 孔；③两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞 连成一体；⑤细胞完全合并，形成一个含有两个或 多个核的圆形细胞。
6．计算细胞融合率
细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合 的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞（包括已 融合细胞）的细胞核总数之比，通常以百分比表示， 而且要进行多个视野测定，再加以平均统计，更为 准确。
细胞融合过程在形态上的变化
五、实验结果
六、注意事项
1.高压灭菌过的PEG 冷却至50-60℃时就加入 预热至50℃的GKN 液，勿让其凝固。
二、实验原理
细胞融合（cell fusion）又称体细胞杂交，是指 用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核 体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩 溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含 有一个细胞核的杂种细胞（hybrid cell）。
细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免 疫、病毒和肿瘤的重要手段。依据融合过程采用的 助融剂的不同，细胞融合可分为：病毒诱导的细胞 融合，如仙台病毒(hemagglutinating virus of Japan,HVJ);化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二 醇（polyethyleneglycol ,PEG）;电场诱导的细胞 融合；激光诱导的细胞融合。
生物药物综合实验---细胞融合实验PPT
仪器： 仪器：离心机、显微镜、血球计数器计数等
实验方法及步骤
1.鸡血细胞悬液的制备 1.鸡血细胞悬液的制备 ）．在公鸡翼下静脉抽取 ml鸡血 加入盛有8 ml的 在公鸡翼下静脉抽取2 鸡血， （1）．在公鸡翼下静脉抽取2 ml鸡血，加入盛有8 ml的 Alsver液中 使血液与Alsver液的比例达1 液中， Alsver液的比例达 Alsver液中，使血液与Alsver液的比例达1：4，混均后可 在冰箱中存放一周。 在冰箱中存放一周。 ）．取此贮存鸡血1ml加入 取此贮存鸡血1ml加入4ml 0.85%生理盐水 生理盐水， （2）．取此贮存鸡血1ml加入4ml 0.85%生理盐水，充分 混均，800rpm离心3min，弃去上清， 离心3min 混均，800rpm离心3min，弃去上清，重复上述条件离心两 最后弃去上清， GKN液4ml，离去。 次。最后弃去上清，加GKN液4ml，离去。 ）．弃去上清 弃去上清， 10mlGKN液 制成10%细胞悬液。 10%细胞悬液 （3）．弃去上清，加10mlGKN液，制成10%细胞悬液。 ）．取上述细胞悬液以血球计数器计数 取上述细胞悬液以血球计数器计数， GKN液将其 （4）．取上述细胞悬液以血球计数器计数，用GKN液将其 调整为1 ml。 调整为1×106个/ ml。 ）．用GKN液将其调整的细胞悬液备用 液将其调整的细胞悬液备用。 （5）．用GKN液将其调整的细胞悬液备用。
实验方法及步骤
ml的Alsver液 取8 ml的Alsver液 ml鸡血 加2 ml鸡血 振摇, 振摇,混合均匀
取1ml 0.85%生理盐水 加4ml 0.85%生理盐水 离心 800r/min 3min 重复离心两次 GKN液细胞悬液备用 10ml GKN液细胞悬液备用
吸取1ml细胞悬液，加入4ml ks液混匀 吸取1ml细胞悬液，加入4ml GKN ks液混匀 1ml细胞悬液 1000rpm,5min，弃上清。 1000rpm,5min，弃上清。 沉淀，轻弹离心管使沉淀团块松散。 沉淀，轻弹离心管使沉淀团块松散。 39 ℃水浴 50%PEG溶液 溶液， 取0.5ml 50%PEG溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴加入 39 ℃水浴 GKN液 轻轻吹打混匀。 加5ml GKN液，轻轻吹打混匀。 39 ℃水浴 1000rpm,5min，弃上清。 1000rpm,5min，弃上清。 (重复2次) 重复2 混匀。 加0.5ml GKN 液，混匀。 染液2 取1-2滴，加入Janus green染液2～ 3滴。 加入Janus green染液
PEG诱导细胞融合-PPT课件
聚乙二醇（PEG）是乙二醇的多聚化合物，存在 一系列不同分子量的多聚体。PEG是一种特殊的 脱水剂，可与水借氢键结合，导致细胞脱水而发 生质膜结构的变化，使细胞相互接触部位的膜脂 双层中磷脂分子发生疏散，进而使其结构发生重 排，再加上膜脂双层的相互亲和以及彼此间表面 张力的作用，引起相邻的重排质膜在修复时相互 合并在一起，使细胞的胞质沟通，从而造成相互 接触的细胞之间发生融合。
细胞融合技术的应用
• • • • • • • • • 1.动物细胞融合技术： 遗传基因的缺陷互补 生成单克隆抗体 基因定位和绘制人类基因图谱 动物育种 核移植和克隆动物 细胞疗法 2.植物细胞融合技术 3.微生物细胞融合技术
实验注意事项：
1. 由于离心时红细胞的数量很少，吸取的时候要小 心，尽量把吸附在管壁上的红细胞都吸出来。此 外吸取的动作不能太大，否则会破坏离心形成的 分层。 2. PEG处理时间不宜过长，最多不能超过90s，否 则会有多个细胞彼此融合形成巨大的合胞体，或 者细胞膜破裂导致细胞质外泄。 3. 经PEG处理后加液混匀时应轻轻洗打，以免刚刚 融合的细胞分开。 4. 加PEG应该在37º C水浴加，这样可以防止PEG凝 固，导致离心失败。 5. 注意每次离心的时间和速度，否则得不到想要的 红细胞。
细胞融合技术
• 是指细胞通过诱导和培养，在离体条件下用人工 方法使不同种细胞发生膜融合、胞质融合和核融 合从而形成杂种细胞，使其同时具有两种细胞的 遗传和生物特性。 • 常用的人工诱导方法包括：病毒诱导法、电刺激 法、聚乙二醇诱导法。
细胞融合发展史
1. 自然发生的细胞融合 早在19 世纪人们就发现在自然条件下生 物界中有自发的细胞融合现象。Muller 1838 年在肿瘤中观察到了多核细胞此后 在由病毒感染的病料组织中如天花脓疱的 周围、受水痘损害的皮肤、在麻疹病人的 扁桃体中陆续发现多核细胞这些多核细胞 可能是病毒作用的结果：但当时还没有人 认识到这一点。1875 年Lange 首先观察 到脊椎动物蛙类血液细胞合并，继之又有 一些研究者在无脊椎动物中也发现了融合 细胞。
细胞融合技术的应用
• • • • • • • • • 1.动物细胞融合技术： 遗传基因的缺陷互补 生成单克隆抗体 基因定位和绘制人类基因图谱 动物育种 核移植和克隆动物 细胞疗法 2.植物细胞融合技术 3.微生物细胞融合技术
实验注意事项：
1. 由于离心时红细胞的数量很少，吸取的时候要小 心，尽量把吸附在管壁上的红细胞都吸出来。此 外吸取的动作不能太大，否则会破坏离心形成的 分层。 2. PEG处理时间不宜过长，最多不能超过90s，否 则会有多个细胞彼此融合形成巨大的合胞体，或 者细胞膜破裂导致细胞质外泄。 3. 经PEG处理后加液混匀时应轻轻洗打，以免刚刚 融合的细胞分开。 4. 加PEG应该在37º C水浴加，这样可以防止PEG凝 固，导致离心失败。 5. 注意每次离心的时间和速度，否则得不到想要的 红细胞。
细胞融合技术
• 是指细胞通过诱导和培养，在离体条件下用人工 方法使不同种细胞发生膜融合、胞质融合和核融 合从而形成杂种细胞，使其同时具有两种细胞的 遗传和生物特性。 • 常用的人工诱导方法包括：病毒诱导法、电刺激 法、聚乙二醇诱导法。
细胞融合发展史
1. 自然发生的细胞融合 早在19 世纪人们就发现在自然条件下生 物界中有自发的细胞融合现象。Muller 1838 年在肿瘤中观察到了多核细胞此后 在由病毒感染的病料组织中如天花脓疱的 周围、受水痘损害的皮肤、在麻疹病人的 扁桃体中陆续发现多核细胞这些多核细胞 可能是病毒作用的结果：但当时还没有人 认识到这一点。1875 年Lange 首先观察 到脊椎动物蛙类血液细胞合并，继之又有 一些研究者在无脊椎动物中也发现了融合 细胞。
实验5诱导细胞融合——聚乙二醇法幻灯片PPT
❖ 1、绘制观察到的融合细胞图，计算观察到的细胞 融合率；
❖ 2、简述聚乙二醇法诱导细胞融合的原理及影响融 合的关键因素。
六、注意事项
❖ 如抗凝血要保存在冰箱，抗凝剂预先要进行 灭菌，采血在无菌条件下进行。
❖ PEG有毒，请操作过程中勿沾到皮肤上。
❖ 50％PEG混合液配置：称取少许PEG放人刻度离心 管内，在沸水浴中加热， 使其溶化，待冷却至50℃ 时，加入预热至50℃的等体积的GKN液，混匀。注 意使用前配制。
❖ 6.取悬液1mL到7ml离心管中，加入0.5～0.8 mL 预热的50％PEG （慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边 加边轻摇离心管,使其混匀），38℃水浴中温浴 30min。
❖ 仪器：离心机，水浴
箱，电炉， 量筒，离 心管，注射器，试管， 移液管，烧杯， 吸管， 载玻片，盖玻片，显微 镜
四、实验步骤
❖ 1.鸡血红细胞悬液的制备：
❖ 用注射器吸入 1mL Alsver液后从鸡翼下静脉取鸡 血2mL，注 入刻度离心管内，按照3：1(V/V)加入 6mL Alsver液混匀，放入4℃冰箱内可保存3~4天。
实验5诱导细胞融合—— 聚乙二醇法幻灯片PPT
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一、实验目的 了解细胞融合的原理，初步掌握用PEG诱导
❖ 2.取细胞悬液1mL，移人7mL离心管， 加入4mL 0.85％生理盐水混匀；2000r/min离心5 min。
❖ 3.弃上清液（用吸管吸去），加0.85％生理 盐水至 5mL，混匀后2000r/min离心5min。
❖ 2、简述聚乙二醇法诱导细胞融合的原理及影响融 合的关键因素。
六、注意事项
❖ 如抗凝血要保存在冰箱，抗凝剂预先要进行 灭菌，采血在无菌条件下进行。
❖ PEG有毒，请操作过程中勿沾到皮肤上。
❖ 50％PEG混合液配置：称取少许PEG放人刻度离心 管内，在沸水浴中加热， 使其溶化，待冷却至50℃ 时，加入预热至50℃的等体积的GKN液，混匀。注 意使用前配制。
❖ 6.取悬液1mL到7ml离心管中，加入0.5～0.8 mL 预热的50％PEG （慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边 加边轻摇离心管,使其混匀），38℃水浴中温浴 30min。
❖ 仪器：离心机，水浴
箱，电炉， 量筒，离 心管，注射器，试管， 移液管，烧杯， 吸管， 载玻片，盖玻片，显微 镜
四、实验步骤
❖ 1.鸡血红细胞悬液的制备：
❖ 用注射器吸入 1mL Alsver液后从鸡翼下静脉取鸡 血2mL，注 入刻度离心管内，按照3：1(V/V)加入 6mL Alsver液混匀，放入4℃冰箱内可保存3~4天。
实验5诱导细胞融合—— 聚乙二醇法幻灯片PPT
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一、实验目的 了解细胞融合的原理，初步掌握用PEG诱导
❖ 2.取细胞悬液1mL，移人7mL离心管， 加入4mL 0.85％生理盐水混匀；2000r/min离心5 min。
❖ 3.弃上清液（用吸管吸去），加0.85％生理 盐水至 5mL，混匀后2000r/min离心5min。
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观察时注意不同程度的融合现象。通常分为五 个阶段。①两细胞膜接触，粘连；②细胞膜形成穿 孔；③两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞 连成一体；⑤细胞完全合并，形成一个含有两个或 多个核的圆形细胞。
6．计算细胞融合率 细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合
仪器、用具：注射器、刻度离心管、离心 机、血细胞记数板、水浴锅、滴管、显微 镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、 酒精灯等。
材料：成年家鸡。
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■ 试剂
（1）0.85%NaCl溶液: （2）GKN液：8.0gNaCl，0.4g KCl,1.77 g Na2HPO4·2H2O，
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骨髓间质充质干细胞移植后的细胞融合
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荧光标记的细胞融合
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三．实验仪器、材料和试剂
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一、实验目的
了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合 的基本原理。
通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验， 初步掌握细胞融合的基本方法。
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二、实验原理
心5min，弃上清液，再加入5ml 0.85%NaCl溶液按上述条件 离心两次（5分钟，10分钟）。最后，弃去上清液，加入 10ml的GKN溶液，制成鸡血细胞悬液。吸取0.5ml鸡血细胞 悬液，加入4.5ml的GKN液进行稀释。
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五、实验结果
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细胞融合（cell fusion）又称体细胞杂交，是指 用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核 体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩 溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含 有一个细胞核的杂种细胞（hybrid cell）。
细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免 疫、病毒和肿瘤的重要手段。依据融合过程采用的 助融剂的不同，细胞融合可分为：病毒诱导的细胞 融合，如仙台病毒(hemagglutinating virus of Japan,HVJ);化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二 醇（polyethyleneglycol ,PEG）;电场诱导的细胞 融合；激光诱导的细胞融合。
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• 聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细 胞
接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于 两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此 的表面张力作用，使细胞发生融合。
• 细胞融合的频率和活力与所用PEG分子质量、浓度、 作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。
0.69 g NaH2PO4·H2O，2.0g葡萄糖，0.01g酚红，溶于 1000ml重蒸水中。 （3）50%（m/v）PEG溶液：取50gPEG(相对分子量=4000)放 入100ml瓶中，高压灭菌20min。让PEG 冷却至50-60℃， 勿让其凝固。加入50ml预热至50℃的GKN 液，混匀，置 37℃备用。 （4） Hanks原液(10×)： NaCl 80.0g；Na2HPO4·12H2O1.2g； KCl 4.0g；KH2PO4 0.6g；MgSO4·7H2O 2.0g； 葡萄糖 10.0g；CaCl2 1.4g。
注入试管后，速加入肝素（100U肝素/5ml全血）混合，制 成抗凝全血。 2.鸡血细胞储备液的制备 在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85%NaCl溶液，制 成红细胞储备液，置于4℃冰箱内可供一周内使用。
3、鸡血细胞悬液的制备 取细胞悬液1mL，加4mL0.85%NaCl溶液混匀，1200r/min离
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称取1.4g的CaCl2，融于30-50ml的重蒸水中。取 1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先放重蒸水800ml于烧 杯中，然后按上述配方顺序，逐一称取药品。必须在前 一药品完全溶解后，方可加入下一药品，直到葡萄糖完 全溶解后，再将已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水至 1000ml。 （6）Hanks液：Hanks原液100 ml，加重蒸水896 ml，
加0.5%酚红 4 ml。配好的Hanks液，分装包扎好 贴上标签，经过灭菌后，4℃保存。 （7）詹纳斯绿染液。
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四、方法与步骤
（一）鸡血细胞的体外融合
1.鸡血细胞的获得 用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血，
的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞（包括已 融合细胞）的细胞核总数之比，通常以百分比表示， 而且要进行多个视野测定，再加以平均统计，更为 准确。
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细胞融合过程在形态上的变化
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吸取悬液1mL放入离心管中，加入4mLHanks液混匀， 1000r/min离心5min，弃上清液，再加入适量GKN液，使 成10%的悬液。 4、PEG诱导细胞融合 吸取0.5ml 37℃的50%PEG溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴 加入，边加边轻摇离心管，使PEG与细胞混匀，然后在 37℃水浴中静置5---10min。 5、染色和镜检 吸取细胞悬液，在凹面玻片上滴一滴，加入詹纳斯绿染液 混匀，染色5min后盖上盖玻片，在显微镜下进行观察细胞 融合情况。